抑菌效力检查法
抑菌效力检查法---原理和意义汇总
概述 抑菌效力检查的原理和意义
一、异常毒性的概念
（一）抑菌效力检查的原理 抑菌效力检查是采用微生物法进行，供 试品中含有的抑菌剂会对加入其中的微生物 产生抑制作用，时间越长抑制作用越强，存 活的微生物数量越少。
（二）抑菌效力检查的意义
添加抑菌剂是药物制剂防腐，保障 药品质量的一项重要措施，抑菌效力检查 是用于测定无菌及非无菌制剂的抑菌活性 。因此，抑菌效力检查对于检测、评价和 保障药品质量意义重大。
第一，在药品的研发阶段，无论是添加抑
菌剂，还是药物本身具有抗菌活性，都应 通过抑菌效力检查确认其抗菌效力。 第二，在药品的生产阶段，在药物制剂的 制备过程中要完全防止微生物污染是很困 难的，通过加入适当的抑菌剂可以有效达 到抑菌防腐的目的。抑菌效力检查可以帮 助筛选和确定抑菌剂及其使用浓度。
第三，在药品的贮存阶段，抑菌剂的效力
可能因贮存时间、贮存条件、药品包装材 料等因素发生变化，抑菌效力检查可以检 查成品制剂的抑菌效力在有效期内是否发 生变化。
对于加入抑菌剂的药物制剂，在生产 与贮存期间应该符合《中华人民共和国药 典》（2015年版）抑菌效力检查法（通பைடு நூலகம்则1121）的有关要求。
《中国药典》2015版-抑菌效力检查法
匀，凝固，置 30～35℃培养不超过 3 天，计数；分别接种不大于 100cfu 的白色
念珠菌、黑曲霉的菌液至沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌平行制备 2 个平皿，
混匀，凝固，置 20～25℃培养不超过 5 天，计数；同时，用对应的对照培养基
替代被检培养基进行上述试验。
结果判定 若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上菌落平均数
的 70%，且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致，判该培养基的适用性检查
符合规定。
抑菌效力测定
菌种 抑菌效力测定用菌种见表 1，若需要，制剂中常见的污染微生物也 可作为试验菌株。
菌液制备 新鲜菌体培养见表 1，铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠 埃希菌、白色念珠菌若为琼脂培养物，加入适量的 0.9%无菌氯化钠溶液将琼脂 表面的培养物洗脱，并将菌悬液移至无菌试管内， 然后用 0.9%无菌氯化钠溶液 冲洗并制成每 1ml 含菌数约为 108cfu 的菌悬液；若为液体培养物，离心收集菌 体，用 0.9%无菌氯化钠溶液冲洗并制成每 1ml 含菌数约为 108cfu 的菌悬液。取 黑曲霉的新鲜培养物加入 3～5ml 含 0.05％（ml/ml）聚山梨酯 80 的 0.9%无菌氯 化钠溶液，将孢子洗脱，然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，加入适 量的含 0.05％（ml/ml）聚山梨酯 80 的 0.9%无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含孢子 数 108cfu 的孢子悬液。测定 1ml 菌悬液中所含的菌数。
本试验方法和抑菌剂抑菌效力判断标准用于包装未启开的成品制剂。 培养基
培养基的制备 胰酪大豆胨液体培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、 沙氏葡萄糖琼脂培养基 照无菌检查法（通则 1101）制备。 培养基的适用性检查 抑菌效力测定用培养基应进行培养基的适用性检查，包括成品培养基、由脱 水培养基或按处方配制的培养基均应检查。 菌种 试验所用的菌株传代次数不得超过 5 代（从菌种保藏中心获得的冷 冻干燥菌种为第 0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株 的生物学特性。培养基适用性检查的菌种及新鲜菌体培养见表 1。
《中国药典》2020年版通则“有抑菌效力检查法”
活 不得低于 50%。
低于 70%。
菌
数
测
定
定义：
抑菌效力检查法：抑菌效力检查法系用于 测定无菌及非无菌制剂的抑菌活性。 目的：
检查制剂中防腐剂的量能否达到防止制剂 在正常贮藏或使用过程中由于微生物污染和繁 殖，使药物变质而对使用者造成危害。
用于指导生产企业在研发阶段制剂中抑菌 剂种类和浓度的确定。
验应无菌生长. 结果判断：试验菌的回收率不得低于70%（50%）
J
T
D
B
H
J
T
D
B
H
20ml 供试液
阴性 对照
应以稀释剂代替供试品进行阴性对照试验，阴性对 照试验应无菌生长.
