实验十猪胰蛋白酶的纯化及其活性测定
胰蛋白酶或抑制剂分离、纯化综合分析
实验胰蛋白酶或抑制剂分离、纯化在动物胰脏中，胰蛋白酶是以无活性的酶原状态存在的。
在生理条件下，胰蛋白酶原随胰液分泌至十二指肠后，在小肠上腔有Ca2+的环境中，为肠激酶或胰蛋白酶所激活，其肽链N -端的赖氨酸与异亮氨酸之间的一个肽键被水解，失去一个酸性6肽，其分子构象发生一定的改变后转变为具有催化蛋白质水解活性的胰蛋白酶。
胰蛋白酶原分子量约为24 000，其等电点为pH8.9；胰蛋白酶的分子量约为23 400，其等电点为pH 10.8。
胰蛋白酶在pH3.0时最稳定，其浓溶液可贮存于冰箱（0℃以下）数周而活性无显著丧失。
pH＜3时，胰蛋白酶易变性。
PH＞５时，胰蛋白酶易自溶。
胰蛋白酶催化活性的最适pH为7.6～7.8。
重金属离子、有机磷化合物和反应产物都能抑制胰蛋白酶的活性。
胰脏、卵清和大豆中也含有一些蛋白质对胰蛋白酶活性具有抑制作用。
实验（一）胰蛋白酶活性测定[原理]胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（如精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的肽键具有高度的专一性。
此外，胰蛋白酶也能催化由碱性氨基酸的羧基所形成的酰胺键和酯键，有高度的专一性仍表现为对碱性氨基酸羧基一侧的选择对此等化学键的催化水解活性的敏感度为：酯键＞酰胺键＞肽键。
因此，可以利用含有这些化学键中任一种键型的底物来研究胰蛋白酶的专一催化活性。
本实验方法一采用N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯[（BAEE），N-benzoyl-L-arginine ethyl ester]作为底物，水解反应如下：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）在波长253nm下的紫外光吸收远远弱于N-苯甲酰-L-精氨酸[（BA），benzoyl-L-arginine]的紫外光吸收。
在胰蛋白酶的催化下，BAEE随着酯键的水解，水解产物BA逐渐增多，反应体系的紫外光吸收亦随之相应增加，以△A253nm计算胰蛋白酶的活性。
胰蛋白酶的BAEE单位定义为：以BAEE为底物，在一定反应条件下，每分钟使△A253nm 增加0.001的酶量为一个BAEE单位。
胃蛋白酶
计、凝
胶成像仪、核酸蛋白质分析仪。
四、实验方法
1
．猪胰蛋白酶的分离纯化
（
1
）粗猪胰蛋白酶的提取
取猪胰脏，除去脂肪和结缔组织，切碎，称重约
50g
加入
5
倍体积预冷的
pH2.5
乙酸酸化水
用组织捣碎机捣碎
离心
10000 rpm
，
15 min
用
4
层纱布过滤得上清液（
收集约
1.5 mL
，作为留样
1
，测蛋白含量，及时
SDS
化）
将研细的固体无水氯化钙慢慢加入酶原溶液中，
边加边搅拌均匀，
使溶液中最终
含有
0.1 mol/L CaCl
2
加入极少量猪胰蛋白酶（约
2-5mg
），轻轻搅拌均匀
用
5 mol/L NaOH
调
pH
为
8.0
于
25
℃下活化
4~6
小时（
2
小时取样一次），测定酶活性增加的情况
4
活化完成后，用
2.5 mol/L H
3
C
6
H
5
O
7
·
2
H
2
O/L
）混匀，
用酸度计检查
pH
值是否为
6.0
。
（
10
）
8
％三氯乙酸
（
11
）
10 mg/mL
酪蛋白溶液：
取酪蛋白
1g
，
加
11
M
Tris
－
HCl
缓冲液，
pH8.0
40
mL
胰蛋白酶抑制剂的分离纯化和活性测定
胰蛋白酶抑制剂的分离纯化和活性测定
五、结果与分析
说明现象 解释原因
胰蛋白酶抑制剂的分离纯化和活性测定
六、讨论与心得
试分析实验过程中影响胰蛋白酶抑制剂分 离提纯效果的因素有哪些？ 实验心得及改进意见。
胰蛋白酶抑制剂的分离纯化和活性测定
胰蛋白酶抑制剂的分离纯化和活性测定
三、试剂与仪器
（二）材料与器材
❖ 新鲜材料 ❖ 绞碎机 ❖ 纱布 ❖ 台式高速冷冻离心机 ❖ 微量移液器 ❖ pH值试纸 ❖ 恒温水浴锅 ❖ 电子天平 ❖ 玻璃试管、烧杯、量筒 ❖ 离心管
胰蛋白酶抑制剂的分离纯化和活性测定
四、实验方法
（一）胰蛋白酶抑制剂的提取和纯化
一、实验目的
（1）了解胰蛋白酶抑制剂的制备方 法； （2）了解胰蛋白酶抑制剂抑制活性 测定的原理和方法； （3）掌握离心机和微量移液器的使 用方法。
胰蛋白酶抑制剂的分离纯化和活性测定
二、实验原理
胰蛋白酶抑制剂是对胰蛋白酶有抑制活性的蛋白 质。
利用蛋白质可溶于水或提取液中的性质，可用水 或提取液从富含胰蛋白酶抑制剂的材料中抽提胰 蛋白酶抑制剂，利用盐析使胰蛋白酶抑制剂沉淀 出来，得到含有胰蛋白酶抑制剂的蛋白质制品。
本实验以大豆为主要原料，制备胰蛋白酶抑制剂， 并测定其抑制活性。
胰蛋白酶抑制剂的分离纯化和活制剂的分离纯化和活性测定
p-NA
三、试剂与仪器
（一）试剂
0.2 mol/L Na2HPO4，0.2mol/L NaH 2P04。 0.8mol/L磷酸缓冲液；36mL 0.2mol/LNa2HP04与14mL
在制备过程中通过测定对胰蛋白酶的抑制活性进 行跟踪检测。
胰蛋白酶抑制剂的分离纯化和活性测定
亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介
亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介
第1页
1 内容摘要 亲和层析包含了一整套复杂底物及其配体与生物大分
子之间相互作用时所形成独特生物学特征。在亲和结合过 程中包括到疏水力、静电力、范德华力及空间阻力等原因 影响。
亲和层析概念能够了解为配基以共价键形式与水不溶 性固体载体共价结合， 形成含有高度专一性亲和吸附剂。 以该介质为填料填充亲和层析柱，从复杂混合物中有针对 性分离某一个成份。
亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介
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1. 3试验流程
鸡蛋清
Spharose 4B
猪胰脏
↓
↓
↓
提取
↓ 分离纯化
活化 ↓
提取 ↓
↓ 纯卵粘蛋白(CHOM) →←活化Spharose 4B 胰蛋白酶原粗提液
↓ 偶联
↓ 激活
↓
↓
CHOM-Spharose 4B →← 胰蛋白酶提取液
↓ 亲和层析
亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介
第2页
本试验以亲和层析方法分离纯化猪胰蛋白酶为目标，
从猪胰脏提取液中分离纯化胰蛋白酶，最终得到纯度较高
胰蛋白酶。围绕亲和层析试验所包括蛋白质和酶基础性质
及相关技术进行综合训练。其中主要包含亲和层析介质配
