凝胶过滤层析的分类共17页文档
合集下载
凝胶过滤及离子交换层析介质详解
温度控制
温度对分离效果也有一 定影响，可以通过控制 实验温度来优化分离效 果。
案例分享：成功应用案例剖析
案例一
使用琼脂糖凝胶成功分离大分子蛋白质混合物，通过优化流动相和洗脱条件，实现了高 纯度蛋白质的获取。
案例二
应用离子交换层析技术成功分离了复杂样品中的痕量金属离子，通过选择合适的离子交 换树脂和优化实验条件，提高了分离效果和检测灵敏度。
现状
目前，凝胶过滤层析介质已经广泛应用于生物大分子的分离纯化，如蛋白质、酶、多糖等。同时，随着技术的不 断进步，新型凝胶过滤层析介质不断涌现，为生物分离领域提供了更多的选择。
应用领域与前景
要点一
应用领域
凝胶过滤层析介质在生物医药、生物工程、食品科学等领 域具有广泛的应用。例如，在生物医药领域，可用于药物 的分离纯化、蛋白质组学研究、抗体药物研发等；在生物 工程领域，可用于基因工程产物的分离纯化、酶工程产物 的分离纯化等；在食品科学领域，可用于食品添加剂的分 离纯化、功能性食品的研发等。
对未来发展趋势进行预测
层析技术的创新与应用拓展
随着科学技术的不断发展，层析技术将继续创新并拓展应用领域。例如，开发新型高效层析介质、优化层析条件、提 高分离效率等。
与其他技术的联合应用
层析技术可以与多种其他技术联合应用，如质谱、光谱等，实现复杂样品的高效分离和检测。这种联合应用将在未来 得到更广泛的关注和应用。
在生物医药等领域的应用前景
生物医药等领域对高纯度、高活性物质的需求不断增加，层析技术作为一种重要的分离纯化方法，将在 这些领域发挥越来越重要的作用。
THANKS
感谢观看
03
离子交换层析介质
根据目标离子的电荷性质和大小，选择合适的离子交换树脂，如阳离子
温度对分离效果也有一 定影响，可以通过控制 实验温度来优化分离效 果。
案例分享：成功应用案例剖析
案例一
使用琼脂糖凝胶成功分离大分子蛋白质混合物，通过优化流动相和洗脱条件，实现了高 纯度蛋白质的获取。
案例二
应用离子交换层析技术成功分离了复杂样品中的痕量金属离子，通过选择合适的离子交 换树脂和优化实验条件，提高了分离效果和检测灵敏度。
现状
目前，凝胶过滤层析介质已经广泛应用于生物大分子的分离纯化，如蛋白质、酶、多糖等。同时，随着技术的不 断进步，新型凝胶过滤层析介质不断涌现，为生物分离领域提供了更多的选择。
应用领域与前景
要点一
应用领域
凝胶过滤层析介质在生物医药、生物工程、食品科学等领 域具有广泛的应用。例如，在生物医药领域，可用于药物 的分离纯化、蛋白质组学研究、抗体药物研发等；在生物 工程领域，可用于基因工程产物的分离纯化、酶工程产物 的分离纯化等；在食品科学领域，可用于食品添加剂的分 离纯化、功能性食品的研发等。
对未来发展趋势进行预测
层析技术的创新与应用拓展
随着科学技术的不断发展，层析技术将继续创新并拓展应用领域。例如，开发新型高效层析介质、优化层析条件、提 高分离效率等。
与其他技术的联合应用
层析技术可以与多种其他技术联合应用，如质谱、光谱等，实现复杂样品的高效分离和检测。这种联合应用将在未来 得到更广泛的关注和应用。
在生物医药等领域的应用前景
生物医药等领域对高纯度、高活性物质的需求不断增加，层析技术作为一种重要的分离纯化方法，将在 这些领域发挥越来越重要的作用。
THANKS
感谢观看
03
离子交换层析介质
根据目标离子的电荷性质和大小，选择合适的离子交换树脂，如阳离子
凝胶过滤层析
琼脂糖凝胶（商品名为Sepharose)
琼脂糖是从琼脂中分离出来的。 琼脂糖是从琼脂中分离出来的。 在制备过程要将其中含硫酸根和羧基基团的琼脂胶除 在制备过程要将其中含硫酸根和羧基基团的琼脂胶除 去，得到不带电荷基团的琼脂糖。 得到不带电荷基团的琼脂糖。 琼脂糖是由D 半乳糖和 琼脂糖是由D-半乳糖和3、6脱水的L-半乳糖连接构成 脱水的L 半乳糖连接构成 的多糖链。 多糖链。 这种多糖链在100℃ 左右时呈液态， 这种多糖链在 100℃ 左右时呈液态 ， 当温度下降到 45℃以下时呈固态。 45℃以下时呈固态。 它们之间以氢键方式相互连接就成了线性的双链单环 它们之间以氢键方式相互连接就成了线性的双链单环 的琼脂糖，经凝聚即呈束状的琼脂糖凝胶。 的琼脂糖，经凝聚即呈束状的琼脂糖凝胶。
三、聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶的商品名称为Bio-gel。 它是以甲撑双丙烯酰胺 甲撑双丙烯酰胺(双体)作交联剂 交联剂，以过 甲撑双丙烯酰胺 交联剂 硫酸铵作催化剂， 硫酸铵 在N,N,N’,N’,- 四甲基乙二胺(TEMED TEMED)加速剂 TEMED 的作用下， 丙烯酰胺(单体)聚合而成的。 将丙烯酰胺 丙烯酰胺 当改变单体浓度时，就可得到吸水率不同的产 物。
2．稳定性 ．
葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂中 是稳定的、不溶解的，而且很少产生化学降解。 在中性条件下，葡聚糖凝胶悬浮液可置高温(120℃)消毒0.5h，其 性质并不改变。 在0.1mol／L HCl溶液中浸泡1~2h，甚至在0.02mol／L HCI溶液中 浸泡6个月以上，对分离效果无明显的影响。 当暴露于强酸或氧化剂溶液时，则容易使糖苷键水解断裂，因此， 要避免与其接触。 葡聚糖凝胶欲在室温下长期保存时，应加入适量的防腐剂如氯仿、 0.05％NaN3或20％乙醇等，不然微生物将生长。
