蚓激酶活性测定方法

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酶活性测定的方法

酶活性测定的方法
1. 分光光度法：利用酶反应所产生的光学变化，测定吸光度的变化来推断酶活性的大小。

2. 电化学法：利用酶催化反应产生的电化学反应，测定电流的变化来推断酶活性的大小。

3. 比色法：利用酶反应所产生的还原物或氧化物使某一与之相应的指示剂发生颜色变化，来推断酶活性的大小。

4. 管道法：将酶溶液、底物和指示剂分装在不同的细管内，然后加入底物的初始剂量使反应开始，观察指示剂的变化时间来推断酶活性的大小。

5. 放射性测定法：利用放射性同位素标记底物或产物，测定其放射性的变化来推断酶活性的大小。

酶活测定方法

、酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。

在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。

通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。

色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。

该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。

粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。

木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。

基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。

高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。

免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。

这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。

免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。

琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。

用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。

在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。

蛋白酶活力测定法本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。

1 福林法1.1 试剂及溶液: 以下试剂都为分析纯1.1.1 福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h。

测定酶活性浓度的两大类方法

三、连续监测法测酶活性浓度
连续监测法具有众多的优点，随着科学技术的发展，自动生化仪的使用，正在逐步取代“固定时间法”，发达国家从 50 年代到 70 年代末用了约 20 余年的时间，我国从 80 年代初开始使用连续监测法，虽然发展很快，但至少仍有不少地区医院实验室仍使用老的方法，就是已使用新法的实验室，也不一定掌握得很好，本节将比较详细地从分类，酶偶联反应，测定注意事项等方面对连续监测法加以介绍。
当测定酶的反应速度明显大于指示酶，此时 A 很快转变为 B，由于指示酶反应慢，中间产物 B 大量推积，最终产物产生速度明显慢于底物 A 的消失速度。
当指示酶速度加大后，中间产物 B 堆积减小，指示酶反应速率偏差程度也变小。只有当指示酶大量达到高峰后的时期），C 和 A 的变化速度非常一致。也就是只有在些情况下，才是测定酶浓度的理想条件。
⒉间接连续监测法直接法试剂简单，操作方便，可惜的是只有当底物与产物之间，在光学性质或其它理化性质有显著差异时，才有可能使用此法。到目前为止，大部分酶都无法用直接法测定。
科学家还曾设法在原来反应体系中添加一些试剂，这些试剂必须不与酶作用也不影响酶活性，同时又能与酶反应物迅速作用，产生可以被直接测定的物质，典型的例子是 Ellman 的胆碱酯酶测定法，底物为硫代乙酰胆碱，酶水解产物硫代胆碱与添加的二硫代硝基苯甲酸（DTNB）作用立刻生成黄色化合物，可在 412nm 用分光光度法连续监测。
从理论上说，用酶偶联反应测酶活性浓度时，最好条件应是测定酶反应为限速反应。动力学上为零级反应，而指示酶为一级反应，酶反应速度与指示酶底物浓度相关。
（二）指示酶、辅助酶的种类和浓度
指示酶、辅助酶的种类：常规化验中常用的酶偶联法中，多以脱氢酶为指示酶，在常规化验中的自动分析仪几乎无一例外都有 340nm 波长，通过 NAD(P)H 系统可以很方便地监测到指示酶反应。但从理论上说，往往可以有不止一种偶联方法，只要设法使偶联反应中最后一个是指示酶反应，前面已提到测 CK 可以正向逆向二个方向建立二种不同酶偶联的反应。又如在丙氨酸转氨基酶（ALT）测定法中，正向反应后产生丙酮酸和谷氨酶，目前最常用的是用乳酸脱氢酶与丙酮酸偶联反应，伴有 NADH 下降。但也可以用谷氨酸脱氢酶与谷氨酸作用，伴有 NADH 生成。

探索气泡上升法测定蚓激酶效价

中国生化药物杂志 2017 年第8期总第 37 卷论著生化药物技术探索气泡上升法测定蚓激酶效价刘莉莎1，黄素娟2，范慧红1△（1.中国食品药品检定研究院北京，102629；2.国家食品药品监督管理总局药品审评中心，北京 100038）[摘要]目的采用气泡上升法测定蚓激酶效价。