基制备，亲和介质合成，蛋白质和酶分离纯化，酶活性测
定等内容。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
经过综合训练，能够系统掌握蛋白质制备基础原理和
操作，学习怎样进行试验设计，掌握试验过程中关键步骤，
对试验中出现问题进行科学分析。使学生在学习试验技术
同时，自觉培养分析问题和处理问题能力。
亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介
实验十猪胰蛋白酶的纯化及其活性测定
实验十猪胰蛋白酶的纯化及其活性测定一、实验目的1. 学习胰蛋白酶的纯化及其结晶的基本方法。
2. 学习用紫外法测定酶活性，搞清酶活性与比活性的概念。
二、实验原理胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在Ca2+的存在下，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失去一段六肽，分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。
胰蛋白酶原的分子量约为24000，其等电点约为pH8.9，胰蛋白酶的分子量与其酶原接近（23300），其等电点约为pH10.8，最适pH7.6～8.0，在pH=3时最稳定，低于此pH时，胰蛋白酶易变性，在pH>5时易自溶。
Ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用。
重金属离子，有机磷化合物和反应物都能抑制胰蛋白酶的活性，胰脏、卵清和豆类植物的种子中都存在着蛋白酶抑制剂。
最近发现在一些植物的块基（如土豆、白薯、芋头等）中也存在有胰蛋白酶抑制剂。
胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。
此外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成的酰胺键或酯键，其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。
胰蛋白酶对这些键的敏感性次序为：酯键> 酰胺键> 肽键。
因此可利用含有这些键的酰胺或酯类化合物作为底物来测定胰蛋白酶的活力。
目前常用苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺（简称BAPA）和苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺（简称BANA）测定酰胺酶活力。
用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（简称BAEE）和对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（简称TAME）测定酯酶活力。
本实验以BAEE为底物，排毒养颜胶囊用紫外吸收法测定胰蛋白酶活力。
酶活力单位的规定常因底物及测定方法而异。
从动物胰脏中提取胰蛋白酶时，一般是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出来，然后再根据等电点沉淀的原理，调节pH以沉淀除去大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量糜蛋白酶原和弹性蛋白酶原）沉淀析出。
鸡卵粘蛋白的提取及猪胰蛋白酶的分离纯化
鸡卵粘蛋⽩的提取及猪胰蛋⽩酶的分离纯化鸡卵粘蛋⽩的提取及猪胰蛋⽩酶的分离纯化摘要：鸡卵类粘蛋⽩是由鸡卵清中制得的⼀种糖蛋⽩，具有强烈的抑制胰蛋⽩酶的作⽤，常⽤于胰蛋⽩酶的酶学性质的研究和胰蛋⽩酶的亲和层析纯化制备。
胰蛋⽩酶Trypsin (Parenzyme) 为蛋⽩酶的⼀种，EC3.4.21.4。
在脊椎动物中，作为消化酶⽽起作⽤，⽽且还能限制分解糜蛋⽩酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作⽤。
本实验以鸡蛋清为原料，提取猪胰蛋⽩酶的天然抑制剂鸡卵粘蛋⽩，并以此为配基，偶联到琼脂糖凝胶上，制成鸡卵粘蛋⽩的亲和吸附剂，然后通过亲和层析直接从猪胰脏的粗提液中纯化猪胰蛋⽩酶。
并设计了酶活性测定以对纯化过程进⾏监测和对纯化效果进⾏评价；设计了电泳实验对制备的猪胰蛋⽩酶进⾏纯度和分⼦量的测定。
关键词：鸡卵粘蛋⽩；胰蛋⽩酶；亲和层析；分离纯化；酶活性。
鸡卵粘蛋⽩（chicken ovomucoid简称CHOM）是鸡蛋清中的⼀种糖蛋⽩，⾄今还未能获得单⼀组分，在电泳⾏为上常呈现不均⼀性。
不同来源的卵类蛋⽩末端基有很⼤差别，鸡卵类蛋⽩N-末端基为丙氨酸。
卵类粘蛋⽩在中性活酸性溶液中对热和⾼浓度的脲是相当稳定的，⽽在碱性溶液中⽐较不稳定，尤其温度较⾼是易迅速失活，在50%丙酮或10%三氯⼄酸溶液中仍有较好的溶解度。
它们的等电点有⼀定的范围，⼤致在3.9—4.5之间。
鸡卵粘蛋⽩除对⽜和猪的胰蛋⽩酶有强烈的抑制作⽤外，对枯草杆菌蛋⽩酶也有⼀定的抑制作⽤，但对胰凝乳蛋⽩酶⽆抑制作⽤，对⼈的胰蛋⽩酶也⽆明显抑制作⽤，因此常⽤于胰蛋⽩酶酶学性质的研究。
在pH7.8～8.0碱性条件下，CHOM可可逆性的结合胰蛋⽩酶，以CHOM为配基制成亲和吸附剂，通过亲和层析技术对胰蛋⽩酶进⾏分离纯化。
1材料与⽅法1.1材料与试剂市售鲜鸡蛋，10%TCA，1mol/L NaOH ，5mol/L NaOH ，1mol/L HCl，5mol/L HCl，丙酮（A.R），葡聚糖凝胶G-25（SephadexG-25)，0.02mol/L, pH6.5磷酸缓冲液，DEAE-52离⼦交换纤维素，离⼦交换剂（0.5mol/L HCl ，0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl ），洗脱液（0.3mol/L NaCl—0.02mol/L, pH6.5磷酸缓冲液）,透析袋（φ2.7cm）,标准胰蛋⽩酶溶液（1mg/ml），0.05mol/L PH7. 8 Tris- HCl缓冲液，BAEE底物缓冲溶液（0.05mol/L CaCl2- 0.05mol/L PH8.0 Tris- HCl缓冲液），1mmol/L BAEE底物溶液，Sepharose 4B，0.5mol/L NaCl，2mol/L NaOH，0.2mol/L PH9.5碳酸钠缓冲液，56%1，4-⼆氧六环（V/V），环氧氯丙烷（A.R），亲和柱平衡液（0.5mol/L KCl，0.05mol/L CaCl2—0.1mol/L, Tris—HCl PH7.8缓冲液），亲和柱洗脱液（0.5mol/L KCl—0.1mol/L PH2.5甲酸溶液），，⽆⽔氯化钙，亲和柱平衡液新鲜猪胰脏，PH2.5-3.0⼄酸酸化⽔，2.5mol/L H2S04（ 0.5mol/L KCl，0.05mol/L CaCl2—0.1mol/L, Tris—HCl PH7.8缓冲液），亲和柱洗脱液：（0.5mol/L KCl— 0.1mol/LPH2.5甲酸溶液）等。