凝胶过滤层析资料
葡聚糖凝胶的型号不同，其性质亦不一样
分类
以G型葡聚糖凝胶(经水溶液膨胀)作为固定相，以水 溶液作为流动相，对水溶性物质进行分离的层析方法 称为葡聚糖凝胶过滤层析。
以LH型葡聚糖凝胶(经乙醇或二甲亚砜甲酰胺或N、N二甲基甲酰胺等有机溶剂膨胀)作为固定相，以有机 溶剂为流动相，对脂溶性物质进行分离的层析方法称 为葡聚糖凝胶渗透层析。
当暴露于强酸或氧化剂溶液时，则容易使糖苷键水解断裂，因此， 要避免与其接触。
葡聚糖凝胶欲在室温下长期保存时，应加入适量的防腐剂如氯仿、 0.05％NaN3或20％乙醇等，不然微生物将生长。
3．吸附性
葡聚糖凝胶系弱酸性物质，这是由于其每克干胶中含 10-20μg当量的羧基基团所致。
羧基基团能与分离物中电荷基团 (尤其是碱性蛋白质) 发生吸附作用。
的多糖链。 这种多糖链在100℃左右时呈液态，当温度下降到
45℃以下时呈固态。 它们之间以氢键方式相互连接就成了线性的双链单环
凝胶过滤层析
gel filtration chromatogra
phy,GFC
定义
凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种。 利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根据被分离
物质的分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻 层析（size exclusion chromatography）、分子筛 层析（Molecular Sieve Chromatography）、凝胶渗 透层析（Gel Permeation Chromatography）
这样，经过层析柱，混合物中的各物 质按其分子大小不同而被分离。
固定相（凝胶）
三维空间网状结构
分子筛效应： 按分子大小不同,在凝胶受到的
分类
以G型葡聚糖凝胶(经水溶液膨胀)作为固定相，以水 溶液作为流动相，对水溶性物质进行分离的层析方法 称为葡聚糖凝胶过滤层析。
以LH型葡聚糖凝胶(经乙醇或二甲亚砜甲酰胺或N、N二甲基甲酰胺等有机溶剂膨胀)作为固定相，以有机 溶剂为流动相，对脂溶性物质进行分离的层析方法称 为葡聚糖凝胶渗透层析。
当暴露于强酸或氧化剂溶液时，则容易使糖苷键水解断裂，因此， 要避免与其接触。
葡聚糖凝胶欲在室温下长期保存时，应加入适量的防腐剂如氯仿、 0.05％NaN3或20％乙醇等，不然微生物将生长。
3．吸附性
葡聚糖凝胶系弱酸性物质，这是由于其每克干胶中含 10-20μg当量的羧基基团所致。
羧基基团能与分离物中电荷基团 (尤其是碱性蛋白质) 发生吸附作用。
的多糖链。 这种多糖链在100℃左右时呈液态，当温度下降到
45℃以下时呈固态。 它们之间以氢键方式相互连接就成了线性的双链单环
凝胶过滤层析
gel filtration chromatogra
phy,GFC
定义
凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种。 利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根据被分离
物质的分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻 层析（size exclusion chromatography）、分子筛 层析（Molecular Sieve Chromatography）、凝胶渗 透层析（Gel Permeation Chromatography）
这样，经过层析柱，混合物中的各物 质按其分子大小不同而被分离。
固定相（凝胶）
三维空间网状结构
分子筛效应： 按分子大小不同,在凝胶受到的
凝胶过滤层析简介
凝胶
层析柱
加样洗脱
再生保存
柱的选择 柱的装填
同样直径的层析柱 同样长度的层析柱 同样体积的层析柱 理想的层析柱
长层析柱比短的分辨率高； 直径大的比小的分辨率高； 层析柱长的比短的分辨率高。 直径与长度之比是1：25-1：100
常用的支持物有棉花、玻璃纤维、玻璃珠、垂熔玻璃等。 空柱中应留约1/5的水或溶剂。 不断搅拌下使胶粒均匀沉降，使不发生凝胶分层和胶面倾斜。
测定分子量
当Kd=1时，洗脱体积Ve=V0+Vi，为全渗入。 当Kd=0时，洗脱体积Ve=V0，为全排阻。
0＜Kd＜1时，洗脱体积Ve=Vo+KdVi，为部分渗入。
|分类与性质
凝胶
分类性质
凝 胶 含大量液体的具三维网状开孔弹性结构的多聚体结构，
一般制成球状颗粒。
性
能 多孔、亲水、惰性、稳定、色谱性能好
凝胶过滤层析技术
凝胶过滤层析技术 content
凝胶过滤的基本原理
凝胶分类与性质 凝胶过滤的基本操作
凝胶过滤层析的应用
|基本原理
原理
分子
洗脱体积
分配系数
凝胶过滤法又称为分子筛层析、凝胶 层析或排阻层析,是利用凝胶 的网状结构根据分子大小进 行分离的一种方法。凝胶过