方法在37℃环境下，在试管中依次加入纤维蛋白原、蚓激酶，以及凝血酶和纤维蛋白溶酶原的混合溶液，迅速混匀计时，待气泡上升至整个体系1/2时停止计时。

以标准品溶液浓度对数为横坐标，时间对数为纵坐标进行线性回归，通过线性回归方程计算样品蚓激酶的效价。

结果线性回归方程为y=-1.1513x+4.3136，R2=0.9969，精密度及重复性RSD值分别0.73%及6.01%。

结论气泡上升法能够测定蚓激酶的双重活性，更好地反应出蚓激酶的效价特点。

[关键词]蚓激酶；效价；气泡上升法；平板法；双重酶活性[中图分类号] R927 [文献标识码] ADetermination of the activity of lumbrokinase by the bubble rise methodLIU Li-sha1，HUANG Su-juan2，FAN Hui-hong1△(1.National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 102629, China; 2. Center for Drug Eraluation CFDA, Beijing 100038, China)[Abstract] Objective To determine the activity of lumbrokinase by the bubble rise method. Methods In the 37℃ environment, added fibrinogen, lumbrokinase, thrombin and plasminogen were added in the test tube in turn, quickly mixed and timed, stopped timing until the bubble rose to the half of the whole system. The logarithm of the concentration of the standard solution was the abscissa, and the logarithm of the time was the ordinate. The activity of the lumbrokinase was calculated by the linear regression equation. Results The linear regression equation was y=-1.1513x+4.3136, R2=0.9969. The accuracy and repeatability were 0.73% and 6.01%. Conclusion The bubble rise method could determine the double activities of lumbrokinase, better response the characteristics of lumbrokinase.[Keywords] lumbrokinase; activity; bubble rise method; plate method; double activities资助项目：中国食品药品检定研究院2015年中青年发展研究基金（2015A02）作者简介：刘莉莎，女，硕士，副主任药师，研究方向：酶类生化药物质量，E-mail：jzllisha@；范慧红，通信作者，女，博士，研究员，研究方向：生化药物质量，E-mail：shenghuayaoshi@126. com。

蚓激酶提取工艺的初步研究

质的蚓激酶粗制品。
２２３二次盐析时铵盐饱和度对沉淀的影响．．将第一次盐析离心后的上清液分为８，用固份体硫酸铵调整盐析液的铵盐饱和度，静置后离心，测其沉淀量。
２２４定性测其酶活性．．
２２２提取工艺描述．．
取一定量的活蚯蚓，多次水洗，蚯蚓内脏中将
的污物排出，后空干多余水分，重。）］倍体积然称１４Ｉ
的缓冲液，放入匀浆器中匀浆ｌ分钟， ℃条件下０在４
放置３时后，００ｐ小８０ｒｍ离心２分钟，上清液加固０取体硫酸铵达￣３％饱和度，１ｏ再次离心。弃去沉淀，上
浆一静置一离心一上清液加硫酸铵一离心一上清
液加硫酸铵一离心一沉淀一透析去盐一冻干一蚓
激酶粗制品
白粗提取物中分离得到多组具有纤溶酶活性的蛋
白质，有溶栓作用，目前最具有开发前景的纤具是
２蚓激酶提取工艺的研究
因为蚓激酶是由多种有活性组分组成，以提所取时采用更适合工业化生产的工艺，择具有生物选
活性蛋白的分子量区间进行分离。２１材料和仪器．
清掖中加固体硫酸铵至较高饱和度，再次高速离心，集沉淀，收用缓冲液溶解，入透析袋中透析去放盐，然后在冷冻干燥机中冻干，得到淡棕色粉末物

蚓激酶活性的测定方法

1.蚓激酶活性的测定方法由于蚓激酶粉既具有激活纤维蛋白溶酶原变为纤维蛋白溶酶，从而溶解血栓，同时又能直接溶解血纤维蛋白，尿激酶只起激酶性质，目前还无法找到一个合适的试样作为标准对照品，故参照尿激酶琼脂糖—纤维蛋白平板法，制定了纤维蛋白平板法,采用直接测定纤维蛋白板中溶解纤维蛋白圈的大小来衡量蚓激酶粉的质量好坏。

a.试剂配制：（1）0.06M pH7.8磷酸盐缓冲液（PBS）称取Na2HPO4·12H2O21.4g，NaCl5.26g，加水900mL，用1N HCl调至pH7.8后，补水至1000mL。

