家蚕肠道细菌的多样性分析

收稿日期：2015－02－06 接受日期：2015－03-19 资助项目：国家自然科学基金项目（No. 31072085）， 国家重大基础研究计划“973”项目（No. 2012CB114600）。 共同第一作者信息：许刚 (1974-)，男，高级农艺师。
Tel: 0510-83216688, E-mail: xwfg202@163.com 孙振丽：(1990-)，女，硕士研究生。 E-mail：zhenlisun@163.com 通信作者信息：贡成良，教授，博士生导师。 Tel/Fax: 0512-65880183, E-mail: gongcl@suda.edu.cn
Arthrobacter 、 Enterobacter 、 Microbacterium 、 Staphylococcus 、 Brevibacterium, Cellulo simicrobium、Enterococcus、Brachybacterium、Corynebacterium 和其他的一组。相辉等[6]采 用基于 16S rDNA 的变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)和 16S rDNA 文库序列分析的手段, 研究了家蚕普通寡食性品系 C108 和广食性品系 SCN2 幼虫中 肠 内 的 细 菌 群 落 多 样 性 ， 共 发 现 41 种 细 菌 系 统 发 育 型 (phylotype), 大 多 数 属 于 Proteobacteria, 其次 是 Lactobacillales，肠球菌属 Enterococcus 是优势菌群 , 栖热菌属 Thermus 是次优势菌群，无桑人工饲料喂养条件下 SCN2 品系中肠内还出现了新的次优势菌 葡萄球菌(Staphylococcus)，并发现不同发育阶段肠道细菌组成存在差异。向芸庆等[7]采用纯 培养分离检测技术和 16S rDNA 序列测定及系统发育分析方法，从柘叶与桑叶饲养家蚕幼虫 的肠道中可分离到共有的优势菌群有短波单胞杆菌属 Brevundimonas、寡养单胞菌属 Stenotrophomonas、肠杆菌属 Enterobacter 和葡萄球菌属 Staphylococcus 4 个类群，除此之外， 还从桑叶饲养家蚕的肠道中检索到的优势菌群还有气单胞菌属 Aeromonas、短杆菌属 Brevibacterium、柠檬酸杆菌属 Citrobacter、埃希氏菌属 Escherichia 和克雷伯氏菌属 Klebsiella 5 个类群,从柘叶饲养家蚕肠道中还可以检索到的优势菌群仅有假单胞菌属(Pseudomonas)和 土壤杆菌属(Agrobacterium) 2 个类群。
Key words: Bombyx mori; Intestinal tract；Bacterial community；Diversity；Gender difference
家蚕肠道中的微生物的种类、数量不仅影响蚕体对营养物质的吸收与转化，而且影响蚕 体的健康性 [1]。正常情况下家蚕肠道微生物类群和多样性保持着一种共生和拮抗的平衡状 态，而当家蚕肠道微生物的异常繁殖则可导致家蚕细菌性肠道疾病[2]，在感染微孢子虫 (Nosema bombycis)的家蚕幼虫中肠中，Enterococci 菌的数量明显增加[3]。因此，研究家蚕肠 道微生物种群及其动态变化对改善蚕体的营养吸收和体质有重要意义。上世纪 90 年代，国 内的研究者开展了家蚕肠道微生物的研究。孙雪奇等[4]通过对不同发育阶段肠道消化液的稀 释纯培养，分离到 16 个属 253 种细菌株；鲁兴萌等[2]利用 API 20 STREP (V. 5.0) 系统从健 康家蚕幼虫和蛾的肠道中分离到 89 种 Enterococcus。采用传统的简单纯培养方法鉴定家蚕 的肠道微生物种类，往往由于只能分离到小部分能在体外培养的优势细菌，而一些难以在体
中图分类号
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文献标识码 A
文章编号
Intestinal Bacterial Diversity of Silkworm, Bombyx mori
Xu Gang1,2 Sun Zhenli1 Hu Xiaolong1 Xue Renyu 1 Gong Chengliang1*
(1College of Basic Medicine & Life Science, Soochow University, Suzhou Jiangsu 215123, China;2 Jiangsu Province Silkworm Eggs Office, Wuxi Jiangsu 214151, China)
外培养的有优势的菌种和大部分低丰度菌种则不能被分离鉴定，由此获得的研究结果信息不
能全面反映家蚕肠道微生物的种群数量和多样性。随着现代分子生物学技术的发展，近几年
应用分子生物学技术快速和定性、定量研究家蚕肠道微生物种群的多样性已经成为热点，特 别是利用 16S rRNA 基因序列已成为一个检测、鉴定家蚕肠道细菌的有力工具。袁志辉[1]提 取家蚕肠道细菌的宏基因组 DNA，利用通达扩增出的 16S rDNA 的限制图谱对细菌进行鉴 定，发现肠道细菌在分类上主要属于节细菌属 Arthrobacter、 乳杆菌属 Lactobacillus、假单 胞菌属 Pseudomonas、 埃希氏菌属 Escherichia、微球菌属 Micrococcus、芽孢杆菌属 Bacillus 和 葡萄球菌属 Staphylococcus 。田贞华等[5]用类似的方法从 4 龄家蚕幼虫的中肠内容物中分 离到 14 种基因型的 109 个菌株，所有分离到的菌可分类到 10 个属，它们是 Bacillus、
家蚕肠道细菌的多样性分析
许 刚 1,2 孙振丽 1 胡小龙 1 薛仁宇 1 曹广力 1 贡成良 1* 1
（1 苏州大学基础医学与生物科学学院，江苏 苏州 215123；2 江苏省蚕种所，江苏无锡 214151）
