丙型肝炎病毒基因分型ppt课件

Scheme B Cleavage with BstUⅠ 257bp 6a 227bp 197bp
Scheme C Cleavage with HaeⅢ 234bp
104,74bp 160,74bp 160,74bp
1a
1b
2a
2b
3b
4a and 5a
183,74bp 257bp 4a 5a
Cleavage with ApoⅠ
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HCV基因分型方法
测序 型特异性引物PCR分型法
线性探针杂交（InnoLipa)
限制性片段长度多态性分析（RFLP） TRUGENE HCV 5’NC Genotyping Assay
型特异性引物分型法比较(Ohno法和Okamoto法)
TRUGENE HCV 5’NC Kit
HCV基因分型常选用的区域
5’UTR (5’Non-Coding Region)
高度保守 HCV RNA诊断实验的常用区域 有一套良好的多态性特征，因此可用于基因 分型 许多HCV分型商业试剂盒都采用该区进行分 型 TRUGENE HCV 5’NC Genotyping Assay VERSANT HCV Genotyping Assay (LiPA)
Ohno O ,et al. J Clin Microbiol,1997,35:201-207.
线性探针杂交（InnoLipa)
InnoLipa商业试剂盒是欧洲Innogenetics公司(Zwijndre, Belgium) 的产品，其原理为建立在5’UTR基础上的型特异性的探针杂交。 尽管最初该方法的灵敏度比较低，但现在其第2代产品InnoLipaⅡ可 区别1a, 1b, 2a-2c, 3a-3c, 4a-4h, 5a和6a型。
临床工作
常只需将1型和4型与其它基因型相区别，以 决定抗病毒治疗的疗程和利巴韦林的剂量， 因此上述的任何一种方法均可以采用。
NIH Consensus Statement on Management of Hepatitis C: 2002.
临床工作
• 目前常用的基因型检测方法（RFLP, Inno-LiPA, Trugene) 通常建立在5’非编码区，因为该区序 列保守，检测灵敏度高，是HCV RNA诊断实验 的常用区域。
1-21 304-324 28-48 264-284 8,220-8,240 8,657-8,675 8,236-8,258 8,596-8,616
+ + + +
Outer
Inner
NS5BOuterIner中国11个城市258例样品的HCV基因分型结果
城市
1a 克拉玛依 长春 延边 沈阳 辽宁朝阳 北京 常州 上海 西安 1 5 1 1 3 1b 7 10 12 24 10 20 5 15 24 4 8 3 1 1 1 1 10 1 1 3 2 2 1 2 2 1 17 2a 2b 基因型 3a 3b 6a 1b/1a 1 1 1 2 3 3 1b/2a 11(4.3) 16 (6.2) 43(16.7) 33 (12.8) 17(6.5) 26 (10.1) 8 (3.1) 17 (6.5) 39 (15.1)
Scheme A Cleavage with BsrBⅠ,HinfⅠand HaeⅡ 166/169 and 91bp Genotype 1a, 1b and 6a 257bp 127 and 91bp Genotype 3b,4a and 5a 93 and 91bp Genotype 3a
Genotype 2a and 2b
HCV NS5B区 各亚型间基因差异较大 扩增效率较低 若成功扩增，序列分析可区别 HCV各亚型。
应选择HCV基因组中的哪个区进行分型?
应选择何种分型方法?
在HCV分型中应采用何种方法，主要取决于实验 室的现有条件以及分型的目的。
如果需要区分所有亚型，或者鉴别新亚型的存在， 那么就必须进行测序以及进化树分析。
5’UTR
P1 R1 P2 R2 SF2 NS5-2 NS5-1 NS5-4
GGCGACACTCCACCATAGATC GGTGCACGGTCTACGAGACCT CTGTGAGGAACTACTGTCTTC CCCTATCAGGCAGTACCACCA CCCTATGGGCTTCTCATATGA GATGTTATCAGCTCCAGGT TATGACACCCGCTGTTTTGACTC CCTGGTCATAGCCTCCGTGAA
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丙型肝炎病毒基因分型
丙型肝炎病毒基因分型概况
HCV的基因型/亚型
6个型，68个亚型
HCV的基因型/亚型
• • • • • • 1a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m 2a, b, c, d, e, f, g, h, i, k, l, m 3a, b, c, d, e, f, g, h, i, k 4a, c, d, e, f, g, h, k, l, m, n, o, p, q, r, s, t 5a 6a, b, d, f, g, h, i, j, k, l, m, n
HCV不同基因型5’非编码区酶切位点分析
HCV不同基因型5’非编码区酶切位点分析
HCV不同基因型5’非编码区酶切位点分析
HCV 5’非编码区ABC程序分型法电泳模式图
5’UTR和NS5B区扩增引物
Set Name Primer sequence (5’–3’) Positiona Sense Usage
流行病学调查（需确定亚型）：
扩增，测序：
core/E1区(nt869-1292之间≥90％的序列,H77,AF009606) NS5B区(nt8276-8615之间≥ 90％的序列,H77,AF009606)
进化树分析：
多种替代模式计算的邻近连接法(neighbor-joining)和不加 权配对组算法 (UPGMA)； 最大简约法(parsimony)； 最大可能性法(maximum likelihood)； 中任一种方法进行进化树分析以确定基因型。
• 在临床工作中，对5’UTR进行分型的RFLP, Inno-LiPA, Trugene分型都可以满足分型的需要， 为制定治疗方案和判断预后提供指导。
丙型肝炎病毒5’非编码区ABC程序
复合酶切分型法
HCV 5’非编码区ABC程序复合酶切分型法流程图
HCV 5’UTR gene
Second PCR product=257bp