（2）（牛）纤维蛋白原（70μ/瓶）取70μ纤维蛋白原，溶于20mL PBS（3.5μ/mL）中，水浴微热使溶。

（3）（牛）纤维蛋白溶酶原（12μ/瓶）取12μ纤维蛋白溶酶原，加入12 mL PBS（1酪蛋白单位/毫升）使溶，同时取3mL。

（4）（牛）凝血酶（70μ/瓶）取70μ凝血酶，加入7 mL PBS（10μ/mL ），同时取3mL。

（5）称琼脂糖330mg，加22mL PBS，加热使溶后体积变为20 mL, 放55ºC水浴中使之恒温待用。

b.纤维蛋白板的制作：将(2)、(5)、(3)、(4)按顺序依次加入混匀后，迅速倒入水平放置的（7.5×22.5cm）平板中，若有气泡，可在未凝固之前，用小钢铲将气泡赶走，待其凝固后，盖上盖，放4ºC冰箱1小时后，即可使用。

此板即为标准纤维蛋白板。

c.蚓激酶粉的活力的测定：用直径为3mm的不绣钢小管，在纤维蛋白板上打若干个小孔，称取蚓激酶粉若干（3-10mg），加蒸馏水配成1mg/mL的浓度，使其充分溶解，取溶液部份10μL点入每个小孔中，将板水平放37ºC恒温箱中保温18个小时后，测得溶圈直径（mm）。

按下列公式计算溶圈面积S=（D/2）2×3.14蚓激酶粉的活性=S×100（μ/mg）2.乙醚不溶物、丙酮不溶物的检测方法按SB/T 10206—94磷脂的质量标准执行6. 角鲨烯可参照脂肪酸的检测方法进行测定。

蚓激酶可行性研究报告

蚓激酶可行性研究报告1. 研究背景蚓激酶是一种新型的酶类，具有广泛的应用潜力。

它可以在低温和酸性环境下活性高效，且对蛋白质降解具有特殊的亲和性。

因此，研究蚓激酶的可行性对于开发新型酶制剂和蛋白质工程具有重要意义。

本报告旨在探究蚓激酶的可行性以及其在实际应用中的潜力。

2. 实验目的本实验的目的是通过对蚓激酶的性质和活性进行研究，评估其在实际应用中的可行性。

具体目标如下： 1. 测定蚓激酶的最适温度和pH值； 2. 比较蚓激酶与其他传统酶的活性差异； 3. 研究蚓激酶对特定蛋白质的降解效果；3. 实验方法3.1 蚓激酶的提取与纯化1.收集蚯蚓体液，离心沉淀得到固体物质；2.加入适量的缓冲液对固体物质进行悬浮和混合；3.过滤悬浮液，得到蚓激酶的提取液；4.对提取液进行分离和纯化，如使用离心、柱层析等技术。

3.2 蚓激酶的活性测定1.准备标准试剂和蚓激酶溶液；2.在不同温度和pH条件下，将蚓激酶溶液与标准试剂混合；3.测定反应液的吸光度变化，计算蚓激酶的活性；4.比较不同条件下的蚓激酶活性差异。

3.3 蛋白质降解实验1.准备待降解的蛋白质溶液和蚓激酶溶液；2.将蛋白质溶液与蚓激酶溶液混合，设定降解时间；3.取样并进行SDS-PAGE电泳分析；4.观察蛋白质降解程度，评估蚓激酶对特定蛋白质的降解效果。

4. 实验结果与分析4.1 蚓激酶的最适温度和pH值经过实验测定，蚓激酶在温度25°C和pH 7的条件下表现最佳活性。

较高或较低的温度和pH值均会降低酶的活性。

4.2 蚓激酶与传统酶的活性比较将蚓激酶与常见的蛋白酶进行活性比较实验发现，蚓激酶在低温和酸性环境下仍保持较高的活性，而传统酶在此条件下活性明显下降。

这表明蚓激酶具有更强的适应能力和稳定性。

4.3 蚓激酶对特定蛋白质的降解效果通过蛋白质降解实验，发现蚓激酶可以有效地降解目标蛋白质，且其降解效果与降解时间呈正相关关系。

蚓激酶在一定时间内可以将蛋白质降解至较小的分子量，从而为后续的蛋白质工程提供基础。

蚓激酶活性测定方法（附药典内容）

蚓激酶 Yinjimei Lumbrokinase本品系人工养殖的赤子爱胜蚓（Eisenia Foetida Savigny）中提取制备的一组蛋白水解酶。

按干燥品计算，每1mg效价应不得少于12000单位。

每1mg蛋白中蚓激酶比活力不得少于20000单位。

【性状】本品为淡黄色至黄褐色粉末；味腥，有引湿性。

【鉴别】（1）取本品适量，加水制成每1ml中含0.5mg的溶液，照分光光度法（中国药典2000年版二部附录IV A）测定，在278nm的波长处有最大吸收。

（2）取本品适量，加0.9％氯化钠溶液制成每1ml中含10mg的溶液，作为供试品溶液；用6号针头取动物血1滴于试管底部，30分钟后，加供试品溶液1ml置试管中，轻轻摇动，血凝块应在60分钟内溶解。

