5微生物的生长繁殖与生存因子

应用意义：
①由于此时期的菌种比较健壮，生产上用作接种的最佳 菌龄；
②发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度
③食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期
④是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观察等的良 好材料。
③. 静止期（stationary phase）
又称：稳定期、恒定期或最高生长期
特点：①新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，微生物的 生长速率处于动态平衡，培养基中的细胞数目达到最高值。
一、 细胞数目的测定
2. 测定活菌数(间接计数法) ① 载玻片薄琼脂层培养计数 ② 平板菌落计数 ③ 液体稀释培养计数 ④ 薄膜过滤计数
2. 活菌计数法(间接计数法)
平板菌落计数法 第一步：菌样巧妙稀释
1mL
混合
1mL
混合
无菌水 9mL 10mL
1 ： 10-1
10-2
10-3
10-4
菌样被
无菌水
产生原因：生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大 大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡
分批培养的应用： 序批式间歇曝气器（SBR）
(二) 连续培养(continous culture)
1. 概念：在细菌进入对数生长期时，以一定的速率不断 地补充新鲜营养物质，同时以同样的速率排除培养物 (含菌体及代谢产物)，让培养的微生物长时间地处于对 数生长期，以利于微生物的增殖速率和代谢活性处于 某种稳定状态。
◆世代时间：世代时间短，即繁殖速度较快的菌种的停滞期一 般较短
应用
◆在发酵工业上需设法尽量缩短延迟期； 采取的缩短lag phase 的措施有： ①增加接种量； （群体优势----适应性增强） ②采用对数生长期的健壮菌种； ③调整培养基的成分，在种子培养基中加入发酵培养基的 某些成分。 ④选用繁殖快的菌种 ◆在食品工业上，尽量在此期进行消毒或灭菌
2. 细菌生长曲线
以培养时间为横坐标，以计数获得的细菌数目的对 数为纵坐标，可得到一条定量描述液体培养基中微生 物生长规律的实验曲线，该曲线则称为生长曲线。 （ growth curve )。
生长曲线的制作：
接种
生适长温培曲养线的定制时取作样测
定生长量
将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液体 培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样， 测细菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌增长数目 的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。
①.停滞期（lag phase）
其它名称：迟滞期、调整期、适应期 1.现象：活菌数几乎没增加，曲线平行于横轴。 2.特点：
➢初始阶段：细菌要适应新的环境，细菌总数有所减少 ➢末期：生长繁殖速度加快，细菌总数有所增加 ➢细胞内RNA特别是rRNA含量增高，原生质嗜碱性增强 ➢合成代谢活跃(核糖体、酶类、ATP合成加快),开始细胞分裂 ➢对外界不良条件敏感,(如氯化钠浓度、温度、抗生素等化学 药物) 3.原因：适应新的环境条件，合成新的酶，积累必要的中间产物
第五章 微生物的生长繁殖 与生存因子
5.1 微生物的生长繁殖
5.1.1 微生物生长繁殖的概念
生长—— 微生物细胞吸收营养物质，进行新陈代谢，当同化 作用>异化作用时，生命个体的重量和体积不断增大的过 程。
繁殖——生命个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的 生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。
微生物 原生动物 放线菌 霉菌 藻类
适宜温 度℃
16～25
23～37 23～37
28～30
废水生物处理中的微 生物
30左右
4.嗜冷微生物在低温下生长的机理