适用性
试验菌的回收率不得低于70%（50%）
检查结果判断
确定存活菌计 数测定方法
取本品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至 100ml，使供试品分散均匀，制成1:10的供试液，取1:10 的供试液1ml，置pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9ml中， 即为1:100的供试液。
抑菌剂的种类
尼泊金类：尼泊金甲酯、尼泊金乙酯（对羟基 苯甲酸乙酯）、尼泊金丙酯。
醇类：苯甲醇、乙醇、苯乙醇和三氯叔丁醇等。 有机酸类：苯甲酸、三梨酸和脱氢乙酸等。 酚类：苯酚、 麝香酚和氯甲酚等。 铵类：新吉尔灭（苯扎溴氨） 、吉尔灭（苯 扎氯氨） 等。 其他：洗必泰和硫柳汞等。
安全性
有效性
供试品接种
供试品接种
J
T
D
B
H
存活菌数测定
结果判定
减少的lg值
6h
24h
7d
14d
28d
A 细菌
B
抑菌效力检查法-2015中国药典
抑菌效力检查法-2015中国药典录入时间:2014-9-16 9:44:02 来源：国家药典委员会抑菌剂是指抑制微生物生长的化学物质，有时也称防腐剂。
抑菌效力检查法系用于测定灭菌及非灭菌制剂的抑菌活性，以评价最终产品的抑菌效力，同时也可用于指导生产企业在研发阶段制剂中抑菌剂浓度的确定。
如果药物本身不具有充分的抗菌效力，那么应根据制剂特性（如水溶性制剂）添加适宜的抑菌剂，以防止制剂在正常贮藏或使用过程中可能发生的微生物污染和繁殖使药物变质而对使用者造成危害，尤其是多剂量包装的制剂。
在药品生产过程中，抑菌剂不能用于替代药品生产的GMP 管理，不能作为非无菌制剂降低微生物污染的唯一途径，也不能作为控制多剂量包装制剂灭菌前的生物负载的手段。
所有抑菌剂都具有一定的毒性，制剂中抑菌剂的量应为最低有效量。
同时，为保证用药安全，成品制剂中的抑菌剂有效浓度应低于对人体有害的浓度。
抑菌剂的抗菌效力在贮存过程中有可能因药物的成分或包装容器等因素影响而变化，因此，应验证成品制剂中的抑菌剂效力在效期内不因贮藏条件而降低.本试验方法和抑菌剂抑菌效力判断标准用于包装未启开的成品制剂培养基培养基的制备胰酪大豆胨液体培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基?? 照无菌检查法（通则1101）制备。
培养基的适用性检查抑菌效力测定用培养基应进行培养基的适用性检查，包括成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应检查。
菌种试验所用的菌株传代次数不得超过5 代（从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
培养基适用性检查的菌种及新鲜菌体培养见表1。
菌液制备取表1 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物用pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液。
取表2 黑曲霉的新鲜培养物加入3～5ml 含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80 的pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
抑菌试验方法总结用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称
抑菌试验方法总结用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验。
通过抑菌实验，可以测定一个药物的最低抑菌浓度，用以评价该药物的抑菌性能，这是抗菌药物的最基本的药效学数据。
主要方法有进行定性测定的扩散法（如抑菌斑试验）和进行定量测定的稀释法（如最低抑菌浓度实验）。
1、定性测定（1）纸片扩散法(disk diffusion test)，K-B法：WHO推荐的全球统一的标准方法。
原理：含有定量抗菌货物的纸睡帖在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。
在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。
质控：标准菌株的抑菌圈直径应落在预期范围内，如果超出该范围，应视为失控而予以纠正。
影响因素：培养基的质量、药敏纸片的质量、接种菌量、试验操作质量、孵育条件、抑菌圈测量工具的精度和质控菌株本身的药敏特性等均能影响试验结果的准确性。
操作方法：按每1000 ml蒸馏水称取Muller-hinton Agar 38 g配备M—H琼脂，按每个平皿(直径9 mm)25 ml进行分装。
将孵育16—24 h的菌种分别接种生理盐水试管中，校正浓度至0.5麦氏标准(相当于1.0×108 CFU／m1)。
用无菌棉签拭蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液后在M—H琼脂表面，均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度，最后沿平板内缘涂抹1周。
平板在室温下干燥3—5 min后用无菌镊子将药物纸片紧贴于琼脂表面．置35℃孵育16 18 h。
记录抑菌圈的直径，实验。
重复10次。
主要用于比较不同抗菌物质，或者通过不同方法提取的同一种物质的效果。
（2）打孔法药敏实验：待M—H平板干后，用无菌棉签蘸取菌液(相当于1.0×108CFU／m1)，在培养基平板上密集划线接种。
白色念珠菌与抑菌效力检查方法
表
类别
产品分类
药品
1 类 注射剂、其他非肠道制剂，包括乳剂、 注射剂、其他非肠道制剂，包括乳剂、 制剂、 耳用 制剂、无菌鼻用制剂及眼用制剂 2 类 局部给药制剂、非灭菌鼻用制剂及用于 局部给药制剂、 黏膜的乳剂 3类 口服非固体制剂（非抗酸制剂） 口服非固体制剂（非抗酸制剂） 4类 非固体抗酸制剂