Services 滤所用的介质是由交联葡萄
| 基本操作
凝胶
层析柱
加样洗脱
再生保存
凝胶再生 凝胶保存
仅使用过一次的凝胶柱，通常进行更新平衡后 即可再次使用； 湿法：洗净的凝胶悬浮于蒸馏水和缓冲液中，应加入 适量的防腐剂如氯仿、0.05％NaN3或20％乙醇等，不 先用水反复进行逆向冲洗，再用缓冲液进行 然微生物将生长。 平衡，平衡毕，即可重复使用 干法：用浓度逐步升高的乙醇洗净凝胶，使其脱水收 把凝胶倒出，用低浓度的酸或碱按其预处理 缩，再抽干乙醇，用60-80℃的暖风吹干，在室温下 方法进行，处理后重新装柱即可再行使用 保存。 半缩法：是过度法，用60%-70%的乙醇使凝胶部分脱 水，然后封口，4 ℃保存。
第七章 凝胶层析
42
一、凝胶的选择和处理 二、凝胶层析柱的设计和制备 三、凝胶层析操作 四、主要参数测算 五、凝胶层析的扩展
43
一、凝胶的选择和处理
（一）凝胶的选择 (1).将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋
白质与盐类，称作类分离。
(2).将分子量相差不大的大分子物质加以分离， 如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分 离。
避免硼酸缓冲液
（二）架桥琼脂糖凝胶（Sepharose CL）
架桥琼脂糖凝胶为琼脂 线性分子经1，3-二溴丙 醇交联的凝胶。
它的凝胶孔径均匀，机 械强度明显加大。
对热和化学物质的稳定 性 大 大 增 加 , 在 pH3~14
范围内稳定。
36
（三）超胶（Utro-gel ACA）
所谓超胶是琼脂糖与聚丙烯酰胺的混合凝胶。 商品名称后面的编号为两位数，各表示混合胶中聚
例如Sephadex G-50的排阻极限为30,000，它表示分 子量大于30,000的分子都将直接从凝胶颗粒之外被洗 脱出来。
4. 分级分离范围
分级分离范围表示一种凝胶适用的分离范围，对于分 子量在这个范围内的分子，用这种凝胶可以得到较好 的线性分离。
例如Sephadex G-75对球形蛋白的分级分离范围为 3,000－70,000，它表示分子量在这个范围内的球形 蛋白可以通过Sephadex G-75得到较好的分离。
21
一、葡聚糖凝胶 (Sephadex)
1.结构
商品名为Sephadex G类 . 交联葡聚糖的基本骨架是葡
聚糖。 再经3-氯-1，2-环氧丙烷为
交联剂，形成三维网状结构 的高分子化合物。 其交联度是通过交联剂的加 量及反应条件来控制的。
22
2 规格型号：
一、凝胶的选择和处理 二、凝胶层析柱的设计和制备 三、凝胶层析操作 四、主要参数测算 五、凝胶层析的扩展
43
一、凝胶的选择和处理
（一）凝胶的选择 (1).将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋
白质与盐类，称作类分离。
(2).将分子量相差不大的大分子物质加以分离， 如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分 离。
避免硼酸缓冲液
（二）架桥琼脂糖凝胶（Sepharose CL）
架桥琼脂糖凝胶为琼脂 线性分子经1，3-二溴丙 醇交联的凝胶。
它的凝胶孔径均匀，机 械强度明显加大。
对热和化学物质的稳定 性 大 大 增 加 , 在 pH3~14
范围内稳定。
36
（三）超胶（Utro-gel ACA）
所谓超胶是琼脂糖与聚丙烯酰胺的混合凝胶。 商品名称后面的编号为两位数，各表示混合胶中聚
例如Sephadex G-50的排阻极限为30,000，它表示分 子量大于30,000的分子都将直接从凝胶颗粒之外被洗 脱出来。
4. 分级分离范围
分级分离范围表示一种凝胶适用的分离范围，对于分 子量在这个范围内的分子，用这种凝胶可以得到较好 的线性分离。
例如Sephadex G-75对球形蛋白的分级分离范围为 3,000－70,000，它表示分子量在这个范围内的球形 蛋白可以通过Sephadex G-75得到较好的分离。
21
一、葡聚糖凝胶 (Sephadex)
1.结构
商品名为Sephadex G类 . 交联葡聚糖的基本骨架是葡
聚糖。 再经3-氯-1，2-环氧丙烷为
交联剂，形成三维网状结构 的高分子化合物。 其交联度是通过交联剂的加 量及反应条件来控制的。
22
2 规格型号：
凝胶过滤层析
因此分子的正常Ｋav值0~1之间,这种由小 到大的顺序决定了物质流出的顺序。
排阻极限： 是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部 的最小分子的分子量。
排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最大分 子量。
第二节 凝胶介质的分类和性质
1） 葡聚糖凝胶 ① G类葡聚糖（Sephadex） ② LH-亲脂型葡聚糖 ③ Sephacryl
凝胶过滤原理示意图
凝胶层析的几个概念