以0.9％氯化钠溶液1ml为空白，同法操作，血凝块应不溶解。

【检查】酸碱度取本品，加水制成每1ml中含1mg的溶液，依法测定（中国药典2000年版二部附录VI H），pH值应为6.0～8.0。

溶液的澄清度与颜色取本品适量，加水制成每1ml中含1mg的溶液，溶液应澄清；如显色，与黄色2号标准比色液（中国药典2000年版二部附录IX A第一法）比较，不得更深。

干燥失重取本品适量，以五氧化二磷为干燥剂，在60℃减压干燥至恒重，减失重量不得超过5.0％（中国药典2000年版二部附录VIII L）。

【比活力测定】效价测定（1）试剂0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.8）取磷酸氢二钠3.58g，加水使溶解并稀释至1000ml为A液；取磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）0.78g，加水使溶解并稀释至500ml为B液；将A、B两液混合至pH值为7.8。

工作溶液取0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.8）与0.9％氯化钠溶液（1:17）混合。

1.5%琼脂糖溶液取琼脂糖1.5g，加工作溶液100ml加热溶解。

纤维蛋白原溶液取纤维蛋白原适量，加工作溶液制成每1ml中含1.5mg的可凝蛋白溶液。

秉前环毛蚓蚓激酶的提取及活性研究初报

粗提，蚓激酶粗提物置-4 ℃恒温箱中保存备用。 1.2 试验方法 1.2.1 蚓激酶粗提物的提取
提取蚓激酶工艺流程为[9]：原材料蚯蚓→多次水
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林佳艳，王文文，唐梅：秉前环毛蚓蚓激酶的提取及活性研究初报
组含量高。在鸡血块被酶解后，所含可溶性蛋白质含量明显提高，由0.24%上升到0.62%。由此可知，蚓激酶粗提物具有酶活性，能够酶解鸡血块使其蛋白含量增加。
表1 经蚓激酶粗提物酶解后的鸡血块中可溶性蛋白含量
组别 1 2 3
HCL溶液用量/mL 0.54 0.60 1.40
蛋白质含量/% 0.24 0.27 0.62
亮[6]分离得到相对分子质量为36 000和29 000的两种纤 1.1 试验材料
溶酶组分，能够较好地溶解纤维蛋白及家兔血凝块。邓国宝等[7]发现蚓激酶具有良好的降低血糖、血脂功能。董强等[8]发现蚓激酶可用来治疗和预防缺血性脑
试验材料为峨眉山大蚯蚓（秉前环毛蚓），2017 年7月在峨眉山报国寺、清音阁、万年寺和洪椿坪一带（海拔500～1 200 m）采得。峨眉山大蚯蚓先进行
praepinguis ），是峨眉山的特有种，主要分布在峨眉山的龙门洞（海拔约600 m）至万年寺（海拔约1 000 m）[4]。峨眉山大蚯蚓肌肉很发达，伸缩能力强，可有效改善
欢在潮湿阴暗、较疏松及腐殖质多的土壤中营穴居生和净化土壤。本试验从峨眉山大蚯蚓体内提取蚓激酶
活，通常昼伏夜出，能够有效地躲避天敌[4]。
2.3 蚓激酶粗提物的pH稳定性测定混合液放置一段时间，进行活性测定，结果如
海等的方法[12]。 1.2.5 测定各种金属离子对蚓激酶粗提物活性的影响