抑菌剂效力测定 概述 1、抑菌剂效力检查法系用于测定灭菌、 、抑菌剂效力检查法系用于测定灭菌、 非灭菌制剂中抑菌剂的活性， 非灭菌制剂中抑菌剂的活性，以评价最终 产品的抑菌效力， 产品的抑菌效力，同时也可用于指导生产 企业在制剂研发阶段抑菌剂的确定。 企业在制剂研发阶段抑菌剂的确定。 2、如果药物本身不含有充分的抗菌活性， 、如果药物本身不含有充分的抗菌活性， 那么应根据制剂特性（如水溶液制剂） 那么应根据制剂特性（如水溶液制剂）添 加适宜的抑菌剂， 加适宜的抑菌剂，以防止制剂在正常储存 和使用过程中可能发生微生物污染和大量 繁殖尤其多剂量包装的制剂， 繁殖尤其多剂量包装的制剂，避免因药物 微生物污染及对患者造成伤害。 微生物污染及对患者造成伤害。
2、如平板上生长的菌落与上述菌落形态特 、 征相符或疑似，应挑选2～ 个菌落分别接 征相符或疑似，应挑选 ～3个菌落分别接 种至念珠菌显色培养基平板上，培养24～ 种至念珠菌显色培养基平板上，培养 ～ 48小时（必要时延长至 小时）。若平 小时（ 小时）。 小时 必要时延长至72小时）。若平 板上无绿色或翠绿色的菌落生长， 板上无绿色或翠绿色的菌落生长，判供试 品未检出白色念珠菌。 品未检出白色念珠菌。 3、若平板上生长的菌落为绿色或翠绿色， 、若平板上生长的菌落为绿色或翠绿色， 挑取相符或疑似的菌落接种于1%吐温 吐温80 挑取相符或疑似的菌落接种于 吐温 玉米琼脂培养基上，培养24～ 小时 小时。 玉米琼脂培养基上，培养 ～48小时。 取培养物进行染色，镜检及芽管试验。 取培养物进行染色，镜检及芽管试验。
抑菌剂效力测定
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一、概述
抑菌剂效力检查法系用于测定灭菌、非灭菌制剂中抑菌剂的活性，以 评价最终产品的抑菌效力，同时也可用于指导生产企业在制剂研发阶 段抑菌剂的确定。
如果药物本身不含有充分的抗菌活性，那么应根据制剂特性（如水溶 液制剂）添加适宜的抑菌剂，以防止制剂在正常储存和使用过程中可 能发生微生物污染和大量繁殖尤其多剂量包装的制剂，避免因药物微 生物污染及对患者造成伤害。
抑菌剂效力测定
举例
1、氯化钠注射液、碳酸氢钠注射液不含抑菌剂加入菌从初始到 6h就开始无限增加，不具抑菌力，抗病毒口服液从初始到24 h对 数值无变化，72h后明显降低，具一定的抑菌力。
2、呋麻滴鼻液、硫糖铝混悬液、阿昔洛韦滴眼液、鲸脂滴耳液、 洁尔阴洗液从初始值到7天后计算值大于1.0 lg降低值，从初始值 到14天后计算值大于3.0 lg,具较强的抑菌效力。
取白色念珠菌、黑曲霉孢子各50～100cfu，分别注入无菌平皿中， 立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿， 混匀，凝固，置20～25℃培养72小时，计数；
同时，用对应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。
结果判定
被检培养基的菌落数与对照培养基菌落数相比大于70%，菌落 形态大小应与对照培养基上的菌落一致。判该培养基的适用性 检查符合规定。
菌液的制备同控制菌培养基适用性检查
培养基的适用性检查
适用性检查
取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌各50～100cfu，分 别注入无菌平皿中，立即倾注胰酷胨大豆琼脂培养基，每株试验菌 平行制备2个平皿，混匀，凝固，置30～35℃培养48小时，计数；
抑菌剂效力检查法指导原则
抑菌剂效力检查法指导原则抑菌剂效力检查法系用于测定灭菌、非灭菌制剂中抑菌剂的活性，以评价最终产品的抑菌效力，同时也可用于指导生产企业在制剂研发阶段抑菌剂的确定。
如果药物本身不具有充分的抗菌活性，那么应根据制剂特性（如水溶液制剂）添加适宜的抑菌剂，以防止制剂在正常贮藏和使用过程中可能发生的微生物污染和繁殖，尤其是多剂量包装的制剂，避免因药物微生物污染及变质而对患者造成伤害。
在药品生产过程中，抑菌剂不能用于替代药品生产的GMP管理，不能作为非灭菌制剂降低微生物污染的唯一途径，也不能作为控制多剂量包装制剂灭菌前的生物负载的手段。
所有抑菌剂都具有一定的毒性，制剂中抑菌剂的量应为最低有效量。
同时，为保证用药安全，最终包装容器中的抑菌剂有效浓度应低于对人体有害的浓度。
要求具有抗菌活性的制剂（参见制剂通则），不管是添加的抑菌剂，还是药物本身具有抗菌活性，在药物研发阶段，均应确认其抗菌效力。
抑菌剂的抗菌效力在贮存过程中有可能因药物的成分或包装容器等因素影响而提高或降低，因此，应验证最终容器中的抑菌剂效力在效期内不因贮藏条件而降低。
本试验方法和抑菌剂抑菌效力判断标准用于包装未启开的成品制剂。
产品分类需要进行本试验的药品分为四类（见表1），以便标准的制定和执行。
表1 产品分类类别 药品1 类 注射剂、其他非肠道制剂，包括乳剂、耳用制剂、无菌鼻用制剂及眼用制剂2 类 局部给药制剂、非灭菌鼻用制剂及用于黏膜的乳剂3 类 口服制剂（非抗酸制剂）4 类 抗酸制剂培养基培养基的制备1.胰酪胨大豆肉汤培养基酪蛋白胨 17.0g 磷酸二氢钾 2.5g大豆木瓜蛋白酶消化物 3.0 g 氯化钠 5.0g葡萄糖 2.5g 水 1000ml 除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调pH约7.0，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH使灭菌后为7.3±0.2，分装，灭菌。
2. 胰酪胨大豆琼脂培养基除上述胰酪胨大豆肉汤培养基的处方和制法，加入14.0g琼脂，调pH使灭菌后为7.3±0.2，分装，灭菌。
中国药典2015年版抑菌效力检查法解读