外水体积（Vo）：是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流 动相的体积。 内水体积（Vi）：是指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶层析中固定相体积就是指内水体 积。 基质体积（Vg）：是指凝胶颗粒实际骨架体积。 柱床体积（Vt）：是指凝胶柱所能容纳的总体积。 洗脱体积 （Ve）：样品中某组分洗脱下来所需洗脱液的总体积。
（2） 琼脂糖凝胶
商品名 Sepharose（瑞典）
1）2B,4B等型号，数字代表颗粒中琼脂糖的百 分含量，数字越大，分离的范围越小 2）与1，3－二溴异丙醇反应生成交联琼脂糖， 稳定性提高；
Bio－gel A(美国）
一般有A0.5, A1.5等型号，数字×106代表分 离的分子量极限；
与葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶相比，琼脂糖凝 胶机械强度和筛孔稳定性好，洗脱速度可以快些
对于凝胶层析，分配系数实质上表示某个组分在内水 体积和在外水体积中的浓度分配关系。
Ｋav＝（Ｖｅ－Ｖｏ）／(Ｖt － Vo)
它只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔 隙的大小分布有关，而与柱的长短粗细无 关，也就是说它对每一物质为常数与柱的 物理条件无关。
（1）Ｋav = 0时,Ve = Vo,意味着该分子完全被排 阻于凝胶颗粒之外,全部分布于流动相里,在固定相 分布为0,而最先流出。
凝胶过滤
当暴露于强酸或氧化剂溶液时，易使糖苷 键水解断裂。 葡聚糖凝胶欲在室温下长期保存时，应加 入适量的防腐剂如氯仿、叠氮化钠等。否 则，微生物将生长。
3．吸附性
葡聚糖凝胶系弱酸性物质，因为含羧基基团。
该基团能与分离物中电荷基团（碱性蛋白质） 发生吸附作用，可提高洗脱液的离子强度。但 当离子强度大于0.05时，对弱碱性蛋白质就无 吸附力了。 葡聚糖凝胶层析时，用含有 NaCl 的缓冲液作 洗脱液。
一般聚丙烯酰胺凝胶均制成珠状颗粒，以干凝胶形 式出售，使用前必须溶胀。 特点： 不溶于水和普通有机溶剂； 能在浓盐、尿素和胍盐等溶液中浸泡； 在pH l-10或短时间超过此pH值的溶液中较稳定； 要避免长期与强酸和强碱接触，否则，酰胺基将迅 速发生分解（高温条件）。
缺点： 对芳香族的、酸性和碱性的化合物稍有吸 附现象，使用离子强度略高的洗脱液操 作可以克服。
相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网 孔，可完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下 移动过程中，因此流程较长，移动速率慢，所 以最后流出。
中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗 透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以 它们流出的时间介于二者之间，这样分子大的 组分先流出，分子小的组分后流出。
琼脂糖凝胶在干燥状态下易破裂，一般存放在 含防腐剂的水溶液中，避免剧烈的搅动。
CL型交联琼脂糖：Sepharose 与1, 3-二溴异丙醇 （1, 3-dibromopropanol）在强碱性条件生成的。 优点： 其筛孔与同浓度的、未交联的琼脂糖相同，热 稳定性与化学稳定性好 可在广范围的pH溶液（pH3-14）中使用，用较 强的碱溶液短时间处理，性能不会改变。 缺点：在氧化剂存在下，会有少量的多糖链发生 解聚。
凝胶过滤层析的分类
凝胶过滤层析的分类
凝胶过滤层析是一种常用的生物制剂分离和纯化技术，主要用于生物大分子的精细纯化和结构研究。
它是利用小孔隙的凝胶纤维或颗粒作为固定相，在其内部通过物质的分子筛选和分散作用，实现对混合物中生物大分子的分离和纯化。
根据其分离原理、凝胶基质和实现机制，可以将凝胶层析分为以下几类：
1. 分子筛层析
分子筛层析是利用具有一定孔径分布的凝胶基质分离混合物中分子大小差异较大的生物大分子。
该技术通常使用具有不同孔径大小的凝胶柱，较小的分子可透过凝胶孔道而较大的分子则被阻滞并在凝胶孔道内停留，从而实现克隆、富集和大分子的纯化。
2. 逆流层析
逆流层析是将混合物中组分与凝胶基质相互作用后，通过逆向流动，选择性地读出不同组分。
该技术主要利用大分子与凝胶基质的亲和作用，通过连续返流溶液在凝胶柱内的往复流动，将具有亲和性的分子迅速疏水排放，从而实现分离和纯化。
离子层析是基于凝胶基质与某些离子的亲和性而实现分离纯化的技术。
离子层析通常采用常见的阴离子或阳离子的亲和柱，利用空间分离、分子交互作用和高效分离的特性。
离子层析是分离、富集和分析各种生物大分子分子的重要技术手段之一。
4. 亲和层析
亲和层析是基于凝胶基质与生物大分子之间的特异性结合而实现分离纯化的技术。
该技术利用富集目标大分子与凝胶基质亲和性较高的特点，通过配对反应的选择性结合，进一步提高其纯化效率和选择性。
综上所述，凝胶过滤层析的分类主要包括分子筛层析、逆流层析、离子层析和亲和层析。
随着生物制剂的应用不断扩大和完善，各类凝胶层析的应用和发展将日趋重要。
第七章层析分离技术2——凝胶过滤层析
特点：
（1）介质不带电荷, 具有化学惰性，不与被分离物 质发生化学反应，条件温和，不会使物质变性；