酪蛋白平板法检测蚯蚓纤溶酶活性

之间有关睡眠问题的不同。洛杉矶加利福尼亚大学的神经病学家和睡眠研究者 Michael Irwin 说 ,睡眠障碍正日益被认为是疾病的预警信号 ,特别是在老年人群中。睡眠问题可能以多种途径加速死亡。例如 , Irwin 指出睡眠障碍与免疫系统损伤之间具有一定的联系。还有其他资料表明 ,睡眠障碍还与心脏疾病以及神经递质紊乱从而与脑部疾病紧密相关。她的小组研究还表明 ,呼吸暂停综合征、生理节律的紊乱以及一些尚未能检测出的处于早期阶段的进行性脑部疾病也可能导致死亡。 Dew 说 ,这项新的发现绝不要让人们去向他们的医生寻求安眠药。为了得到更好的睡眠 ,他的第一个建议是有规律的上床和起床 ,每天锻炼和节制饮洒。
源 , 1999 ; 21(4) : 34 - 383 3 赵晓瑜 ,静天玉. 蚯蚓纤酶的成分分析 ,中国生物和生物学报 ,1998 ;14
(4) : 407 - 412 4 徐义辉 , 梁国栋 , 孙兆军等. 蚯蚓纤溶酶新基因 PV242| 的克隆与表
达. 生物化学与生物物理进展 , 2002 ; 29(4) : 610 - 614
二、结果
1. 酪蛋白平板法和纤维蛋白平板法比较从图 1 可以看出 ,粗酶液在酪蛋白平板和纤维蛋白平板上都有溶圈 ,因此可以用酪蛋白平板代替纤维蛋白平板检测粗酶液的纤溶酶活性. 在纤维蛋白平板上 ,在乳白色的背景上可以直接观察到边缘清晰的透明圈 ,在酪蛋白平板上 ,由于含酪蛋白的平板本身为无色透明的 ,不能直接观察到酶对底物的水解 ,用考马斯亮蓝染色后 ,可以观察到蓝色背景上的透明圈. 相同的酶量在酪蛋白平板上的溶圈直径大于纤维蛋白平板上的溶圈直径 , 表明纤溶酶水解酪蛋白的能力大于水解纤维蛋白的能力.
酪蛋白平板法检测蚯蚓纤溶酶活性

广地龙药材中蚓激酶的生物活性测定

广地龙药材中蚓激酶的生物活性测定陆耀盈１，孙　洁２，马志国２（１广州王老吉药业股份有限公司，广东广州５１０４５０；２暨南大学药学院，广东广州５１０６３２）摘要：目的　采用纤维蛋白原平板法建立广地龙药材中蚓激酶的生物活性测定方法。

方法　以纤维蛋白原为底物，与琼脂糖和凝血酶按比例混匀制成纤维蛋白原平板。

以蚓激酶标准品在该平板上的扩散反应，制作标准曲线及回归曲线，并对蚓激酶的生物活性进行定量测定。

结果　蚓激酶的标准曲线线性关系良好（ｒ≥０９９９８），同板精密度的ＲＳＤ为５０２％，异板精密度的ＲＳＤ为３１１％，重复性和稳定性的ＲＳＤ值均为２９８％；平均回收率为１００１１％，ＲＳＤ为７８４％。

表明该方法准确，稳定性、重复性良好。

结论　纤维蛋白平板法可用于广地龙药材中蚓激酶的含量测定。

关键词：广地龙药材；纤维蛋白平板法；蚓激酶；活性测定中图分类号：Ｒ９２７　文献标识码：Ａ　文章编号：１００６３７６５（２０２０）０７００５６０３作者简介：陆耀盈，男（１９８５９－）。