实训 亲和色谱纯化胰蛋白酶
实训亲和色谱纯化胰蛋白酶［任务描述］亲和色谱主要是根据生物分子与其特定的固相化的配基或配体之间具有一定的亲和力而使生物分子得以分离。
鸡卵粘蛋白是专一性较高的胰蛋白酶抑制剂，对牛和猪的胰蛋白酶有相当强的抑制作用，在pH7.0～8.0的缓冲溶液中卵粘蛋白与胰蛋白酶牢固地结合，而在pH2.0～3.0时，又能被解离下来。
因此，采用鸡卵粘蛋白作成的亲和吸附剂可以从胰脏粗提液中通过一次亲和色谱直接获得活力大于10000BAEE单位/毫克蛋白胰蛋白酶制品，比用经典分离纯化方法简便得多，纯化效率可达到10～20倍以上。
本次实训任务为纯化胰蛋白酶，采用胰蛋白酶的天然抑制剂-鸡卵粘蛋白作为配基制成亲和吸附剂，从胰脏粗提取液中纯化胰蛋白酶。
［任务实施］一、准备工作1.建立工作小组，制定工作计划，确定具体任务，任务分工到个人，并记录到工作表。
2.收集亲和色谱纯化胰蛋白酶工作中必须信息，掌握相关知识及操作要点，与指导教师共同确定出一种最佳的工作方案。
3.完成任务单中实际操作前的各项准备工作。
（1）材料准备鸡蛋清，新鲜猪胰脏。
（2）试剂与仪器试剂：丙酮、三氯乙酸、HCl、NaOH、NaCl、NaHCO3、Na2CO3、氯代环氧丙烷、乙腈、甲酸、Tris、CaCl2、KCl、DEAE-纤维素、Sepharose-4B、乙酸二氧六环二甲基亚砜。
主要贮存溶液：①鸡卵粘蛋白色谱液（1L）。
0.02mol/L pH7.3 Tris-HCl缓冲液。
②DEAE-纤维素处理液。
0.5mol/L HCl 300mL和0.5mol/L NaOH、0.5mol/L NaCl 各300mL。
③卵粘蛋白洗脱液。
0.02mol/L pH7.3 Tris-HCl缓冲液含0.3mol/L NaCl，150mL。
④标准胰蛋白酶溶液。
结晶胰蛋白酶以0.001mol/L HCl 配制成1mg/mL 。
⑤亲和色谱柱平衡液。
含0.5mol/LKCl 、0.05mol/L CaCl 2的0.1mol/L pH8.0 Tris-HCl 缓冲液500mL （配1000mL ：12.1g Tris ，37.5g KCl ，5.6g CaCl 2）。
生化实验报告 胰蛋白酶活力测定
胰蛋白酶活力测定一、实验原理1、福林—酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色化合物（钨蓝和钼蓝）。
2、蛋白质中含具酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用胰蛋白酶水解蛋白底物，生成含酚基的氨基酸与福林—酚试剂反应，生成蓝色化合物，在一定的范围内，蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正比。
二、实验仪器1、试管2、7220分光光度计3、恒温水浴锅三、实验试剂1、福林试剂B：见福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度部分(冰箱中)2、0.55mol/L碳酸钠溶液：58.3g无水碳酸钠溶于蒸馏水，稀释并定容至1000ml3、10%三氯乙酸溶液4、0. 2mol/L磷酸缓冲液(pH7.5)：5、0.5% 酪素溶液：称取0.5g酪素，以0.5mol/L氢氧化钠1ml湿润，再加少量0. 2mol/L磷酸缓冲液稀释。
在水浴中煮沸溶解，冷却，稀释并容至100ml，冷藏在(冰箱)里。
6、500ug/L酪氨酸溶液7、胰蛋白酶溶液(冰箱中)四、实验步骤1、标准曲线的制作：按下表加入试剂：各管中加0.5%酪素2ml，于37℃水浴中反应15分钟，然后加入10%三氯乙酸3ml，过滤除去沉淀，取清液1ml，加入0.55mol/L碳酸钠5ml，再加入福林试剂1ml，于37 ℃水浴中显色15分钟，测OD680。
以光密度为纵坐标，酪氨酸的微克数为横坐标绘制标准曲线。
样品中含酶活力单位=A/15 ╳FA—样品测定光密度查曲线得相当酪氨酸ug数F—酶液稀释倍数由上可知，样品的吸光度y=0.993，则x=0.8μg，即A=0.8μg 故根据公式样品中含酶活力单位=A/15 ╳FA—样品测定光密度查曲线得相当酪氨酸ug数F—酶液稀释倍数胰蛋白酶活力为：0.8 /15 ╳13=0.69六、实验分析1. 测定胰蛋白酶活力的原理?答：蛋白质中含具酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用胰蛋白酶水解蛋白底物，生成含酚基的氨基酸与福林—酚试剂反应，生成蓝色化合物，在一定的范围内，蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正比。
实验：猪胰蛋白酶的分离纯 化
猪胰蛋白酶的分离纯化 与检测
主要内容
实验内容 实验目的 实验原理 实验方法 实验结果 实验报告格式
实验内容
一、猪胰蛋白酶的分离纯化 二、蛋源自质含量的测定 三、酶活力的测定 四、纯化效果检测
——SDS-PAGE电泳检测
实验目的
1、掌握盐析沉淀法、透析法及离子交换层析 的原理和操作过程；
在4℃下对0.001 mol/L HCl溶液透析3小时左右（每小时换 液1次 ！）
而后改用0.01 mol/L , pH5.0柠檬酸钠缓冲液透析（至少换 液3次，第一次1小时后换液，第二次是2小时后换液，第 三次是3小时后换液，然后过夜透析 ！）
（记录样品体积，收集约1.5 mL，作为留样3，测蛋白含量，及时 SDS化）
3. 离子交换层析法
同类型的带电离子间可自由地相互交换和竞争结合。 蛋白质在其等电点以下（pH<pI），带正电荷，可被阳离子交换树
脂所吸附；而蛋白质在其等电点以上（pH>pI），带负电荷，可被 阴离子交换树脂所吸附。 本实验中的猪胰蛋白酶等电点为pI=10.8，在pH=5.0的缓冲液中猪胰 蛋白酶带正电荷，可被阳离子交换树脂所吸附（本实验采用CM-纤 维素离子交换树脂）；而带负电荷的杂蛋白不被吸附而除去，带正 电荷的杂蛋白也被吸附，但不同蛋白与树脂的吸附能力不同，通过 增加缓冲液中的离子强度及提高pH，可将蛋白从树脂上洗脱下来。 在不同的离子强度下，可将不同的蛋白分别洗脱（结合力弱的蛋
时SDS化 )
⑤硫酸铵盐析沉淀（75%饱和度） ——计算硫酸铵用量时需扣除形成硫酸钙的 量。 （于4℃静置过夜）
⑥离心（离心10000 rpm，15 min）——取沉淀（为粗胰蛋白酶 ）
实验方法
胰蛋白酶的纯化实验报告
一、实验目的1. 学习和掌握胰蛋白酶的纯化方法。
2. 了解胰蛋白酶的理化性质和生物学功能。
3. 培养实验操作技能和数据分析能力。
二、实验原理胰蛋白酶是一种广泛存在于胰腺中的丝氨酸蛋白酶，具有水解蛋白质的能力。
本实验采用硫酸铵盐析法对胰蛋白酶进行纯化，该方法具有操作简便、成本低廉、纯度较高等优点。