（2）色谱介质不需再生,可反复便用； （3）分离效率高，回收率较高； （4）广泛应用于生物大分子的初级分离，脱盐等。 （5）分辨率较低，需采用细长柱。 （6）经过凝胶过滤色谱后样品被稀释，上样前需
显影响 其分离效果不受去污剂、促溶盐类、变性剂等影响 能在多种有机溶剂存在下使用
②Superdex
根据分级范围不同，可分为若干型号（见表5.6，P80）， 其中，数字越大，孔径越大。 prep grade 颗粒较大。
Superdex peptide Superdex 30 prep grade Superdex 75、200 （ prep grade ）
根据交联之前母胶中琼脂糖的含量不同，Sepharose CL系 列凝胶也有三种类型：Sepharose CL-2B、Sepharose CL4B和Sepharose CL-6B。
特点
Sepharose CL系列凝胶在颗粒直径、分级范围方面与Sepharose系 列完全相同
在pH稳定范围、机械强度（流速）及温度稳定性等方面得到了很 大的改进
二、凝胶过滤介质
2. 凝胶介质的种类
按基质组成主要可以分为 ：
葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、聚苯乙烯 -二乙烯苯凝胶、二氧化硅凝胶，以及由两种物质混合 形成的如琼脂糖-葡聚糖混合凝胶、聚丙烯酰胺-葡聚糖 混合凝胶等。
按凝胶过滤层析能达到的柱效和分辨率又可分为：
标准凝胶介质：颗粒尺寸较大（一般为100~250 μm），机
（1）葡聚糖凝胶（Sephadex ） G-数字 联度越大，分级范围越小。）
凝
胶 过
（2）琼脂糖凝胶
（1）介质不带电荷, 具有化学惰性，不与被分离物 质发生化学反应，条件温和，不会使物质变性；
（2）色谱介质不需再生,可反复便用； （3）分离效率高，回收率较高； （4）广泛应用于生物大分子的初级分离，脱盐等。 （5）分辨率较低，需采用细长柱。 （6）经过凝胶过滤色谱后样品被稀释，上样前需
显影响 其分离效果不受去污剂、促溶盐类、变性剂等影响 能在多种有机溶剂存在下使用
②Superdex
根据分级范围不同，可分为若干型号（见表5.6，P80）， 其中，数字越大，孔径越大。 prep grade 颗粒较大。
Superdex peptide Superdex 30 prep grade Superdex 75、200 （ prep grade ）
根据交联之前母胶中琼脂糖的含量不同，Sepharose CL系 列凝胶也有三种类型：Sepharose CL-2B、Sepharose CL4B和Sepharose CL-6B。
特点
Sepharose CL系列凝胶在颗粒直径、分级范围方面与Sepharose系 列完全相同
在pH稳定范围、机械强度（流速）及温度稳定性等方面得到了很 大的改进
二、凝胶过滤介质
2. 凝胶介质的种类
按基质组成主要可以分为 ：
葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、聚苯乙烯 -二乙烯苯凝胶、二氧化硅凝胶，以及由两种物质混合 形成的如琼脂糖-葡聚糖混合凝胶、聚丙烯酰胺-葡聚糖 混合凝胶等。
按凝胶过滤层析能达到的柱效和分辨率又可分为：
标准凝胶介质：颗粒尺寸较大（一般为100~250 μm），机
（1）葡聚糖凝胶（Sephadex ） G-数字 联度越大，分级范围越小。）
凝
胶 过
（2）琼脂糖凝胶
06第六章凝胶过滤
的琼脂糖，经凝聚即呈束状的琼脂糖凝胶。
该物质对尿素和盐酸胍等破坏氢键的试剂有较强的抵 抗力，在pH4.0~9.0的缓冲液中是稳定的。
琼脂糖凝胶室温保存，其物理稳定性超过了聚丙烯酰 胺和葡聚糖凝胶。
琼脂糖凝胶在干燥状态下保存时易破裂，故一般存放 在含防腐剂的水溶液中，同时还要避免剧烈的搅动。
琼脂糖凝胶按其浓度来分有Sepharose 2B(2％)、4B(4％) 和6B(6％)。
玻璃珠 有大量的网孔，且分布均一; 它机械性能良好，在较高的层析流速下，分辨率并不 受影响; 缺点是对蛋白质等物质有吸附能力。
第二节 基本原理
凝胶过滤层析的基质: 具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的 物质。
排阻、扩散效应（见下图） 这种基质可以完全或者部分排阻某些大分子化合物于 筛孔之外， 而不能排阻某些小分子化合物，但可让其在筛孔中自 由地扩散、渗透。 任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱被排阻的范围 均在0~100％之间。
一、凝胶的选择和处理
1．凝胶的选择 (1)型号 凝胶型号多。型号不同，筛分范围亦不相同。
Sephadex G型一般适宜于分离蛋白质。 蛋白质脱盐时，可选用凝胶SephadexG-25。
一般来说， 在规定的筛分范围内，混合物之间分子质量差别越大， 分离的效果越好。
(2)粒度 凝胶的粒度有粗有细(与交联度无关)。 细颗粒凝胶之间空间小，装柱易均一，因此分离效果
在用其分离样品过程中，溶液的酸碱度可在pH3~12范 围内变化，溶液中加入去污剂(如1％SDS)和(或)解离剂 (如8mol／L尿素、6mol／L盐酸胍)时，也不会影响分 离效果。