①它们体内的酶能在低温下有效地催化，在高温 下酶活性丧失
② 主动运输物质的功能良好，能有效地集中必需 营养物
③细胞膜中的不饱和脂肪酸含量高，低温下也能 保持半流动状态，可以进行物质的传递
不同稀
释倍率
10-1
：
1后培0-2平养板图
得到不同
稀释度
（10-x）
10-5
菌液
10-2
10 -3
第二步：接种平板
各取 1ml，均匀涂布于
冷固体培养基平板上或
10-4
10 -5
与温热液态固体培养基
混合冷却。
第三步：培养
每一个细菌会生成一个 菌落
稀 释 度 可以计数 过 低 ， ，但数量 菌 落 密 过多，费 集 无 法 时费力 计数
发育——从生长到繁殖，是生物的构造和机能从简单到复杂、 从量变到质变的发展变化过程，这一过程称为发育。
个体生长——微生物细胞个体吸收营养物质，进行新陈代谢， 原生质与细胞组分的增加为个体生长。
群体生长——群体中个体数目的增加。可以用重量、体wenku.baidu.com、 密度或浓度来衡量。
1. 单细胞微生物的生长繁殖
生长：同化作用大于异化作用，细胞不断增长。 繁殖：单细胞个体生长到一定程度时，一个亲代细胞分
5.1.3 生长曲线在污水生物处理中的应用
1. 活性污泥的生长曲线
① 迟缓期 ② 对数生长期 ③ 减速生长期 ④ 内源呼吸期
2. 活性污泥生长曲线对废水生物处理的指导意义
常规活性 污泥法
生物吸附 法
高负荷活 性污泥法
延时曝气 法
污泥消化
生长下降 阶段(减速 期和稳定 期)
生长下降 阶段(静止 期)
▪ 影响物质的溶解度。对生长有影响。
2.微生物按温度需求分类
微生物
最低温度 ℃ 最适温度 ℃ 最高温度 ℃
嗜冷菌 嗜中温菌 嗜热菌 嗜超热菌
－5～0 5～10
30 55℃以上
5～10 25～40 50～60 70～105
20～30 45～50 70～80 110～113
3.各类微生物生长的适宜温度
②细胞分裂速度下降，开始积累内含物，芽孢杆菌开始产芽孢。
☆对于发酵生产来说，一般在稳定期的后期产物积累达到高峰， 是最佳的收获时期。 原因： ➢ 对数期消耗了营养物质，使其浓度降低； ➢ 有害代谢废物的大量积累(酸、醇、毒素等)； ➢ 营养物的比例失调，如碳氮比不合适； ➢ 理化条件(pH、DO、氧化还原势等)有所改变。
②.对数期（log phase）
其他名称：指数期
现象：细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈直线关系。
特点： ➢生长速率常数最大,世代时间最短,细胞数目以几何级数增加 ➢菌体大小形态、生理特征等比较一致 ➢代谢最旺盛 ➢对不良环境因素的抵抗力强 影响因素： 菌种、营养成分、营养物浓度 培养温度、DO、抑制剂 世代时间G=( t2- t1)/[3.3(lg X2-lg X1)]
= ××个/mL
1视野菌液(ml)＝(0.01ml ／1cm2)×视野面积(cm2)
1. 测定微生物的总数(直接计数法)
③ 比例计数法
比例——样品菌液与等体积的血液混合，观测二者比例
红血球数已知(男性400~500万个／ml，女性350~450万个／ml)， 平均400万个/ml
红
血 样品溶液与等体积的血液混合
(2) 恒化连续培养 — — 以恒定流速进水， 以相同流速流出代 谢产物，以维持进 水中的营养成分恒 定，使细菌处于最 高生长速率状态的 培养方法。
应用：污水生物处理 (除SBR法)。
3. 连续培养运行参数 —— 稀释率D D＝流动速率/容积 过低：新鲜营养补充不及时，导致大量细菌饥饿而死亡； 过高：生长速率低于排出速率
5.低温对微生物的影响 当环境温度低于微生物的最适生长温度时，微生
物的代谢极其微弱，基本处于休眠状态，当微生物的 原生质结构并未破坏时，不会很快造成死亡并能在较 长时间内保持活力，当温度提高时，可以恢复正常的 生命活动。
▪ 应用：低温保藏菌种
当温度过低，造成微生物细胞冻结时，有的微生 物会死亡，有些则并不死亡。
2. 测定活菌数(间接计数法)
1. 测定微生物的总数(直接计数法)
① 计数器(血球计数板）测定法
每小格深 0.1mm
盖玻片 载玻片
计数格=4×4=16 大格 血球计数板
0.052mm2×25
1 大格=5×5=25 小格 1 小格=0.05mm×0.05mm=0.0025mm2 总体积=16×0.1×25×0.0025=0.1mm3
二、 微生物生物量的测定