中国药典2015年版抑菌效力检查法解读我国药典2015年版抑菌效力检查法解读1. 引言我国药典是我国用于规范药品质量标准的重要法律文件，其中关于抑菌效力检查法的规定对药品抑菌效力的检测至关重要。
本文将深入解读我国药典2015年版关于抑菌效力检查法的相关内容，旨在帮助读者全面理解抑菌效力的检测方法和标准。
2. 抑菌效力检查法的概述抑菌效力是指药品在规定条件下对微生物的抑制或杀灭作用，是评价药品杀菌能力的重要指标之一。
我国药典2015年版包含了对于抑菌效力的检查方法和标准，主要涉及了试验菌种的选择、培养基的配制、药品浓度的确定等方面的内容。
3. 抑菌效力检查法的步骤我国药典2015年版对抑菌效力的检查方法包括了以下几个关键步骤：（1）试验菌种的选择：根据药品的适用范围和目的，选择合适的试验菌种进行检测。
（2）培养基的配制：按照规定的配方和方法制备含有试验菌种的培养基。
（3）药品浓度的确定：确定药品的最小抑菌浓度，即在不同浓度下对试验菌种的抑菌效果。
（4）培养时间和条件：根据试验需要，在规定的时间和条件下进行培养。
（5）结果的判定：根据试验的结果判定药品的抑菌效力符合标准要求。
4. 抑菌效力检查法的标准我国药典2015年版对抑菌效力检查的标准包括了对于不同药品的抑菌效力的具体要求，主要从抑菌率、抑菌效力等方面进行了详细的规定。
这些标准不仅明确了药品的抑菌效力要求，也为药品质量的检测提供了具体的操作指南。
5. 个人观点和理解抑菌效力检查法是保障药品质量安全的重要环节，有效的抑菌效力检测有助于保障患者用药安全。
我国药典2015年版对于抑菌效力的检查方法和标准的详细规定，为药品生产企业和药品监管部门提供了具体的操作指南。
在实际操作中，需要严格按照药典要求进行操作，确保检测结果的准确性和可靠性。
6. 总结我国药典2015年版关于抑菌效力检查法的相关内容对于药品抑菌效力的检测提供了明确的方法和标准，有助于规范药品质量标准，保障患者用药的安全。
中国药典2015年版抑菌效力检查法解读
文章标题：深度解读我国药典2015年版抑菌效力检查法一、概述在医药领域，抑菌效力检查是一项至关重要的工作，它能够评估药品抑菌的能力，保障药品的安全有效性。
我国药典2015年版包含了丰富的抑菌效力检查方法，为药品检验提供了重要的参考依据。
本文将对我国药典2015年版抑菌效力检查法进行深度解读，帮助读者全面理解抑菌效力检查的相关内容。
二、抑菌效力检查概述1.1 抑菌效力检查的定义抑菌效力检查是指对药品中的抗菌成分的抑菌能力进行定量或半定量评价的检查过程，它旨在评估药品对细菌的抑制或杀灭作用。
1.2 抑菌效力检查的重要性抑菌效力检查是确保药品安全有效性的重要环节，通过科学的检查方法评估药品的抗菌能力，为药品的研发和生产提供了重要的参考依据。
三、我国药典2015年版抑菌效力检查法解读2.1 抑菌效力检查的基本原则根据我国药典2015年版，抑菌效力检查法应遵循以下基本原则：- 选择适当的试验菌株- 确定试验菌的合适培养基和生长条件- 使用适当的抑菌方法进行检查- 对试验结果进行准确可靠的评价2.2 抑菌效力检查的具体步骤按照我国药典2015年版的规定，抑菌效力检查应按照以下步骤进行：- 试验前的准备工作- 培养试验菌株- 进行抑菌试验- 试验结果的判定和评价2.3 抑菌效力检查方法的分类我国药典2015年版对抑菌效力检查方法进行了分类，主要包括物理法、化学法和生物学方法。
不同的方法适用于不同类型的药品，且各自具有特定的操作规范和技术要求。
四、个人观点和理解抑菌效力检查对于药品的研发和生产至关重要，它直接关系到药品的质量和安全性。
我国药典2015年版提供了丰富的抑菌效力检查方法，为医药行业提供了重要的技术支持和指导。
在未来的工作中，我们需要更加深入地理解和应用这些方法，不断提高我国药品的质量水平。
五、总结与回顾本文对我国药典2015年版抑菌效力检查法进行了全面解读，介绍了抑菌效力检查的基本原则、具体步骤和方法分类，并进行了个人观点和理解的共享。
抑菌试验
抑菌试验：用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验。
通过抑菌实验,可以测定一个药物的最低抑菌浓度,用以评价该药物的抑菌性能,这是抗菌药物的最基本的药效学数据。
主要方法有进行定性测定的扩散法（如抑菌斑试验）和进行定量测定的稀释法（如最低抑菌浓度实验）。
1.常量肉汤稀释法抗菌药物贮存液制备1.1.1.抗菌药物贮存液制备抗菌药物贮存液浓度不应低于1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍于最高测定浓度。
溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。
抗菌药物直接购自厂商或相关机构。
所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。
例如：需配制100 ml浓度为1280μg/ml的抗生素贮存液，所用抗生素为粉剂，其药物的有效力为750μg/mg。
用分析天平精确称取抗生素粉剂的量为182.6 mg。
根据公式计算所需稀释剂用量为：（182.6 mg×750μg/ml）/1280μg/ml=107.0ml，然后将182.6 mg 抗生素粉剂溶解于107.0ml稀释剂中。
制备抗菌药物贮存液所用的溶剂和稀释剂见表5。
配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-60℃以下环境，保存期不超过6个月。
药敏试验用抗菌药物浓度范围1.1.2.药敏试验用抗菌药物浓度范围根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。
培养基1.1.3. 培养基NCCLS推荐使用Mueller-Hinton（MH）肉汤，pH7.2~7.4。
需氧菌及兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。