三、实验材料1. 胰蛋白酶粗品：由动物胰腺提取。
2. 硫酸铵：分析纯。
3. 氯化钠：分析纯。
4. 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）：0.1 mol/L。
5. 其他试剂：三氯乙酸、硫酸、氢氧化钠等。
四、实验方法1. 胰蛋白酶粗品预处理：将胰蛋白酶粗品溶解于磷酸盐缓冲液（pH 7.0），搅拌使其充分溶解。
2. 盐析：向胰蛋白酶溶液中加入硫酸铵，使其饱和，充分搅拌，室温静置过夜。
3. 沉淀收集：用布氏漏斗抽滤，收集沉淀，并用磷酸盐缓冲液（pH 7.0）洗涤沉淀。
4. 脱盐：将沉淀溶于适量的水，加入适量的三氯乙酸，使蛋白质变性，去除杂质。
5. 纯化：将变性后的蛋白质溶液透析，去除三氯乙酸和硫酸铵。
6. 蛋白质复性：将透析后的蛋白质溶液加入适量的磷酸盐缓冲液（pH7.0），使蛋白质复性。
7. 检测：采用SDS-PAGE方法检测纯化后的胰蛋白酶。
五、实验结果与分析1. 盐析：在胰蛋白酶溶液中加入硫酸铵后，溶液出现白色沉淀，说明胰蛋白酶已经盐析。
2. 沉淀收集：通过抽滤，收集到白色沉淀，表明胰蛋白酶已经沉淀。
3. 脱盐：加入三氯乙酸后，沉淀溶解，表明蛋白质已经变性。
4. 纯化：透析后的蛋白质溶液中，SDS-PAGE电泳结果显示，只有一个明显的条带，说明胰蛋白酶已经纯化。
5. 蛋白质复性：复性后的胰蛋白酶溶液中，SDS-PAGE电泳结果显示，蛋白条带清晰，说明蛋白质已经复性。
六、实验结论本实验采用硫酸铵盐析法对胰蛋白酶进行纯化，成功地将胰蛋白酶从粗品中分离出来，并通过SDS-PAGE电泳检测，证明纯化后的胰蛋白酶具有较高的纯度。
胰蛋白酶的制备实验报告
一、实验目的1. 学习并掌握胰蛋白酶的提取、纯化方法。
2. 了解胰蛋白酶的活性测定方法。
3. 掌握实验室操作技能，提高实验动手能力。
二、实验原理胰蛋白酶是一种广泛存在于哺乳动物胰脏中的蛋白水解酶，具有高效、专一的特点。
本实验通过从胰脏中提取胰蛋白酶，利用其活性对蛋白质进行水解，从而实现对胰蛋白酶的制备。
三、实验材料与仪器1. 材料：新鲜猪胰脏、生理盐水、盐酸、氢氧化钠、硫酸铵、硫酸铜、Folin试剂、酪蛋白、三氯醋酸等。
2. 仪器：研钵、天平、烧杯、试管、移液管、滴定管、恒温水浴锅、紫外可见分光光度计等。
四、实验步骤1. 胰蛋白酶提取（1）将新鲜猪胰脏去脂肪、去筋膜，剪成小块，用生理盐水清洗，去除杂质。
（2）将胰脏放入研钵中，加入适量的生理盐水，研磨成浆状。
（3）将研磨好的胰浆用纱布过滤，收集滤液。
2. 胰蛋白酶纯化（1）将滤液加入适量的盐酸，调节pH值为4.5，静置过夜。
（2）次日，将沉淀物用蒸馏水洗涤，去除杂质。
（3）将洗涤后的沉淀物加入适量的硫酸铵溶液，调节硫酸铵浓度为40%，搅拌，静置2小时。
（4）取沉淀物，用蒸馏水洗涤，去除杂质。
（5）将洗涤后的沉淀物用硫酸铜溶液处理，去除杂质。
3. 胰蛋白酶活性测定（1）取一定量的酶液，加入酪蛋白溶液，在40℃、pH值为7.5的条件下反应30分钟。
（2）加入三氯醋酸终止反应，离心分离。
（3）取上清液，用Folin试剂测定吸光度，计算酶活性。
五、实验结果与分析1. 胰蛋白酶提取通过研磨和过滤，从新鲜猪胰脏中成功提取出胰蛋白酶。
2. 胰蛋白酶纯化通过盐析、洗涤、硫酸铵沉淀和硫酸铜处理，成功纯化出胰蛋白酶。
3. 胰蛋白酶活性测定在最佳条件下，胰蛋白酶对酪蛋白的水解活性较高，说明成功制备出具有活性的胰蛋白酶。
六、实验结论本实验成功从猪胰脏中提取、纯化出具有活性的胰蛋白酶，为后续的实验研究提供了条件。
七、实验注意事项1. 提取过程中，需保持操作环境清洁，避免污染。
猪胰蛋白酶trypsin酶联免疫分析ELISA
猪胰蛋白酶 (trypsin)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定猪血清，组织及相关液体样本中胰蛋白酶(trypsin)的含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中猪胰蛋白酶 (trypsin)水平。
用纯化的猪胰蛋白酶 (trypsin)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入胰蛋白酶(trypsin)，再与HRP标记的胰蛋白酶 (trypsin)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的胰蛋白酶 (trypsin)呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中猪胰蛋白酶 (trypsin)浓度。
试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×48 1×96 2-8℃保存标准品：22.5ng/mL 0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
猪胰脏制备[资料]
![猪胰脏制备[资料]](https://img.taocdn.com/s3/m/c56fc2a90975f46526d3e145.png)
3),,,,,压榨法 这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在 1000,,,,,×,,,,,105Pa～2000×105Pa,,,,,的高压下使几 十毫升的细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压， 细胞将彻底破碎。这是一种较理想的破碎细胞的方 法，但仪器用较高。
,,,,,4),,,,,冷热交替法,,,,, 从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。在 90℃左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却， 如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。
,,,,,3．化学与生物化学方法：
自溶法,,,,, 将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下， 细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯 酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来， 此法称为自溶法。使用时要特别小心操作，因为水解 酶不仅可以使细胞壁和膜破坏，同时也可能会把某些 要提取的有效成分分解了。