从事中药制剂工艺研究。

Ｅｍａｉｌ：４１２９２１５２０＠ｑｑｃｏｍ通讯作者：马志国。

Ｅｍａｉｌ：ｍｚｇ７９＠ｈｏｔｍａｉｌｃｏｍ基金项目：国家发展和改革委员会、国家中医药管理局中药标准化项目（ＺＹＢＺＨＹＧＤ１３）ＳｔｕｄｙｏｎｔｈｅＢｉｏａｓｓａｙｏｆＬｕｍｂｒｏｋｉｎａｓｅｉｎＧｕａｎｇＤｉＬｏｎｇＬＵＹａｏｙｉｎｇ１，ＳＵＮＪｉｅ２，ＭＡＺｈｉｇｕｏ２（１ＧｕａｎｇｚｈｏｕＷａｎｇｌａｏｊｉＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣａｍｐａｎｙＬｉｍｉｔｅｄ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０４５０，Ｃｈｉｎａ；２ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＪｉｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０６３２，Ｃｈｉｎａ）ＡＢＳＴＲＡＣＴ：ＯＢＪＥＣＴＩＶＥ　ＴｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｌｕｍｂｒｏｋｉｎａｓｅｉｎＧｕａｎｇＤｉＬｏｎｇｂｙｆｉｂｒｉｎｐｌａｔｅｍｅｔｈｏｄａｎｄｃｏｍｐａｒｅｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔＭＥＴＨＯＤＳ　ＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎｗａｓｕｓｅｄａｓａｓｕｂｓｔｒａｔｅａｎｄｍｉｘｅｄｗｉｔｈａｇａｒｏｓｅａｎｄｔｈｒｏｍｂｉｎｉｎｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｔｏｐｒｅｐａｒｅｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎｐｌａｔｅｓＴｈｅｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅａｎｄｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｃｕｒｖｅｗｅｒｅｍａｄｅｂｙｔｈｅｄｉｆｆｕｓｉｏｎｒｅａｃｔｉｏｎｏｆｌｕｍｂｒｏｋｉｎａｓｅｏｎｔｈｅｐｌａｔｅ，ａｎｄｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｌｕｍｂｒｏｋｉｎａｓｅｗａｓｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｌｙｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄＲＥＳＵＬＴＳ　Ｔｈｅｌｉｎｅａｒｃｕｒｖｅｏｆｔｈｅｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｏｆｌｕｍｂｒｏｋｉｎａｓｅｗａｓｇｏｏｄ（ｒ≥０９９９８），ｔｈｅＲＳＤｏｆｔｈｅｓａｍｅｐｌａｔｅｐｒｅｃｉｓｉｏｎｗａｓ５０２％，ｔｈｅＲＳＤｏｆｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｌａｔｅｐｒｅｃｉｓｉｏｎｗａｓ３１１％，ａｎｄｔｈｅＲＳＤｏｆｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙａｎｄｓｔａｂｉｌｉｔｙｗｅｒｅｂｏｔｈ２９８％，ａｎｄｔｈｅａｖｅｒａｇｅｒｅｃｏｖｅｒｙｒａｔｅｗａｓ１００１１％（ＲＳＤ７８４％），ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈａｔｔｈｅｍｅｔｈｏｄｗａｓａｃｃｕｒａｔｅ，ｓｔａｂｌｅａｎｄｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ　ＴｈｅｆｉｂｒｉｎｐｌａｔｅｍｅｔｈｏｄｃａｎｂｅｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｌｕｍｂｒｏｋｉｎａｓｅｉｎＧｕａｎｇＤｉＬｏｎｇＫＥＹＷＯＲＤＳ：ＧｕａｎｇＤｉＬｏｎｇ；Ｆｉｂｒｉｎｐｌａｔｅｍｅｔｈｏｄ；Ｌｕｍｂｒｏｋｉｎａｓｅ；Ｂｉｏａｓｓａｙ地龙为钜蚓科（Ｍｅｇａｓｃｏｌｅｃｉｄａｅ）动物参环毛蚓Ｐｈｅｒｅｔｉｍａａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｍ（ＥＰｅｒｒｉｅｒ）、通俗环毛蚓ＰｈｅｒｅｔｉｍａｖｕｌｇａｒｉｓＣｈｅｎ、威廉环毛蚓Ｐｈｅｒｅｔｉｍａｇｕｉｌｌｅｌｍｉ（Ｍｉｃｈａｅｌｓｅｎ）或栉盲环毛蚓ＰｈｅｒｅｔｉｍａｐｅｃｔｉｎｉｆｅｒａＭｉｃｈａｅｌｓｅｎ的干燥体〔１〕，是我国传统动物药材。

蚓激酶活性成分的分离纯化

高纯度的蚓激酶。
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幽＝暮．鼍
本实验从蚯蚓中分离纯化出一种高活性、
【关键词】蚓激酶；分离纯化；色谱
ＳｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｌｕｍｂｒｏｋｉｎａｓｅＺｈｅｎｇＨｕｉＤａｉＤｏｎｇｓｈｅｎｇ．ＣｏＨｅｇｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＳｈａｎｘｉＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅＬｓｉｔｙ，Ｔａｉｙｕａｎ０３０００１，Ｃｈｉｎａ
国际医药卫生导报２０１４年第２０卷第６期
ＩＭＨＧＮ，Ｍａｒｃｈ２０１４，Ｖｏ１．２０Ｎｏ．６
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药物研究・
蚓激酶活性成分的分离纯化
郑慧戴东升
【摘要】目的
一
本实验采用色谱分离的方法从赤子爱胜蚓（ＥｉｓｅｎｉａＦｏｅｌｉｄｅ）中分离纯化出
６１马闯，杨新力，杨丽萍，等．蚓激酶提取］一艺的初步用两步色谱分离就得到了电泳一条带、纯度为『

