分子克隆(亚克隆)实验总体流程详解

一、扩增

1、LB培养基5ml；

2、抗生素：1000X，即1:1000比例。种类根据细菌抗性决定；

3、菌体：看浑浊度，1%-5%，取500ul于其中；

4、37℃摇床220转，过夜，12-16h。

二、纯化质粒DNA

1、1.5ml离心管，编号一定要写清楚；

2、加满离心管，离心12000xg. 1min，弃上清。取三次；

3、加Buffer S1 200ul，溶解沉淀，5min；

4、加S2（用完立刻盖紧瓶盖，以免CO2中和Buffer中的NaOH）200ul，不能剧烈（以免基因组DNA的污染），上下翻转4-6次，直至形成透亮的溶液，时间少于5min。目的是使蛋白包裹基因组DNA，游离质粒；

5、加S3 280ul，温和充分翻转混合6-8次，12000xg，10min(此步呈白色絮状)；

*备注：S1：S2：S3=5:5:7

6、取上清加入制备管（置于2ml离心管），12000xg，1min，去滤液；

7、加Buffer W1 500ul，12000xg，1min，弃滤液；

8、加Buffer W2 700ul，12000xg，1min，弃滤液。重复一遍；

9、空管离心12000xg，1min；

10、制备管移入新的1.5ml离心管，管膜中加60-80ul去离子水，静置1min，12000xg，1min。（将去离子水加热至65度，将提高洗脱效率）

四、跑胶回收：sost回收失败

1、2%浓度胶，Loading Buffer如是6X，则加10ul到样品，全部加样到胶孔中。

插入：配胶方法

大块胶60ml；小块胶25ml；

需要配置大块胶、大孔胶；

Agarose 0.6g，TAE60ml，微波中火2min；

趁热但不烫手时加入gold view 0.5ul/25ml；

倒入槽里。

2、跑胶：单位厘米/5-10v。所以大槽25cm，150v即可。小槽100v即可。

3、紫外灯下切胶，纸巾吸进液体，计算凝胶重量（1mg=1ul）；

4、加3个凝胶体积的凝胶结合液DB（0.1ul视为100ul；如凝胶浓度大于2%，则加入6倍体积溶胶液；凝胶块最大不能超过400ul，超过可多个离心柱）；

5、56℃水浴放置10分钟，至完全溶解；

6、每100mg最初的凝胶重量加入150ul的异丙醇，震荡混匀，回收大于4Kb的片段可不加异丙醇，加入反而降低回收效率；

7、将上一步所得溶液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），12000rpm，30-60s，弃液体；

8、加700ul漂洗液WB，12000rpm，1min，弃废液；

9、加500ul漂洗液WB，12000rpm，1min，弃废液；

10、空离心2min，弃废液；

11、晾干乙醇，以免抑制下游反应；

12、将吸附柱放入新的1.5ml离心管，加入50ul（最少30ul）洗脱缓冲液EB或者去离子水（65-70水浴加热效果更好，或将得到的溶液重新加入离心柱可增加洗脱量）；

五、连接体系：

六、转化

1、加感受肽：连接产物=10:1，冰浴30min；

2、激活：42℃，90s，不能震动；

3、加500ul LB培养基；

4、37℃，150转摇床，45min；

5、铺板子

七、检测

1、细菌长势良好，对照组不长；

2、酶切检测：

（1）1ml LB体系：1ml LB培养基+1ul抗生素于1.5mlEP管中；

（2）15ul Pcr体系：7.5ul Mix（2X）

5.5ul water

1ul上游引物

1ul下游引物

（3）用枪头挑培养皿中的菌体，吹打于1ml LB体系中，再吹打于15ul Pcr体系中；（4）1ml LB体系放入37℃摇床，150rpm；

显示4°/4°时，结束。

（6）Pcr显示有结果，则将相对应的1ml LB体系扩增，见步骤一、扩增；

（7）重复步骤二、纯化质粒DNA；三、酶切体系；四、跑胶但不回收；

（8）有结果则证明之前的酶切、连接、转化成功。