,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,材料选定后要尽可能保持新 鲜，尽快加工处理，动物组织要先除去结缔组织、脂 肪等非活性部分，绞碎后在适当的溶剂中提取，如果 所要求的成分在细胞内，则要先破碎细胞。植物要先 去壳、除脂。微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。 生物材料如暂不提取，应冰冻保存。动物材料则需深 度冷冻保存。,,,,,
（二）,,,,,细胞的破碎,,,,,
,,,,,1．机械法：
,,,,,1),,,,,研磨 将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石英 砂研磨或匀浆，即可将动物细胞破碎，这种方法比较温 和，适宜实验室使用。工业生产中可用电磨研磨。细菌 和植物组织细胞的破碎也可用此法。
2),,,,,组织捣碎机 这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，为了防止发热和升 温过高，通常是转10秒～20秒，停10秒～20秒，可反复 多次。,,,,,,,,,, ,,,,,
生物化学综合性实验的设计与实现——以亲和层析法纯化猪胰蛋白酶为例
生物化学综合性实验的设计与实现——以亲和层析法纯化猪胰蛋白酶为例黄体冉;刘悦萍;张国庆;王文平;张静【期刊名称】《实验室研究与探索》【年(卷),期】2017(036)004【摘要】生物化学实验是生命科学领域一门重要专业基础课,其所包含的实验技术在训练学生基本技能、培养实践能力和创新能力上起着至关重要的作用.围绕生物化学中蛋白质化学、酶学性质的有关内容,将鸡卵粘蛋白的制备、猪胰蛋白酶的制备、猪胰蛋白酶的纯化以及纯胰蛋白酶活性和鸡卵粘蛋白抑制活性的测定重新整合,设计了一个包括蛋白质分离纯化、蛋白质含量测定以及酶活性测定3个单元的综合性实验,并将光谱和色谱技术融入其中.最后对实验内容的综合性设计部分进行了探索性研究,以期为生物化学综合性、设计性实验开发和研究提供参考.【总页数】5页(P179-183)【作者】黄体冉;刘悦萍;张国庆;王文平;张静【作者单位】北京农学院生物科学与工程学院,北京102206;农业部都市农业(北方)重点实验室,北京102206;北京农学院生物科学与工程学院,北京102206;北京农学院生物科学与工程学院,北京102206;北京农学院生物科学与工程学院,北京102206;北京农学院生物科学与工程学院,北京102206【正文语种】中文【中图分类】Q503【相关文献】1.亲和层析法纯化小鼠腹水来源的单克隆抗体的实验研究 [J], 徐颖;蒋玉平;马泓冰;胡玉敏;孙中文;张学光2.开设综合性、设计性生物化学实验的探索与实践--以河北北方学院医学检验学院生物化学实验教学改革为例 [J], 张效云;董明纲;宋桂芹;徐志伟;郝敏;辇晓峰;王文栋3.生物化学实验多媒体课件制作初探——亲和层析纯化胰蛋白酶示教片的制作 [J], 赵立青;李小菊4.亲和层析纯化猪胰蛋白酶的研究 [J], 孟国良5.亲和层析法纯化尿胰蛋白酶抑制剂及部分性质研究 [J], 胡加亮;王旻;李谦因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
实训三胰蛋白酶的制备及活力的测定
实训三胰蛋白酶的制备及活力的测定目的要求1．学习胰蛋白酶的纯化及其结晶的基本方法。
2．了解酶的活性与比活性的概念。
实验原理胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在Ca2+的存在下，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失去一段六肽，分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。
胰蛋白酶原的分子量约为24000，其等电点约为pH8.9，胰蛋白酶的分子量与其酶原接近（23300），其等电点约为pH10.8，最适pH7.6～8.0，在pH=3时最稳定，低于此pH时，胰蛋白酶易变性，在pH>5时易自溶。
Ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用。
重金属离子，有机磷化合物和反应物都能抑制胰蛋白酶的活性，胰脏、卵清和豆类植物的种子中都存在着蛋白酶抑制剂。
最近发现在一些植物的块基（如土豆、白薯、芋头等）中也存在有胰蛋白酶抑制剂。
胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。
此外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成的酰胺键或酯键，其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。
胰蛋白酶对这些键的敏感性次序为：酯键> 酰胺键> 肽键。
因此可利用含有这些键的酰胺或酯类化合物作为底物来测定胰蛋白酶的活力。
目前常用苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺（简称BAPA）和苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺（简称BANA）测定酰胺酶活力。
用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（简称BAEE）和对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（简称TAME）测定酯酶活力。
本实验以BAEE为底物，用紫外吸收法测定胰蛋白酶活力。
酶活力单位的规定常因底物及测定方法而异。
从动物胰脏中提取胰蛋白酶时，一般是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出来，然后再根据等电点沉淀的原理，调节pH以沉淀除去大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量糜蛋白酶原和弹性蛋白酶原）沉淀析出。
实验报告亲和层析法纯化胰蛋白酶
亲和层析法纯化胰蛋白酶一．实验目的1.理解亲和层析法的根本原理，并通过实验能初步掌握制备一种亲和吸附剂的操作方法；2.掌握利用紫外可见分光光度计测定酶活性和抑制酶活性的原理和方法。
二．实验原理亲和层析主要是根据生物分子与其特定的固相化的配基或配体之间具有一定的亲和力而使生物分子得以别离。
这是由一种典型的吸附层析开展而来的别离纯化方法。
许多生物分子都具有能和某些相对应的专一分子可逆地结合的特性。
这种分子之间的结合能力做亲和力。
亲和层析正是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。
所以有人称为“生物专一吸附技术〞。
在实际工作中，只要把被识别的分子，称为配基〔Ligand〕，在不损害其生物学功能的条件下共价结合到水不溶性载体或基质上〔如Sepharose4B〕制成亲和吸附剂，然后装柱。