在测试葡萄球菌对苯唑西林的敏感性时，应在肉汤中加入2%（W/V）氯化钠，按制造厂家的要求配制需要量的MH肉汤。
嗜血杆菌属菌使用HTM肉汤，肺炎链球菌和其它链球菌使用含2%~5%溶解马血的MH肉汤。
接种物的制备1.1.4.接种物的制备有2种方法配制接种物，一是细菌生长方法，用接种环挑取形态相似待检菌落3-5个，接种于4-5ml的水解酪蛋白（MH）肉汤中，35℃孵育2-6h。
中国药典2015版抑菌效力检查法
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Question
National Institutes for Food and Drug Control
细菌组
原位接种，接种菌液的体积 不得超过供试品体积的1%
6h or 24h 108cfu/ml
106cfu/ml
24h or 7D 28D
真菌组
原位接种，接种菌液的体积 不得超过供试品体积的1%
106cfu/ml 108cfu/ml
7D or 14D 28D
National Institutes for Food and Drug Control
28days
细菌不生长； 真菌无增加； → lg 2.18 细菌菌数不 增加； 真菌菌数不 ②6h未显示较强抑菌效果 增加。 -1 -2 -3 细菌下降至 细菌下降至 细菌比14d不 2010 4 → lg 4.18 1.5 × 10 少 1.0log ； 少 3.0log ； 增加； / / 不可计 不可计 150 真菌不增加。 真菌不增加。 真菌不增加。 USP 细菌下降至 细菌下降至 细菌比14d不 少1.0log； 少3.0log； 增加； / / 真菌不增加。 真菌不增加。 真菌不增加。 JP 细菌≤0.1% 细菌比14d不 接种量； 增加； / / / National Institutes for Food and Drug Control 真菌不增加。 真菌不增加。
National Institutes for Food and Drug Control
方法适用性
National Institutes for Food and Drug Control
方法适用性
《中国药典》 版 抑菌效力检查法
白色念珠菌
(Candida albicans) 〔CMCC(F) 98 001〕
黑曲霉
(Aspergillus niger) 〔CMCC(F) 98 003〕
胰酪大豆胨琼脂 培养基或胰酪大 豆胨液体培养基
胰酪大豆胨琼脂 培养基或胰酪大 豆胨液体培养基
胰酪大豆胨琼脂 培养基或胰酪大 豆胨液体培养基 沙氏葡萄糖琼脂 培养基或沙氏葡 萄糖液体培养基 沙氏葡萄糖琼脂 培养基或沙氏葡 萄糖液体培养基
30～35℃ 18～24小时
30～35℃ 18～24小时
30～35℃ 18～24小时
20～25℃
24-48小时
20～25℃
5～7天或直到 获得丰富的孢
子
菌液制备 取表 1 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的新鲜培
的 70%，且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致，判该培养基的适用性检查
符合规定。
抑菌效力测定
菌种 抑菌效力测定用菌种见表 1，若需要，制剂中常见的污染微生物也 可作为试验菌株。
菌液制备 新鲜菌体培养见表 1，铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠 埃希菌、白色念珠菌若为琼脂培养物，加入适量的 0.9%无菌氯化钠溶液将琼脂 表面的培养物洗脱，并将菌悬液移至无菌试管内， 然后用 0.9%无菌氯化钠溶液 冲洗并制成每 1ml 含菌数约为 108cfu 的菌悬液；若为液体培养物，离心收集菌 体，用 0.9%无菌氯化钠溶液冲洗并制成每 1ml 含菌数约为 108cfu 的菌悬液。取 黑曲霉的新鲜培养物加入 3～5ml 含 0.05％（ml/ml）聚山梨酯 80 的 0.9%无菌氯 化钠溶液，将孢子洗脱，然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，加入适 量的含 0.05％（ml/ml）聚山梨酯 80 的 0.9%无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含孢子 数 108cfu 的孢子悬液。测定 1ml 菌悬液中所含的菌数。
1121抑菌效力检查法
1121 抑菌效力检查法抑菌剂是指抑制微生物生长的化学物质，有时也称防腐剂。
抑菌效力检查法系用于测定无菌及非无菌制剂的抑菌活性，用于指导生产企业在研发阶段制剂中抑菌剂种类和浓度的确定。
如果药物本身不具有充分的抗菌效力，那么应根据制剂特性（如水溶性制剂）添加适宜的抑菌剂，以防止制剂在正常贮藏或使用过程中由于微生物污染和繁殖，使药物变质而对使用者造成危害，尤其是多剂量包装的制剂。
在药品生产过程中，抑菌剂不能用于替代药品生产的GMP管理，不能作为非无菌制剂降低微生物污染的唯一途径，也不能作为控制多剂量包装制剂灭菌前的生物负载的手段。
所有抑菌剂都具有一定的毒性，制剂中抑菌剂的量应为最低有效量。
同时，为保证用药安全，成品制剂中的抑菌剂有效浓度应低于对人体有害的浓度。
抑菌剂的抑菌效力在贮存过程中有可能因药物的成分或包装容器等因素影响而变化，因此，应验证成品制剂的抑菌效力在效期内不因贮藏条件而降低。
本试验方法和抑菌剂抑菌效力判断标准用于包装未启开的成品制剂。
培养基培养基的制备胰酪大豆胨液体培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基照无菌检查法（通则1101）制备。
培养基的适用性检查抑菌效力测定用培养基包括成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基的适用性检查检查。