蚓激酶提取方法及用途

蚓激酶提取方法及用途
蚓激酶是一种由蚯蚓分泌的酶，具有较强的溶血作用和抗凝血作用。

蚓激酶的提取方法主要有两种，一种是传统的离子交换层析法，另一
种是新型的亲和层析法。

离子交换层析法是将蚯蚓提取液经过预处理后，通过离子交换树脂进
行层析分离，最终得到蚓激酶。

这种方法操作简单，但提取效率较低，且需要大量的离子交换树脂。

亲和层析法是利用蚓激酶与某些特定的亲和剂之间的结合作用进行分离。

这种方法具有高效、高纯度、易于操作等优点，但需要特定的亲
和剂，成本较高。

蚓激酶具有广泛的应用价值。

首先，它可以用于溶血试验，用于检测
血液中溶血素的含量。

其次，蚓激酶还可以用于治疗血栓性疾病，如
心肌梗死、脑梗死等。

此外，蚓激酶还可以用于制备生物芯片、生物
传感器等生物技术领域。

总之，蚓激酶是一种具有重要应用价值的生物酶，其提取方法和应用
领域的研究将对生物技术领域的发展产生积极的影响。

紫外分光光度法测定蚓激酶效价方法研究

实用中西医结合临床2020年8月第20卷第10期紫外分光光度法测定蚓激酶效价方法研究李岚李文贵周清瑶秦巧莉（江中药业股份有限公司江西南昌330004）摘要：目的：建立紫外分光光度法测定蚓激酶效价的方法。

方法：使用紫外分光光度法测定蚓激酶中蛋白质含量，以蚓激酶标准品为对照，计算样品效价。

结果：紫外分光光度法测定效价结果与生物平板法测定效价结果相近。

结论：紫外分光光度法测定蚓激酶效价的方法条件易控制，操作简便迅速，试剂成本低，方法准确，适用于蚓激酶及肠溶胶囊的效价测定。

关键词：蚓激酶；紫外分光光度法；效价中图分类号：R927.2%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%文献标识码：B%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%doi:10.13638/j.issn.1671-4040.2020.10.077蚯蚓纤溶酶（Earthworm%Fibrinolytic%Enzyme,%%E FE）又称作蚓激酶（Lumbrokinase,%LK），是从赤子爱胜蚓体内提取的一组具有纤溶活性的蛋白水解酶。

自1983年Mihara等从蚯蚓粗提物中分离到一组具有纤溶酶活性的蛋白质以来，蚓激酶作为溶栓药物已先后在韩国和中国上市，对血栓性疾病有明显的疗效[1]。

平板法是目前较为常用的定量方法，用于蚓激酶效价的测定。

但在实验操作中，铺板、打孔、点样和计数时出现导致操作误差，并且该检测方法耗时长、效率低，检测使用的蚓激酶标准品、凝血酶和牛纤维蛋白原等试剂成本较高。

蚓激酶中的蛋白质在碱性溶液中会与Cu2+鳌合，形成肽-铜复合物，此复合物可使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，该蓝色化合物在650%nm处的吸光度与蛋白质含量成正比，再以蚓激酶标准品作为对照可计算样品效价。

紫外分光光度法的建立正是基于以上原理。

现报道如下：1%%%%仪器与材料1.1%%%%仪器MS204-S电子天平（瑞士梅特勒-特利多公司）；UV2550紫外分光度计（日本岛津公司）；旋涡震荡器（江苏金坛亿通电子有限公司）。

酶活性的测定方法

酶活性的测定方法生物样品预处理预冷解剖用具，采用颈后断头的方法将鱼杀死，立即取肝脏、腮、脑，操作均在4℃下进行，用预冷的0.15 mol/L KCl 溶液洗去血丝，用滤纸吸干后称重。

将肝、脑组织放入预冷的Tris-HCl缓冲液(0.1 mol/L Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 mol/L KCl)匀浆（匀浆比（W/V）1:5），腮组织放入组织匀浆（匀浆缓冲液含40mmol/L咪唑，250mmol/L蔗糖，5mmol/L EDTA，pH7.0），匀浆比为1:40，匀浆速率为10000g，以15s为周期，重复3次。

分别取1ml匀浆液放入1.5ml离心管进行离心，4℃下离心(9000g，20min)，取上清液-80℃下保存，待测。

（1）250mL 0.15 mol/L KCl：取2.7956g（2）Tris-HCl缓冲液：125mL 0.1 mol/L Tris（1.5143g）+ 105mL 0.1 mol/L HCl+ KCl（0.15*0.23*74.55=2.5720g）（Na+＋K+）－ATPase活性的测定1、试剂（1）匀浆液（250ml）：40mmol/L咪唑0.6808g+250mmol/L 蔗糖21.3931g +5mmol/LEDTA 0.3653g（2）反应缓冲液（250ml）：80mmol/L咪唑1.3616g+4mmol/LMgCl2 0.2033 g+40mmol/LKCl 0.7455g（3）16mmol/L Na2ATP（10ml）：0.0988g（4）30%三氯乙酸（TCA）9g TCA+21mlH2O（5）定磷试剂（硫酸亚铁-钼酸胺试剂100ml）：10ml 5mol/LH2SO4+1.3556 g钼酸铵+90mlH2O每10ml加入FeS040.5g（FeS04·7H2O 0.0941g），25ml加入FeSO4·7H2 O 0.2353g，临用前配制。