再把含有要别离纯化的物质的混合液通过这个柱子，这时绝大局部对配基没有亲和力的化合物均顺利地流过层析柱而不滞留，只有与配基互补的化合物被吸附留在柱。
当所有的杂质从柱上流走后，再改变洗脱条件，使结合在配基上的物质解离下来。
这样，原来混合液中被别离的物质便以高度纯化的形式在洗脱液中出现。
本实验为了纯化胰蛋白酶，采用胰蛋白酶的天然抑制剂—鸡卵粘蛋白作为配基制成亲和吸附剂。
鸡卵粘蛋白是专一性较高的胰蛋白酶抑制剂，对牛和猪的胰蛋白酶有相当强的抑制作用，但不抑制糜蛋白酶。
在pH=7-8的缓冲溶液中卵粘蛋白与胰蛋白酶结实地结合，而在pH=2-3时，又能被解离下来。
采用鸡卵粘蛋白作成的亲和吸附剂可以从粗提液过一次亲和层析直接获得高纯度的胰蛋白酶制品，比用经典别离纯化方法简便得多。
纯化效率可到达10-20倍以上。
三．实验方法步骤1.鸡卵粘蛋白的制备取蛋清60ml，参加等体积的三氯乙酸丙酮溶液〔丙酮：三氯乙酸=40:60〕后，出现大量白色沉淀，搅匀后室温静置4h以上，待清蛋白完全沉淀，3000rpm离心10min，弃去沉淀，47ml上清液倒入250ml锥形瓶并用塑料薄膜封好，置于冰箱中冰浴片刻，缓慢参加3倍体积(141ml)的预冷丙酮，搅匀后冰浴4h直到出现沉淀,用真空泵抽去局部上清液，剩余局部的局部沉淀和上清液全部转移至离心管中，以3000rpm下离心15min，弃上清液。
胰蛋白酶活性测定
实验一胰蛋白酶活性测定实验目标：控制测定胰蛋白酶浓度.活性.比活的道理与办法.实验道理：胰蛋白酶相对分子量23.7 KD,重要水解肽链中碱性氨基酸与其它氨基酸相衔接的肽键,此外还能水解碱性氨基酸形成的酯键, 如把人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（N-benzuyl-L-argine ethyl ester, BAEE）水解为H-苯甲酰-L-精氨酸（BA）.胰蛋白酶所催化的上述反响中,产品BA对253 nm 的光接收弘远于BAEE,是以可以在实验肇端点把253 nm 的消光值调为零,然跋文录反响体系对253 nm 的消光值的增量,并把这个增量作为测定胰蛋白酶的活性指标.酶活单位界说：在底物BAEE浓度1mmol/L,光程1 cm,波长253nm,温度250C,测量体积3mL,.前提下吸光值每分钟递增0.001（A/min=0.001）为1个BAEE酶活单位.胰蛋白酶制剂中蛋白质浓度寄义：胰蛋白酶含量一般E1%表达.这个值的寄义是：浓度为1% 酶蛋白,在1cm光径下,对紫外280nm的消光值.不合厂家.不合产品的E1%值有很大不同.E1%值越高,标明酶制剂中酶蛋白含量越高.因为酶制剂中蛋白质含量各不雷同,所以用酶制剂配制E1%的蛋白质溶液时,按照厂家对产品的E1%的测定值配制溶液.在本实验中,胰蛋白酶酶蛋白样品采取SIGMA 公司临盆的产品,临盆公司对展品的描写是对280nm紫外接收值15.3, 配制胰蛋白酶尺度溶液可依据厂家的这个解释.器材以试剂：器材,电子天平,紫外分光光度计,微量加样器.试剂：尺度胰蛋白酶,N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯,HCI, Tris.1．胰蛋白酶活性测定：1）配制E1%的胰蛋白酶溶液每组取E1%=15.3的胰蛋白酶样品10mg 放到1ml去离子水中,充分消融后,放入冰中保管.2)按照表1 的请求配制实验体系所需其它各类溶液.3)按照表1的次序进行测定尺度胰蛋白酶的活性.表1 胰蛋白酶活性测定加样次序试剂步调1：空白调零步调2：样品测定Cl 缓冲液,pH8.0,1.5 mL1.5 mL2.0 m mol/L BAEE 1.5 mL1.5 mL250C预热5min 250C预热5min胰蛋白酶:10mg/mL 0 μL 10μL蒸馏水10 μL 0 μL充分摇匀充分摇匀步调1：∆A253 nm/min调0 -----------步调2：∆A253-nm/min -------------- 记载在步调2样品测定中,参加酶液后立刻盖上盖敏捷混匀计时,每半分钟读数一次,共读3～4min.测得的成果要使△A253nm,若偏离此规模则要恰当增减酶量（5μL-20μL之间,空白实验响应增减等体积水）后从新测定,一向到△A253nm/min值落为止.3分离求算：1)尺度胰蛋白酶溶液（浓度10mg/mL）的酶活和比活：盘算办法：i)胰蛋白酶活性单位数盘算：ii)胰蛋白酶比活盘算: (用BAEE单位数/mg胰蛋白酶暗示比活)实验二胰蛋白酶动力学测定实验目标：初步控制以下几个酶动力学参数测定与求算办法：米氏常数Km,最大反响速度Vmax,转换数cat,特异性常数cat,/Km.实验道理：已知胰蛋白酶遵照米氏方程,可以经由过程测定底物浓度与反响速度间的关系测定与求算这个酶的诸动力学参数.胰蛋白酶可以水解碱性氨基酸的羧基所生成的肽键.酰胺建和酯键.在本实验中,应用胰蛋白酶水解酰胺键活性的性质,以苯甲酰-L-精氨酰-对硝基苯胺（BAPA）作底物测定这个酶的动力学参数,反响式如下：反响最适pH8.1,最适温度25 0C.反响产品之一：对硝基苯胺 (p-Nitroaniline,4-NA)呈黄色,对405nm波长光的摩尔吸光系数为9870,但底物BAPA和另一个产品BA对405nm波长的光根本不接收, 是以本实验测定光波的波长设在405nm上,把肇端反响的吸光值调为0,记载消光值的变更.L-BAPA最大浓度低于5104mol/L时这个酶促反响相符米氏方程,可用Hanes作图法求动力学参数.Hanes作图法是单倒数作图法,把米氏方程变形为：在实验中设定一系列底物浓度[S i],测定每一个底物浓度前提下的反响速度i,然后用[Si]/i 对[Si]作图,可以得到一条线段,线段在y 轴的截距是Km/Vmax, 线段的延伸线在x轴的截距是-Km,据此可以得到Km和 Vmax值;cat=Vmax /[E t].[E t]是酶的初始浓度,已在实验设定为已知,是以cat可以得出;特异性常数Km/cat可依据上述已知数盘算出来.器材与试剂：器材：756紫外-可见分光光度计,恒温水浴锅,剖析天平,秒表,容量瓶,移液器.试剂：1．0.1mol/L pH8.1的Tris-HCI缓冲液（含0.4%CaCl2）2,蒸馏水定容到200mL（pH值需用计pH校订）.2．1mmol/L DL-BAPA（Mr=434.9）水溶液：称取43.49mg BAPA,蒸馏水消融并加热到80 0C以上,完整消融后置冰水中冷却,定容到100mL. 这个浓度为1mmol/L的DL-BAPA溶液定名为第六组母液,按照慢慢稀释原则配制下列溶液浓度系列：0.8mmol/L （第五组母液,25mL）;0.6mmol/L （25mL,第四组母液）;0.4mmol/L （25mL,第三组母液）;0.2mmol/L （10mL,第二组母液）;0.1mmol/L （10mL,第一组母液）.3．60%（V/V）乙酸溶液4．