菌种试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
培养基适用性检查的菌种及新鲜培养物的制备见表1。
表1 培养基适用性检查、方法适用性检查、抑菌效力测定用的试验菌及新鲜培养物制备试验菌株试验培养基 培养温度 培养时间 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC(B) 26003 〕胰酪大豆胨琼脂培养基或 胰酪大豆胨液体培养基 30～35℃ 18～24小时 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)胰酪大豆胨琼脂培养基或 胰酪大豆胨液体培养基 30～35℃ 18～24小时 适用性检查 分别接种不大于100cfu 的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌的菌液至胰酪胨大豆琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平板，混匀，凝固，置30～35℃培养不超过3天，计数；分别接种不大于100cfu 的白色念珠菌、黑曲霉的菌液至沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平板，混匀，凝固，置20～25℃培养不超过 5 天，计数；同时，用对应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。
中国药典2015版抑菌效力检查法汇总
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标准&结论
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National Institutes for Food and Drug Control
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仪器、试剂、耗材
方法描述
National Institutes for Food and Drug Control
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28days
细菌不生长； 真菌无增加； → lg 2.18 细菌菌数不 增加； 真菌菌数不 ②6h未显示较强抑菌效果 增加。 -1 -2 -3 细菌下降至 细菌下降至 细菌比14d不 2010 4 → lg 4.18 1.5 × 10 少 1.0log ； 少 3.0log ； 增加； / / 不可计 不可计 150 真菌不增加。 真菌不增加。 真菌不增加。 USP 细菌下降至 细菌下降至 细菌比14d不 少1.0log； 少3.0log； 增加； / / 真菌不增加。 真菌不增加。 真菌不增加。 JP 细菌≤0.1% 细菌比14d不 接种量； 增加； / / / National Institutes for Food and Drug Control 真菌不增加。 真菌不增加。
National Institutes for Food and Drug Control
菌液制备
若为琼脂培养物，加入适 量的0.9%无菌氯化钠溶液 将琼脂表面的培养物洗脱， 并将菌悬液移至无菌试管 内， 用 0.9%无菌氯化钠 溶液稀释并制成每1ml 含 菌数约为108cfu 的菌悬液
若为液体培养物，离心收 集菌体，用0.9%无菌氯化 钠溶液稀释并制成每1ml 含菌数约为108cfu 的菌 悬液。
参考标准比较
抑菌剂效力检查法_整理ok
【51】Antimicrobial Effectiveness Testing抑菌劑效力檢查法1. 抑菌劑效力檢查：①用於測定無菌、非無菌製劑中抑菌劑的活性，用以評價最終產品的抑菌效力；②用於指導製造廠在製劑研發階段抑菌劑的選用確定。
2. 如果藥物本身不具有充分的抗菌活性，則應根據製劑特性（如：水溶液製劑）添加適宜的抑菌劑，以防止製劑在正常貯藏和使用過程中可能發生的微生物污染和繁殖，尤其是多劑量包裝的製劑，避免因藥物微生物污染及變質而對患者造成傷害。
3. 在藥品生產過程中，抑菌劑不能用於替代藥品生產的GMP 管理，不能作為非滅菌製劑降低微生物污染的唯一途徑，也不能作為控制多劑量包裝製劑滅菌前的生物負載的手段。
4. 所有抑菌劑都具有一定的毒性，製劑中抑菌劑的量應為最低有效量。
同時，為保證用藥安全，最終包裝容器中的抑菌劑有效濃度應低於對人體有害的濃度。
5. 要求具有抗菌活性的製劑，不管是添加的抑菌劑，還是藥物本身具有抗菌活性，在藥物研發階段，均應確認其抗菌效力。
6. 抑菌劑的抗菌效力在貯存過程中有可能因藥物的成分或包裝容器等因素影響而提高或降低。
因此，應驗證最終容器中的抑菌劑效力在效期內不因貯藏條件而降低。
7. 本試驗方法和抑菌劑抑菌效力判斷標準用於包裝未啟開的成品製劑。
8. 需要進行本試驗的藥品分為四類（表1）。
表1 Compendial Product Categories9.1 菌株活化後使用，繼代培養以不超過5代為原則。
（冷凍乾燥菌種為第0代）9.2 以液體培養基培養的菌種：保存前，先將菌種活化培養18~24H →離心（一般使用4000rpm）→用1/20 體積的無菌TSB，將沉降的細胞懸浮分散於其中→加入等體積的sterile glycerol （20% v/v in water），混勻後冷凍保存。