摘 要 家蚕肠道菌群与蚕体对营养物质的消化吸收和健康性密切相关。为了解家蚕肠道细菌的多样性及雌 雄个体间肠道细菌总群的差异，通过应用 454 焦磷酸测序技术检测细菌 16S rRNA 基因序列的方法分析 5 龄第 3 天家蚕雌、雄幼虫肠道内容物中的细菌总群，共发现 5 578 个分类单元(operational taxonomic units ), 包 括 14 个门、21 个纲、30 个目、71 个科、120 个属的细菌，雌、雄个体在上述分类阶元共有的肠道细菌种 类分别为 8、9、20、38 和 46。在属水平上对细菌种群构成分析显示，雄蚕中主要优势细菌为代尔夫特菌 属 Delftia、橙单胞菌属 Aurantimonas、肠球菌属 Enterococcus 、嗜糖假单胞菌属 Pelomonas、青枯菌属 Ralstonia、台湾温单胞菌属 Tepidimonas、假单胞菌属 Pseudomonas、阿斯普罗单胞菌属 Aspromonas、甲基 杆菌属 Methylobacterium 和葡萄球菌属 Staphylococcus；雌蚕中主要优势细菌为代尔夫特菌属 Delftia、 橙 单胞菌属 Aurantimonas、假单胞菌属 Pseudomonas、 嗜糖假单胞菌属 Pelomonas、佩特罗菌属 Petrobacter、 肠球菌属 Enterococcus、 台湾温单胞菌属 Tepidimonas、狭义的梭菌属 Clostridium sensu stricto、 阿斯普罗 单胞菌属 Aspromonas。其中，雄蚕肠道中有 23 个属的细菌的丰度是雌蚕的 1.5 倍以上，在雌蚕肠道中有 7 个属的细菌的丰度是雄蚕的 1.5 倍以上，表明雌雄家蚕肠道细菌总群的组成和比例存在明显差异。基于 16S rRNA 基因序列的聚类分析结果显示， 家蚕肠道中的优势细菌属可分为 2 个大类。这些研究结果为理解家 蚕肠道细菌的多样性提供了新的数据，为探讨雌蚕和雄蚕的经济性状差异提供了新线索。 关键词 家蚕；肠道；细菌种群；多样性；性别差异
Abstract: The intestinal flora is involved in digestion and absorption of nutrients, and health of silkworm, Bombyx mori. To understand the gut bacterial diversity of silkworm and difference of intestinal flora between the male and female silkworm, bacterial communities in the intestinal contents of the 3 day of fifth instar larvae were investigated based on16S rRNA gene sequences which detected through 454 pyrosequencing technology, and 5578 operational taxonomic units including 14 phylum, 21 class, 30 order, 71 family and 120 genus was found, in which 8 phylum, 9 class, 20 order, 38 family and 46 genus were shared by the male and female silkworm. The analysis of bacterial composition in genus level indicated that the predominant bacteria in the male were Delftia, Aurantimonas, Enterococcus, Pelomonas, Ralstonia, Tepidimonas, Pseudomonas, Aspromonas, Methylobacterium and Staphylococcus, and in the female were Delftia, Aurantimonas, Pseudomonas, Pelomonas, Petrobacter, Enterococcus, Tepidimonas, Clostridium sensu strict and Aspromonas. The abundance of 23 genus in the male were more than 1.5 times compared to that in the female, while the abundance of 7 genus in the female were more than 1.5 times compared to that in the male, suggesting that there was obvious difference in the composition and abundance of bacteria between the male and female. Cluster analysis based on the 16S rRNA gene sequences showed that the predominant bacteria in the gut could be divided into two groups. These findings provided a novel data for understanding the diversity of gut bacterial diversity of silkworm and new clue for exploring the difference of economic traits of the male and female silkworm.