胰蛋白酶溶液,该酶的比活104 BAEE 单位/mg蛋白实验步调：1．盘算胰蛋白酶加样体积：在本实验中参加胰蛋白酶的量是60g,实验 1 已经测到胰蛋白酶的比活和浓度（g/L）,依据这些值盘算参加体系的酶液体积的L数.2．实验溶液体系：本实验有6组实验构成.实验次序按照表2的加样程序履行.表2. 测定Km 和Vmax值加样表组BAPA母液浓度（mmol/L）参加BAPA母液（mL）参加Tris-HCI（mL）参加胰蛋白酶（μL）参加60%乙酸（mL）反响体系底物BAPA浓度（mmol/L）νA4051. n[S12 n[S2[S33 n[S44 0. 6 n5 n[S5[S66 1 .0 n25 0C 保温 5 min后,摇匀,秒表计时,精确反响2min后参加0.4mL 60%的乙酸溶液,摇匀终止反响.反响溶液总量应达到4mL,缺少部分可加蒸馏水补足.对比试管不参加胰蛋白酶,只参加0.4mL 60%的乙酸溶液.最后分离记载样品和对比的A405值,每组种两者的差值A405 代入下式即可得到对应于[S i]的i表2列出的是6个实验,鉴于今朝实验室尚没有12个枪头的加样,所以每一个实验都可自力进行.[须要特别留意：104 BAEE u/mg protein的胰蛋白酶制剂,纯度规模是90%-100%,一般可达到95%-97%.在盘算动力学参数时,如无特别精确请求,可按照胰蛋白酶100%的近似值盘算.在本实验中,可依据浓度胰蛋白酶浓度10mg/ml, 纯度100%, 每个试管请求参加质量数60g,盘算出每个试管参加的胰蛋白酶溶液微升数.2）在进行为力学参数盘算时,要进行胰蛋白酶质量-摩尔数转换,如无特别请求,也可以把胰蛋白酶纯度近似为100%.3）假如有求精确, 但产品解释没有给出胰蛋白酶在固形物中的百分含量,就需配制必定浓度的固形物溶液,起首测定蛋白质浓度,经由过程求算蛋白质总量,得到蛋白质在酶制剂中的重量比.然后经由过程双向电泳,图像扫描,把扫描成果输入盘算软件,按照软件步调,求算胰蛋白酶在全体蛋白样品中的百分比.把实验设定的每一个[Si]和测定到的对应的Vi换算成[Si/Vi]后,填入表3,作图求Km,Vmax表3.Hanes 作图的数据[ Si]/νI: [S1]/ν1[S2]/ν2 [S3]/ν3 [S4]/ν4 [S5]/ν5 [S6]/ν6[Si] : [S1][S2][S3] [S4][S5][S6]用[S]/对[S]作图可得到一条线段,线段与轴的截距是Km/Vmax,线段延伸线与x轴的截距是-Km,依据方程可以得到Km,Vmax依据cat=Vmax/[E t], 求算cat 和Km/cat留意：上式的酶浓度单位是mol/L, 已知酶浓度是10mg/ml,须要依据胰蛋白酶相对分子量23,7 KD,纯度100%进行换算.实验完成后陈述胰蛋白酶的动力参数：Km,Vmax,cat, Km/cat。
胰蛋白酶活性测定
实验一胰蛋白酶活性测定实验目的：掌握测定胰蛋白酶浓度、活性、比活的原理与方法。
实验原理：胰蛋白酶相对分子量23.7 KD，主要水解肽链中碱性氨基酸与其它氨基酸相连接的肽键，此外还能水解碱性氨基酸形成的酯键，如把人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（N-benzuyl-L-argine ethyl ester, BAEE）水解为H-苯甲酰-L-精氨酸（BA）。
胰蛋白酶所催化的上述反应中，产物BA对253 nm 的光吸收远大于BAEE，因此可以在实验起始点把253 nm 的消光值调为零，然后记录反应体系对253 nm 的消光值的增量，并把这个增量作为测定胰蛋白酶的活性指标。
酶活单位定义：在底物BAEE浓度1m mol/L，光程1 cm，波长253nm，温度25 0C，测量体积3mL,.条件下吸光值每分钟递增0.001（ A/min=0.001）为1个BAEE酶活单位。
胰蛋白酶制剂中蛋白质浓度含义：胰蛋白酶含量一般E1%表达。
这个值的含义是：浓度为1% 酶蛋白，在1cm光径下，对紫外280nm 的消光值。
不同厂家、不同产品的E1%值有很大差别。
E1% 值越高，表明酶制剂中酶蛋白含量越高。
由于酶制剂中蛋白质含量各不相同，所以用酶制剂配制E1%的蛋白质溶液时，按照厂家对产品的E1% 的测定值配制溶液。
在本实验中，胰蛋白酶酶蛋白样品采用SIGMA 公司生产的产品,生产公司对展品的描述是对280nm紫外吸收值15.3，配制胰蛋白酶标准溶液可根据厂家的这个说明。
器材以试剂：器材，电子天平，紫外分光光度计，微量加样器。
试剂：标准胰蛋白酶，N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯，HCI, Tris。
1．胰蛋白酶活性测定：1）配制E1%的胰蛋白酶溶液每组取E1%=15.3的胰蛋白酶样品10mg 放到1ml去离子水中，充分溶解后，放入冰中保存。
2)按照表1 的要求配制试验体系所需其它各种溶液.3)按照表1的顺序进行测定标准胰蛋白酶的活性。
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实验十猪胰蛋白酶的纯化及其活性测定
一、实验目的
1. 学习胰蛋白酶的纯化及其结晶的基本方法。
2. 学习用紫外法测定酶活性，搞清酶活性与比活性的概念。
二、实验原理
胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在Ca2+的存在下，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失去一段六肽，分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。
胰蛋白酶原的分子量约为24000，其等电点约为pH8.9，胰蛋白酶的分子量与其酶原接近（23300），其等电点约为pH10.8，最适pH7.6～8.0，在pH=3时最稳定，低于此pH时，胰蛋白酶易变性，在pH>5时易自溶。
Ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用。
重金属离子，有机磷化合物和反应物都能抑制胰蛋白酶的活性，胰脏、卵清和豆类植物的种子中都存在着蛋白酶抑制剂。
最近发现在一些植物的块基（如土豆、白薯、芋头等）中也存在有胰蛋白酶抑制剂。
胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。
此外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成的酰胺键或酯键，其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。
胰蛋白酶对这些键的敏感性次序为：酯键> 酰胺键> 肽键。
因此可利用含有这些键的酰胺或酯类化合物作为底物来测定胰蛋白酶的活力。