此凝胶共有6种类型，详见表6-6
除上述5类凝胶外，还有： Superose(高交联度的多孔琼脂糖珠，有制备级和分析级)、 玻璃珠 聚苯乙烯凝胶 等也具有分子筛功能。
该物质对尿素和盐酸胍等破坏氢键的试剂有较强的抵 抗力，在pH4.0~9.0的缓冲液中是稳定的。
琼脂糖凝胶室温保存，其物理稳定性超过了聚丙烯酰 胺和葡聚糖凝胶。
琼脂糖凝胶在干燥状态下保存时易破裂，故一般存放 在含防腐剂的水溶液中，同时还要避免剧烈的搅动。
琼脂糖凝胶按其浓度来分有Sepharose 2B(2％)、4B(4％) 和6B(6％)。
玻璃珠 有大量的网孔，且分布均一; 它机械性能良好，在较高的层析流速下，分辨率并不 受影响; 缺点是对蛋白质等物质有吸附能力。
第二节 基本原理
凝胶过滤层析的基质: 具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的 物质。
排阻、扩散效应（见下图） 这种基质可以完全或者部分排阻某些大分子化合物于 筛孔之外， 而不能排阻某些小分子化合物，但可让其在筛孔中自 由地扩散、渗透。 任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱被排阻的范围 均在0~100％之间。
一、凝胶的选择和处理
1．凝胶的选择 (1)型号 凝胶型号多。型号不同，筛分范围亦不相同。
Sephadex G型一般适宜于分离蛋白质。 蛋白质脱盐时，可选用凝胶SephadexG-25。
一般来说， 在规定的筛分范围内，混合物之间分子质量差别越大， 分离的效果越好。
(2)粒度 凝胶的粒度有粗有细(与交联度无关)。 细颗粒凝胶之间空间小，装柱易均一，因此分离效果
在用其分离样品过程中，溶液的酸碱度可在pH3~12范 围内变化，溶液中加入去污剂(如1％SDS)和(或)解离剂 (如8mol／L尿素、6mol／L盐酸胍)时，也不会影响分 离效果。
此凝胶共有6种类型，详见表6-6
除上述5类凝胶外，还有： Superose(高交联度的多孔琼脂糖珠，有制备级和分析级)、 玻璃珠 聚苯乙烯凝胶 等也具有分子筛功能。
实验六凝胶过滤层析
实验 六 凝胶过滤层析
一 实验原理
凝胶层析是将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相， 由于在层析过程中样品不同的蛋白质具有不同的洗脱， 使不同的分子量的组分得以别离的层析方法。凝胶层 析的别离过程是在装有多孔物质如交联聚苯乙烯、多 孔玻璃、多孔硅胶、交联葡聚糖等填料的柱中进展的。
填料颗粒含有许多不同大小的孔隙。这些孔隙对于溶 剂分子而言是很大的，他们可以自由扩散出入。对于 溶质分子而言，如果分子大小适宜时，那么可以不同 程度地往孔隙中扩散，大分子量的溶质分子只能占有 较小的孔隙，而小分子量的溶质分子除能占住大孔隙 外，还可以占有另外一些起更小的孔隙。
其定量关系符合以下公式：
Ve=Vo+KV1 Ve：某一溶质的洗脱体积 Vo：层析柱的外水体积 Vi：层析柱的内水体积 K：某一溶质的分配系数
二试剂和器材
1．试剂
Sephadex G-75 0.005M PBS 兰色葡聚糖 样品溶液
二试剂和器材
2．器材 〔1〕带夹套层析柱：φ：h=1:24 〔2〕加样器 〔3〕分部收集器 〔4〕核酸蛋白检测仪 〔5〕小玻棒
三 操作步骤
2 层析柱的选择 对于大分子量化合物的分级别离，要求
柱床体积大于样品体积25倍以上，最高 可达100倍，层析柱的径高比也在25100之间。为了减少温度对别离蛋白质 活性的影响，层析柱外加夹套，通入低 温循环水，以保持低温。
三 操作步骤
3 凝胶柱的装填和凝胶床的检查 将层析柱垂直固定，层析柱预装1/5的平衡溶液，再将适当浓度
三 操作步骤
5 洗脱与收集 为了防止柱床体ห้องสมุดไป่ตู้的变化，造成流速降低及重复
性下降，整个洗脱过程应始终保持一定的操作压。 流速不能过快且要稳定。洗脱液的成分不应改变。 洗脱液采用分部收集器收集，以核酸蛋白检测器 检测洗脱峰。
一 实验原理
凝胶层析是将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相， 由于在层析过程中样品不同的蛋白质具有不同的洗脱， 使不同的分子量的组分得以别离的层析方法。凝胶层 析的别离过程是在装有多孔物质如交联聚苯乙烯、多 孔玻璃、多孔硅胶、交联葡聚糖等填料的柱中进展的。
填料颗粒含有许多不同大小的孔隙。这些孔隙对于溶 剂分子而言是很大的，他们可以自由扩散出入。对于 溶质分子而言，如果分子大小适宜时，那么可以不同 程度地往孔隙中扩散，大分子量的溶质分子只能占有 较小的孔隙，而小分子量的溶质分子除能占住大孔隙 外，还可以占有另外一些起更小的孔隙。
其定量关系符合以下公式：
Ve=Vo+KV1 Ve：某一溶质的洗脱体积 Vo：层析柱的外水体积 Vi：层析柱的内水体积 K：某一溶质的分配系数
二试剂和器材
1．试剂
Sephadex G-75 0.005M PBS 兰色葡聚糖 样品溶液
二试剂和器材
2．器材 〔1〕带夹套层析柱：φ：h=1:24 〔2〕加样器 〔3〕分部收集器 〔4〕核酸蛋白检测仪 〔5〕小玻棒
三 操作步骤