10. All media used in the test must be tested for growth promotion.growth promotion test：⇩取Escherichia coli ATCC No.8739、Pseudomonas aeruginosa ATCC No.9027、Staphylococcus aureus ATCC No.6538各50～100cfu，分別注入sterile Petri dish中，立即傾注TSA培養基(每株試驗菌做2重覆) ，混勻，待凝固，放置於30～35℃，培養48 小時，計數菌落數；⇩取Candida albicans ATCC No.10231、Aspergillus niger ATCC No.16404各50～100cfu，分別注入sterile Petri dish中，立即傾注SDA培養基(每株試驗菌做2重覆)，混勻，待凝固，放置於20～25℃培養72 小時，計數菌落數。
1121抑菌效力检查法
1121 抑菌效力检查法用于测定无菌及非无菌制剂的抑菌活性，用于指导生产企业在研发阶段制剂中抑菌剂种类和浓度的确定。
如果药物本身不具有充分的抗菌效力，那么应根据制剂特性（如水溶性制剂）添加适宜的抑菌剂，以防止制剂在正常贮藏或使用过程中由于微生物污染和繁殖，使药物变质而对使用者造成危害，尤其是多剂量包装的制剂。
在药品生产过程中，抑菌剂不能用于替代药品生产的GMP管理，不能作为非无菌制剂降低微生物污染的唯一途径，也不能作为控制多剂量包装制剂灭菌前的生物负载的手段。
所有抑菌剂都具有一定的毒性，制剂中抑菌剂的量应为最低有效量。
同时，为保证用药安全，成品制剂中的抑菌剂有效浓度应低于对人体有害的浓度。
抑菌剂的抑菌效力在贮存过程中有可能因药物的成分或包装容器等因素影响而变化，因此，应验证成品制剂的抑菌效力在效期内不因贮藏条件而降低。
本试验方法和抑菌剂抑菌效力判断标准用于包装未启开的成品制剂。
培养基培养基的制备胰酪大豆胨液体培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基照无菌检查法（通则1101）制备。
培养基的适用性检查抑菌效力测定用培养基包括成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基的适用性检查检查。
菌种试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
培养基适用性检查的菌种及新鲜培养物的制备见表1。
表1 培养基适用性检查、方法适用性检查、抑菌效力测定用的试验菌及新鲜培养物制备试验菌株试验培养基培养温度培养时间金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 〔CMCC(B)26003〕胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基30～35℃18～24小时铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 〔CMCC(B)10104〕胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基30～35℃18～24小时大肠埃希菌*埃希菌的菌液至胰酪胨大豆琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平板，混匀，凝固，置30～35℃培养不超过3天，计数；分别接种不大于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉的菌液至沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平板，混匀，凝固，置20～25℃培养不超过5 天，计数；同时，用对应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。
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附录ⅩⅢJ抑菌效力检查法
抑菌剂是指抑制微生物生长的化学物质，有时也称防腐剂。
抑菌效力检查法系用于测定灭菌及非灭菌制剂的抑菌活性，以评价最终产品的抑菌效力，同时也可用于指导生产企业在研发阶段制剂中抑菌剂浓度的确定。
如果药物本身不具有充分的抗菌效力，那么应根据制剂特性（如水溶性制剂）添加适宜的抑菌剂，以防止制剂在正常贮藏或使用过程中可能发生的微生物污染和繁殖使药物变质而对使用者造成危害，尤其是多剂量包装的制剂。
在药品生产过程中，抑菌剂不能用于替代药品生产的GMP管理，不能作为非无菌制剂降低微生物污染的唯一途径，也不能作为控制多剂量包装制剂灭菌前的生物负载的手段。
所有抑菌剂都具有一定的毒性，制剂中抑菌剂的量应为最低有效量。
同时，为保证用药安全，成品制剂中的抑菌剂有效浓度应低于对人体有害的浓度。
抑菌剂的抗菌效力在贮存过程中有可能因药物的成分或包装容器等因素影响而变化，因此，应验证成品制剂中的抑菌剂效力在效期内不因贮藏条件而降低。
本试验方法和抑菌剂抑菌效力判断标准用于包装未启开的成品制剂。
培养基
培养基的制备
1.胰酪大豆胨液体培养基
胰酪胨17.0g 氯化钠 5.0g
大豆木瓜蛋白酶消化物 3.0g 磷酸氢二钾 2.5g
葡萄糖（一水合） 2.5g 水1000mL
除葡萄糖外，取上述成分，混合，微温溶解，滤过，调节pH值使灭菌后在25℃的pH 值为7.3±0.2，加入葡萄糖，分装，灭菌。
胰酪大豆胨液体培养基置20～25℃培养。
2. 胰酪大豆胨琼脂培养基
胰酪胨 15.0g 氯化钠 5.0g
大豆木瓜蛋白酶水解物 5.0g 琼脂 15.0g
水 1000ml
除琼脂外，取上述成分，混合。
微温溶解，调节pH值使灭菌后在25℃的pH值为7.3
±0.2，加入琼脂，加热溶化后，摇匀，分装，灭菌。
3.沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基
照微生物限度检查法（附录ⅩⅢ C）制备。
培养基的适用性检查
抑菌效力测定用培养基应进行培养基的适用性检查，包括成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应检查。