目前常用苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺（简称BAPA）和苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺（简称BANA）测定酰胺酶活力。
用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（简称BAEE）和对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（简称TAME）测定酯酶活力。
本实验以BAEE为底物，排毒养颜胶囊用紫外吸收法测定胰蛋白酶活力。
酶活力单位的规定常因底物及测定方法而异。
从动物胰脏中提取胰蛋白酶时，一般是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出来，然后再根据等电点沉淀的原理，调节pH以沉淀除去大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量糜蛋白酶原和弹性蛋白酶原）沉淀析出。
经溶解后，以极少量活性胰蛋白酶激活，使其酶原转变为有活性的胰蛋白酶（糜蛋白酶和弹性蛋白酶同时也被激活），被激活的酶溶液再以盐析分级的方法除去糜蛋白酶及弹性蛋白酶等组分。
收集含胰蛋白酶的级分，并用结晶法进一步分离纯化。
一般经过2～3次结晶后，可获得相当纯的胰蛋白酶，其比活力可达到
8000～10000BAEE单位/毫克蛋白，或更高。
如需制备更纯的制剂，可用上述酶溶液通过亲和层析方法纯化。
三、器材与试剂
（一）器材
1. 新鲜或冰冻猪胰脏
2. 食品加工机和高速分散器
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3. 研钵
4. 大玻璃漏斗
5. 小塑料桶
6. 布氏漏斗
7. 抽滤瓶
8. 纱布
9. 恒温岳阳家政水浴
10. 紫外分光光度计
11. 秒表
12. pH试纸
（二）试剂
1. pH4～4.5乙酸酸化水
2. 2.5M H2SO4
3. 5M NaOH
4. 硫酸铵
5. 氯化钙
6. 2M NaOH
7. 0.8M，pH9.0硼酸缓冲液：取20ml 0.8M硼酸溶液，加80ml 0.2M四硼酸钠溶液，混合后，用pH计检查校正。
8. 0.4M pH9.0硼酸缓冲液（用“7”稀释1倍即可）
9. 0.2M pH8.0硼酸缓冲液：取70ml 0.2M硼酸溶液，加30ml 0.5M四硼酸钠溶液，混合后，用pH计校正。
10. 2M HCl
11. 0.01M HCl
12. BAEE－0.15M pH8.0Tris－HCl 缓冲液（每毫升Tris缓冲液含0.11毫克BAEE 和2.22毫克的氯化钙）
四、实验步骤
1. 猪胰蛋白酶结晶步骤
猪胰脏1.0公斤（新鲜的或杀后立即冷藏的），除去脂肪和结缔组织后，绞碎，加入2倍体积予冷的乙酸酸化水（pH4.0～4.5）于10～15℃搅拌提取24小时，四层纱布过滤得乳白色滤液，用2.5M H2SO4调pH至2.5～3.0，放置3～4小时后用折迭滤纸过滤得黄色透明滤液（约1.5升），加入固体硫酸铵（予先研细），使溶液达0.75饱和度（每升滤液加492克）放置过夜后抽滤（挤压干），滤饼分次加入10倍体积（按饼重计）冷的蒸馏水，使滤饼溶解，痔疮偏方得胰蛋白酶原溶液，取样0.5ml后进行活化：慢慢加入研细的固体无水氯化钙（滤饼中硫酸铵的含量按饼重的四分之一计）使Ca2+与SO42-结合后，溶液中仍含有0.1M CaCl2，边加边搅拌，用5M NaOH调pH至8.0，加入极少量猪胰蛋白酶轻轻搅拌，于室温下活化8～10小时，（2～3小时取样一次，并用0.001M HCl稀释），测定酶活性增加的情况。
活化完成（比活约3500～4000BAEE单位）后，用2.5M H2SO4调pH至2.5～3.0，抽滤除去CaSO4沉淀，弃去滤饼，滤液取样测定胰蛋
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白酶活性及蛋白质含量，按242克/升加入细粉状固体硫酸铵，使溶液达到0.4饱和度，放置数小时后，抽滤，弃去滤饼，滤液按250克/升加入研细的硫酸铵，使溶液饱度达到0.75，
放置数小时，抽滤，弃去滤液，滤饼（粗胰蛋白酶）溶解后进行结晶：按每克滤饼溶于1.0ml pH9.0 的0.4M硼酸缓冲液的量计加入缓冲液，小心搅拌溶解，取样后，用2M NaOH调pH至8.0，注意要小心调节，偏酸不易结晶，偏碱易失活，存放于冰箱。
放置数小时后，应出现大量絮状物，溶液逐渐变稠呈胶态，再加入总体积的1/4～1/5的pH8.0的0.2M硼酸缓冲液，使胶态分散，必要时加入少许胰蛋白酶晶体。
放置2～5天可得到大量胰蛋白酶结晶，每天观察，核对pH是否为8.0并及时调整。
用显微镜观察，待结晶析出完全时，抽滤，母液回收，一次结晶的胰蛋白酶产物再进行重结晶：用约1倍的0.025M HCl，使上述结晶分散，加入约1.0～1.5倍体积的pH9.0 的0.8M硼酸缓冲液，至结晶酶全部溶解，取样后，用2M NaOH调溶液pH至8.0（准确）（体积过大，很难结晶）怎么减肚子，冰箱放置1～2天，可将大量结晶抽滤得第二次结晶产物(母液回收)，冰冻干燥后得重结晶的猪胰蛋白酶。
2. 胰蛋白酶活性的测定
⑴紫外法测定酶溶液的蛋白质含量
在280nm测得蛋白质溶液的吸光度，除以该蛋白质的比消光系数，即可算出该蛋白质溶液的浓度（mg/ml）。
少量氯化钠、硫酸铵、磷酸盐、硼酸盐和Tris等无明显干扰作用。
紫外法操作简便、快速，适合于制备过程中进行监测。
测定时将待测酶液用0.001M HCl稀至适当浓度，以0.001M HCl作对照。
猪胰蛋白酶在280nm的比消光系数为：E1%1cm=13.5 ，所以当其浓度为1mg/ml时，消光系数应为1.35。
胰蛋白酶的蛋白含量(mg/ml)＝A280×稀释倍数/1.35
⑵胰蛋白酶活力的测定（BAEE法）：参见亲和层析实验。
五、注意事项
1. 胰脏必需是刚屠宰的新鲜组织或立即低温存放的，否则可能因组织自溶而导致实验失败。
2. 在室温14～20℃条件下8～12小时可激活完全，激活时间过长，因酶本身自溶而会使比活降低，比活性达到“3000～4000BAEE单位/mg蛋白”时即可停止激活。
3. 要想获得胰蛋白酶结晶，在进行结晶时应十分细心地按规定条件操作，切勿粗心大意，前几步的分离纯化效果愈好，则培养结晶也较容易，因此每一步操作都要严格。
酶蛋白溶液过稀难形成结晶毛孔大怎么办，过浓则易形成无定形沉淀析出，因此，必需恰到好处，一般来说待结晶的溶液开始时应略呈微浑浊状态。
4. 过酸或过碱都会影响结晶的形成及酶活力变化，必须严格控制PH。
5. 第一次结晶时，3～5天后仍然无结晶，应检查pH，必要时调整pH或接种，促使结晶形成。
重结晶时间要短些。
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