2 层析柱的选择 对于大分子量化合物的分级别离，要求
柱床体积大于样品体积25倍以上，最高 可达100倍，层析柱的径高比也在25100之间。为了减少温度对别离蛋白质 活性的影响，层析柱外加夹套，通入低 温循环水，以保持低温。
三 操作步骤
3 凝胶柱的装填和凝胶床的检查 将层析柱垂直固定，层析柱预装1/5的平衡溶液，再将适当浓度
三 操作步骤
5 洗脱与收集 为了防止柱床体ห้องสมุดไป่ตู้的变化，造成流速降低及重复
性下降，整个洗脱过程应始终保持一定的操作压。 流速不能过快且要稳定。洗脱液的成分不应改变。 洗脱液采用分部收集器收集，以核酸蛋白检测器 检测洗脱峰。
凝胶过滤层析
凝胶过滤层析
凝胶过滤层析法是一种常用的实验室分析技术，它可以将混合溶液分离成不同的成分。
该方法主要利用一种含有疏水性的底物的结构性聚合物（凝胶）作为滤床，通过滤床上物
质的比较灵活的空间配比，利用物质的大小、形状、电荷、形态等分子特性的不同，进行
凝胶过滤层析，实现它们的分离和分离富集提纯加离。
凝胶过滤层析实验室分析中，根据物质与凝胶分子相互作用方式不同，分为离子交换
层析和非离子交换层析两种方式。
离子交换层析中，常用的凝胶有Amberlite XAD-2、Amberlite IR-120等；而非离子交换层析中，常用凝胶有Sephadex G-50、Sepharose 4B、Flysorb V、ComboGel等。
凝胶过滤层析实验属于实验离子交换，首先应正确配置实验设备，然后将原混合胶固
化成凝胶颗粒，最后将混合溶液放入过滤室中，并以规定的渗透速率和浓度进行过滤，
实现各成分的分离和分离技术的提纯。
通过此技术，不仅能有效地分离和提纯高浓度的有
用物质，而且可以获得具有不同性质的物质，获得较高纯度的有用物质。
凝胶过滤层析作为一种相对简单、快捷、可操作性强的实验方法，已广泛应用于药用
植物材料及药物分析、环境污染物实验分析、食品分析、细胞培养分析等领域，可满足实
验研究中分离富集提纯加离的需要。
第五章-凝胶过滤层析
2
第五章 凝胶过滤层析 第一节 概 述
凝胶过滤具有的优势 : （1）凝胶介质不带电荷，具有良好的稳定性，分离条件温 和，回收率高，重现性好； （2）通常情况下，溶液中存在各种离子、小分子、去污剂、 表面活性剂、蛋白变性剂等不会对分离产生影响，层析还能 在不同pH、温度下进行； （3）应用范围广，能分离的物质相对分子质量的覆盖面 宽，从几百到数百万，因此既适用于分子量较低的寡糖、寡 肽、聚核苷酸等生物小分子的分离，也适用于蛋白质、多糖、 核酸等大分子物质的纯化； （4）设备相对简单、易于操作、分离周期短、连续分离时 层析介质不需再生即可反复使用。
3
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
一、凝胶过滤的概念
不同的溶质因不同程度进入介质而在液相中停留的时间不同, 凝胶的孔径和溶质分子大小的关系决定了层析时该溶质在层 析柱中的保留时间，不同的物质因保留时间不同而分离.
4
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
凝胶色谱分离原理
5
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
7
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
2.分子量低于分级范围下限的分子被称为全渗透分子，它们 完全进入凝胶颗粒网孔内部，洗脱时所受阻力最大，流程也 最长，最后从层析柱中被洗脱； 3.分子量在分级范围内的分子被称为部分渗透分子，它们依 据分子大小不同程度的进入凝胶颗粒内部的，是该凝胶介质 的有效分离对象。 如果两种物质分子量均大于凝胶介质分级范围的上限，或者 均小于分级范围下限，它们就无法通过层析而分离。
二、生物分子的相对分子质量、分子大小和形状
每一种特定的凝胶介质都有特定的分子量分级范围，分级范 围是凝胶介质的重要参数。 根据其分级范围，可以将溶质分子分为三类： 1.分子量大于分级范围上限的分子被称为全排阻分子，它们 完全被排阻在凝胶颗粒网孔外，从颗粒间隙中通过，所受阻 力最小，流程也最短，首先从层析柱中被洗脱下来；
第五章 凝胶过滤层析 第一节 概 述
凝胶过滤具有的优势 : （1）凝胶介质不带电荷，具有良好的稳定性，分离条件温 和，回收率高，重现性好； （2）通常情况下，溶液中存在各种离子、小分子、去污剂、 表面活性剂、蛋白变性剂等不会对分离产生影响，层析还能 在不同pH、温度下进行； （3）应用范围广，能分离的物质相对分子质量的覆盖面 宽，从几百到数百万，因此既适用于分子量较低的寡糖、寡 肽、聚核苷酸等生物小分子的分离，也适用于蛋白质、多糖、 核酸等大分子物质的纯化； （4）设备相对简单、易于操作、分离周期短、连续分离时 层析介质不需再生即可反复使用。
3
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
一、凝胶过滤的概念
不同的溶质因不同程度进入介质而在液相中停留的时间不同, 凝胶的孔径和溶质分子大小的关系决定了层析时该溶质在层 析柱中的保留时间，不同的物质因保留时间不同而分离.
