酶切注意事项及问题

一、建立一个标准的酶切反应

目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。通常,一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。

二、选择正确的酶

不言而喻,选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物.假设一个GC含量50％的DNA链,一个识别4个碱基的酶将平均在每44（256）个碱基中切割一次;而一个识别6个碱基的酶将平均在每46(4096）碱基切割一次.内切酶的产物可以是粘端的（3’或5’突出端)，也可以是平端的片段。粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。相关信息参见目录的Compatible Cohesive Ends And Recleavable Blunt Ends一文。

三、酶

内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上.酶应当是最后一个被加入到反应体系中(在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。酶的用量视在底物上的切割频率而定。例如,超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超过1U/μg的酶才能被完全切割.参见目录第244和264之”切割质粒DNA”和"包埋法切割DNA"。

四、 DNA

待切割的DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污染,以免干扰酶的活性。DNA的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素。关于甲基化的内容,参见第252页至253页之甲基化相关内容。

五、缓冲液

对于每一种酶NEB都提供相应的最佳缓冲液,可保证几乎100％的酶活性。使用时的缓冲液浓度应为1X。有的酶要求100μg/ml的BSA以实现最佳活性。在这种情况下，我们也相应提供100X的BSA(10mg/ml)。不需要BSA的酶如果加了BSA也不会受太大影响。

六、反应体积

内切酶活力单位的定义是：1小时内，50μl反应体积中，降解1μg的底物DNA所需的酶为一个活力单位。因此酶：DNA的反应比例可以由此确定。较小的反应体积更容易受到移液器误差的影响.为了将甘油的浓度控制在5%以下，要注意酶的体积不要超过总体积的10％（一般酶都贮存于50％的甘油中）.

七、混合

这是非常重要然而常常被忽略的一步。想要反应完全,必须使反应液充分混合。我们推荐用枪反复吸取混合,或是用手指轻弹管壁混合,然后再快速离心一下即可。注意：不可振荡！

八、反应温度

大部分酶的反应温度为37°C；从嗜热菌中分离出来的内切酶则要求更高的温度。一般为50-65°C不等。参看第244页 Activity of thermophiles at 37°C。

九、反应时间

1酶活单位的定义时间为1小时。如果加入的酶较多，可以相应地缩短反应时间；反之，如果加入的酶量较少，也可以延长时间以使反应达到完全.参见第241页酶在反应中的存活时间。

十、终止反应

如果不进行下一步酶切反应，可用终止液来终止反应.在NEB我们使用如下反应终止液：50%的甘油，50mM EDTA（pH8。0），和0.05%溴酚蓝（10μl/50μl反应液）。如果要进行下一步酶切反应,可用热失活法终止反应（65°C或85°C，20分钟)。热失活并不能适用于所有的酶，详情参见第240页热失活表。此外，酚/氯仿抽提也可以用于终止反应。

十一、贮存

大部分酶应贮存于—20°C.少部分酶则须在-70°C长期保存。详情请参见相关酶的DA TA SHEET 或目录相关部分。10X BUFFER 和100X BSA于-20°C保存。BSA不能与NEBuffer混合后保存，否则将会出现BSA沉淀。

十二、稳定性

每隔1-2个月都会对所有的酶有一个活性检测；最近的一次检测结果将被贴在售出的每一管酶上。通过三十多年来的经验，我们发现大部分酶在推荐的保存缓冲液里在-20°C条件下十分稳定.高于—20°C条件下稳定性将有所降低。

十三、对照反应

如果发现您的DNA底物不能被成功切开，可以进行对照实验以查明原因。具体方法如下：

将不加内切酶的底物DNA(待切底物）与加入了内切酶的对照DNA（有多个已知酶切位点）同时进行反应。若实验结果表明底物DNA降解，则说明DNA在纯化过程中或反应液里引入了核酸酶污染；若实验结果发现底物DNA保持完整，而对照DNA被成功切开,则可以排除酶质量的原因,此时可以将对照DNA和待切底物DNA混合起来再次进行反应，以确定样品中是否有抑制剂。如果有抑制剂存在（通常是盐、EDTA或酚）,则混合物里的对照DNA也无法被切开。

实验过程中的注意事项：

1、首先看是单酶切还是双酶切。要是双酶切要注意这两种酶是否有共用的

Buffer。

2、酶的用量最好在40U单位以上,尽可能酶切充分。

3、酶的用量不要超过总体积的1/10。

4、同时看是否需要用到BSA。

5、酶切时间不要低于2个小时.

6。酶切进行时，注意酶切温度是否稳定地保持在最佳温度;酶切时间根据厂家推荐,一般的酶1—2h即可，特别难酶切的时间可放长，但并不是越长越好，时间太长易引发部分酶的星号活性，造成酶切失败。NEB的酶我用过半小时内酶切即可彻底。

酶反应操作时注意事项:

1、基因工程操作是微量操作,试剂昂贵,要细心,准确地配制所用的试剂。DNA样品和酶用量体积都很少，要注意吸样量的准确性,酶用量不能过多，因酶通常保存在一定浓度的甘油内，酶用量取得过多，甘油浓度加大反而抑制酶的反应，通常不应超过1/10 酶反应总体积。

2、当塑料小管在一定温度下水浴进行酶反应时，盖子必须盖得严密，防止水气出入，影响总体积。

3、酶反应的一切器皿，都要以重蒸水清洗,消毒灭菌,严防其它酶的污染。

4、要注意酶反应时，加样顺序,最后加酶液，混匀，操作过程中，一旦吸取好酶溶液，酶应立即放回—20℃冰箱中，防止酶失活。

酶的星号活性

Ⅱ类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是这种特异性受特定条件的限制，即在一定环境条件下表现出来的特异性。条件的改变，限制酶的特异性就会松动，识别的序列和切割都有一些改变，改变后的活性通常称第二活性，而将这种因条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示,因此第二活性又称为星号活性。

概括起来，诱发星活性的因素有如下几种：

(1）高甘油含量(>5％， v／v）；

(2)限制性内切核酸酶用量过高(>100U／ugDNA);

(3）低离子强度（〈25 mmol／L）；

(4)高pH(8。0以上)；（5)含有有机溶剂，如DMSO，乙醇等；

（6)有非Mg2+的二价阳离子存在（如Mn2+，Cu2+，C02+，Zn2+等