菌种试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
培养基适用性检查的菌种及新鲜菌体培养见表1。
表1 培养基适用性检查、方法适用性试验、抑菌效力测定用的试验菌培养条件
菌液制备取表1大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液。
取表2黑曲霉的新鲜培养物加入3～5ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
然
后，采用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的孢子悬液。
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。
黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。
适用性检查分别接种不大于100cfu的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的菌液至胰酪胨大豆琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置30～35℃培养不超过3天，计数；分别接种不大于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉的菌液至沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置20～25℃培养不超过5天，计数；同时，用对应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。
结果判定若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上菌落平均数的70%，且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。
抑菌效力测定
菌种抑菌效力测定用菌种见表1，若需要，制剂中常见的污染微生物也可作为试验菌株。
菌液制备新鲜菌体培养见表1，铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌若为琼脂培养物，加入适量的0.9%无菌氯化钠溶液将琼脂表面的培养物洗脱，并将菌悬液移至无菌试管内，然后用0.9%无菌氯化钠溶液冲洗并制成每1ml含菌数约为108cfu的菌悬液；若为液体培养物，离心收集菌体，用0.9%无菌氯化钠溶液冲洗并制成每1ml含菌数约为108cfu的菌悬液。
取黑曲霉的新鲜培养物加入3～5ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，加入适量的含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数108cfu的孢子悬液。
测定1ml菌悬液中所含的菌数。
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。
黑曲霉的孢子悬液可保存在2～8℃，在1周内使用。
供试品接种抑菌效力可能受试验用容器特征的影响，如容器的材质、形状、体积及封口的方式等。
因此，只要供试品每个包装容器的装量足够试验用，同时
容器便于按无菌操作技术接入试验菌液、混合及取样等，一般应将试验菌直接接种于供试品原包装容器中进行贮存。
若因供试品的性状或每个容器装量等因素需将供试品转移至无菌容器时，该容器的材质不得影响供试品的特性（如吸附作用），特别应注意不得影响供试品的pH，pH对抑菌剂的活性影响很大，同时容器的口径大小应便于供试品的转移及混匀。
取包装完整的供试品至少5份，直接接种试验菌，或取适量供试品分别转移至5个适宜的无菌容器中（若试验菌株数超过5株，应增加相应的供试品份数），每一容器接种一种试验菌，1g或1ml供试品中接菌量为105～106cfu，接种菌液的体积不得超过供试品体积的1%,充分混合，使供试品中的试验菌均匀分布，然后置20～25℃避光贮存。
存活菌数测定根据产品类型，按表2-1、表2-2、表2-3规定的间隔时间，分别从上述每个容器中取供试品1ml(g)，测定每份供试品中所含的菌数，测定细菌用胰酪胨大豆琼脂培养基，测定真菌用沙氏葡萄糖琼脂培养基。
存活菌数测定方法及方法适用性试验照微生物限度检查法（附录ⅩⅢ C）进行，方法适用性试验用菌株见表1，菌液制备同培养基适用性检查，方法适用性试验试验菌的回收率不得低于70%。
根据存活菌数测定结果，计算1ml(g)供试品各试验菌所加的菌数及各间隔时间的菌数，并换算成lg值，试验结果按有效数字的修约规则进舍，保留小数点后1位有效数字。
结果判断供试品抑菌效力评价标准见表2-1、表2-2、表2-3，表中的“减少的lg值”是指各间隔时间测定的菌数lg值与1ml(g)供试品中接种的菌数lg值的相差值。
表中”A”是指应达到的抑菌效力标准，特殊情况下，如抑菌剂可能增加不良反应的风险，那至少应达到“B”的抑菌效力标准。
表2 -1 注射剂和眼用制剂抑菌效力判断标准
减少的lg值
6h 24h 7d 14d 28d 细菌 A 2 3 - - NR
B - 1 3 - NI
真菌 A - - 2 - NI
B - - - 1 NI NR：试验菌未恢复生长。
NI：未增加，是指对前一个测定时间，试验菌增加的数量不超过0.5 lg。
表2 -2 局部给药制剂抑菌效力判断标准
减少的lg值
2d 7d 14d 28d 细菌 A 2 3 - NI
B - - 3 NI
真菌 A - - 2 NI
B - - 1 NI
NI：未增加，是指对前一个测定时间，试验菌增加的数量不超过0.5 lg。
表2 -3 口服制剂抑菌效力判断标准
NI：未增加，是指对前一个测定时间，试验菌增加的数量不超过0.5 lg。