4
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
凝胶色谱分离原理
5
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
7
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
2.分子量低于分级范围下限的分子被称为全渗透分子，它们 完全进入凝胶颗粒网孔内部，洗脱时所受阻力最大，流程也 最长，最后从层析柱中被洗脱； 3.分子量在分级范围内的分子被称为部分渗透分子，它们依 据分子大小不同程度的进入凝胶颗粒内部的，是该凝胶介质 的有效分离对象。 如果两种物质分子量均大于凝胶介质分级范围的上限，或者 均小于分级范围下限，它们就无法通过层析而分离。
二、生物分子的相对分子质量、分子大小和形状
每一种特定的凝胶介质都有特定的分子量分级范围，分级范 围是凝胶介质的重要参数。 根据其分级范围，可以将溶质分子分为三类： 1.分子量大于分级范围上限的分子被称为全排阻分子，它们 完全被排阻在凝胶颗粒网孔外，从颗粒间隙中通过，所受阻 力最小，流程也最短，首先从层析柱中被洗脱下来；
凝胶过滤层析的分类
6． 装完后上样前要用洗脱液平衡。 7． 要稳压，控制洗脱液排出口与洗脱瓶 之间的高度差，并控制洗脱速度，速度 为6—7滴/分钟。 8． 使用过的柱用2倍洗脱液平衡后可再 上柱使用。 9. 上样时，缓慢沿层析柱内壁加于柱床 表面。
应用
a. 分离蛋白质 b. 脱盐 c. 浓缩 c. 蛋白质分子量的测定
装柱的注意事项：
1. 柱要保持垂直。 2. 液面要高于胶面。 3． 要根据所需纯化物质的分子量选择胶 的孔径。本实验用G-50。 4． 胶要充分膨胀，并去掉小颗粒。 5． 装柱要均一，胶面要平整，柱不能留 有气泡（包括死空间），必要时可用玻 棒在凝胶表面轻轻搅拌，再让凝胶自然 沉淀。胶柱不能有断层。否则得重装。
3.离子交换层析 固定相为离子交换剂，利 用各组分对离子交换剂的亲和力不同而 进行分离。 4.凝胶层析 固定相为多孔凝胶，利用各 组分在凝胶上受阻滞的程度不同而进行 分离. 5.亲和层析 根据生物特异性吸附进行分 离，固定相只和一种待分离组分有特异 性的亲和能力而结合，而与无结合能力 的其他组分分离。被分离的大分子与固 定相发生可逆的非共价结合（如：抗原 与抗体、激素与受体、酶的活性中心与 专一的底物等。）
优点： a. 条件温和 b.操作简便 c. 损失少回收率高 d. 层析 柱可反复使用 凝胶的类型： （1）Sephadex: 交联葡聚糖 G-10，15，25，50， 75，100，150，200 商品凝胶的型号，用吸水量的10倍数字表示（比如： 每克干凝胶吸水量为2.5克时，其型号为G-25） （2）Sepharose：琼脂糖凝胶 Bio-Gel A （3）Bio-Gel P：聚丙烯酰胺凝胶分子筛 （4）Sephacryl：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡 聚糖凝胶
凝胶层析的原理：利用具有网状结构的凝胶的分子 筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行 分离。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
有什么损失。——卡耐基 47、书到用时方恨少、事非经过不知难。——陆游 48、书籍把我们引入最美好的社会，使我们认识各个时代的伟大智者。——史美尔斯 49、熟读唐诗三百首，不会作诗也会吟。——孙洙 50、谁和我一样用功，谁就会和我一样成功。——莫扎特
凝胶过滤层析的分类
26、机遇对于有准备的头脑有特别的 亲和力 。 27、自信是人格的核心。
28、目标的坚定是性格中最必要的力 量泉源 之一， 也是成 功的利 器之一 。没有 它，天 才也会 在矛盾 无定的 迷径中 ，徒劳 无功。- -查士 德斐尔 爵士。 29、困难就是机遇。--温斯顿．丘吉 尔。 30、我奋斗，所以我快乐。--格林斯 潘。
凝胶过滤层析的分类
26、机遇对于有准备的头脑有特别的 亲和力 。 27、自信是人格的核心。
28、目标的坚定是性格中最必要的力 量泉源 之一， 也是成 功的利 器之一 。没有 它，天 才也会 在矛盾 无定的 迷径中 ，徒劳 无功。- -查士 德斐尔 爵士。 29、困难就是机遇。--温斯顿．丘吉 尔。 30、我奋斗，所以我快乐。--格林斯 潘。