① 测细胞干重法 ② 含N量测定法 ③ DNA测定法 ④ 生理指标法
5.2 微生物的生长因子
5.2.1 温度
1. 温度对微生物的影响具体表现在：
▪ 影响酶活性。温度变化影响酶促反应速率，最终影响 细胞合成。
▪ 影响细胞膜的流动性。温度高，流动性大，有利于物 质的运输；温度低，流动性降低，不利于物质运输， 因此，温度变化影响营养物质的吸收与代谢产物的分 泌。
数量合 适，统 计计算， 作为结 果
数量太少 ，误差因 素太大， 不做计数
一般计数平板的细菌生长菌落数以30~300个为
宜。 平 第四步：均 计数
细菌数量=？ 细菌数量=数出的菌落数/稀释度 例如：10-5稀释度时菌落数为125个 细菌数量=125/10-5=1.25×107个/mL
平板计数法是采用最广的一种活菌计数法
6. 高温对微生物的影响
高温下蛋白质发生不可逆变性，膜受热出现小孔， 破坏细胞结构
小结： ❖ 微生物的培养应该在最佳温度范围进行；
❖ 超过最高温度会对细菌造成伤害甚至导致死亡；
❖ 低温有抑制细菌作用，可以让微生物休眠，但 不会导致死亡。温度升高时，活性即可恢复。
适用范围：测定个体较大的细菌或原生动物 测定细胞个体形态较小的则采用细菌计数板。
1. 测定微生物的总数(直接计数法)
② 涂片染色法
0．01ml 菌液均匀涂布，染色
面积 1cm2
目镜中的视野
每个视野的面积 由目测微尺的单 元格量出，视野 中菌液的体积按 比例折算
计数
每个视野细菌的平均数量
细菌数量=
视野中的菌液体积
★影响停滞期长短的因素
◆接种群体菌龄： 用对数生长期的菌种接种时，其停滞期较短， 甚至检查不到停滞期
◆接种量：一般来说， 接种量增大可缩短甚至消除停滞期
◆培养基成分： ◇在营养成分丰富的天然培养基上生长的延滞 期比在合成培养基上生长时短；◇接种后培养基成分有较大变 化时，会使延滞期加长，所以发酵工业上尽量使发酵培养基的 成分与种子培养基接近。
④. 衰亡期（decline phase）
特点：①细菌利用贮存物进行内源呼吸(自身溶解) 。 ②细胞死亡数增加，死亡数大大超过新增殖的细胞数，群体 中的活菌数目急剧下降，出现“负生长” 。 ③细胞内颗粒更明显，细胞出现多形态、畸形或衰退形。
衰亡期比其他各时期时间长，它的长短也与菌种和环境条 件有关。
连续流入 新鲜培养液
单批培养 恒浊法
恒化法 连续培养
lg细胞数（个/ml）
分批培养
连续培养
时间
2. 连续培养方法的分类
(1) 恒浊连续培养 —— 是通过连续培养装置 中的光电系统控制培 养液中菌体浓度恒定， 使细菌生长连续进行 的一种培养方式。
应用：发酵工艺采用该 法以获得大量菌体和 有经济价值的代谢产 物。
涂片
球
细 提问：如果平均每个视野中细菌数量/红血球 菌 的数量比例为5.5：1，则细菌数量=？
5.5×400万个/m l =2.2×107个/mL样品
1. 测定微生物的总数(直接计数法)
④ 比浊计数法
浊——细菌悬浮液的浊度
细菌不完全透光，一定范围内细菌溶液的混浊度
与细菌数量成正比
常用仪器：浊度计、分光光度计
裂为两个大小、性状与亲代细胞相似的子代细胞，使 得个体数目增加。 世代时间：细菌的两次细胞分裂之间的时间。
2. 多细胞微生物的生长繁殖
生长：细胞数目增加，个体数目不增加。 繁殖：细胞数目增加，个体数目也增加。
5.1.2 研究微生物生长的方法
(一) 分批培养(batch culture)
1. 概念：分批培养是将一定量的微生物接种在一个封闭 的、盛有一定量液体培养基的容器内，保持一定的温 度、pH和DO，微生物在其中生长繁殖。培养基一次 性加入，不更换。
④ 处于静止期的微生物体内积累了大量贮存物，强化了微 生物的生物吸附能力，自我絮凝、凝合能力强，在二沉 池中泥水分离效果好，出水水质好。
5.1.4 微生物生长量的测定方法
一、 细胞数目的测定 二、 微生物生物量的测定
一、 细胞数目的测定
1. 测定微生物的总数(直接计数法) ① 计数器直接计数 ② 染色涂片计数 ③ 比例计数法 ④ 比浊法
对数期和 减速期
内源呼吸 阶段(衰亡 期)
内源呼吸 阶段
常规活性污泥不利用对数生长期的微生物而利用 静止期的微生物的原因：
①处于对数期的微生物代谢活力强，能去除大量有机物， 但对进水有机物浓度需求高，使出水不易达到排放标准；
② 处于对数期的微生物生长繁殖旺盛，沉淀性能差，致使 出水水质差；
③ 处于静止期的微生物活力相对较差，但仍有相当的活力， 去除有机物的效果仍较好；