蚓激酶白蛋白纳米粒中的酶活力测定

蚓激酶白蛋白纳米粒中的酶活力测定王玮;尹宗宁;李铜铃;李毓琦;邹敬伟【期刊名称】《中国新药杂志》【年(卷),期】2005(14)8【摘要】目的:测定蚓激酶白蛋白纳米粒中蚓激酶的活力.方法:以对甲基苯磺酰-L-精氨酸甲酯盐酸盐(TAME)为底物测定蚓激酶的活力,通过载药量与包封率2个指标进行质量评价.结果:白蛋白测定方法的RSD均小于0.3%,高、中、低浓度平均回收率分别为(99.47±0.93)%,(98.51±1.42)%,(98.69±2.43)%;蚓激酶测定方法的高、中、低浓度的RSD分别为0.62%,0.37%,1.82%,平均回收率分别为(99.25±1.98)%,(97.61±1.13)%,(97.15±2.21)%.蚓激酶白蛋白纳米粒的载药量为(4.84±0.41)%,包封率为(84.14±3.41)%.结论:通过测定蚓激酶白蛋白纳米粒中蚓激酶活性和白蛋白的含量,确定蚓激酶载药量与包封率,所建立的酶学测定方法快速简便、适用可行.【总页数】3页(P1019-1021)【作者】王玮;尹宗宁;李铜铃;李毓琦;邹敬伟【作者单位】四川大学华西药学院,成都,610041;四川大学华西药学院,成都,610041;四川大学华西药学院,成都,610041;四川大学华西药学院,成都,610041;四川大学华西药学院,成都,610041【正文语种】中文【中图分类】R917.2;R944.9【相关文献】1.蚓激酶白蛋白纳米粒的分离 [J], 王玮;尹宗宁;李铜铃;李毓琦2.脂肪酶活力测定方法及其在筛选产脂肪酶微生物中的应用 [J], 王欢;何腊平;周换景;张义明;李翠芹;陶菡3.血清白蛋白、乳酸脱氢酶及乳酸脱氢酶/白蛋白比值检测在儿童急性呼吸窘迫综合征诊治中的临床意义 [J], 孔程祥; 李莉; 金萍; 刘纯义; 许锦姬; 罗勇4.洋葱中蒜氨酸酶的提取分离及酶活力测定 [J], 段海燕;陈思羽;李炳奇;曹红5.脱氢奎尼酸合成酶基因aroB在大肠杆菌中的克隆表达及酶活力测定 [J], 杨毅刚;周长林;窦洁;陈新因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

蚓激酶活性及蛋白成分的研究的开题报告

蚓激酶活性及蛋白成分的研究的开题报告
一、选题背景
蚓激酶是一种重要的酶类物质，已被广泛应用于医药、食品、化工等领域。

而蚯蚓则是蚓激酶的主要来源之一，其激酶活性与蛋白成分的研究对于开发利用蚓激酶具有重要意义。

因此，本文选取蚓激酶活性及蛋白成分的研究作为研究方向。

二、研究目的
本文旨在通过对蚯蚓体内激酶活性及蛋白成分的研究，深入了解蚓激酶的产生、性质及应用，为蚓激酶的开发利用提供科学依据。

三、研究方法
（1）蚯蚓激酶活性的测定：采用适宜的体系和方法，对蚯蚓
体内激酶活性进行定量测定，包括内源性激酶活性和外源性激酶活性。

（2）蚯蚓蛋白成分的分离与纯化：采用多种蛋白质分离技术，如离心、滤膜、离子交换层析、凝胶透析、透析等，对蚯蚓蛋白进行分离和纯化。

（3）蚯蚓蛋白的鉴定和分析：采用氨基酸分析、电泳、质谱
等方法，对蚯蚓蛋白重组、分子量、氨基酸组成、结构特征等进行分析。

四、预期成果
通过本研究，可以获得蚯蚓体内激酶活性和蛋白成分的详细信息，并对其进行深入分析和鉴定。

这些结果将为蚓激酶的开发利用提供新的思路和方向，为蚓激酶进一步开发利用提供科学依据。

同时，结果还可以为相关领域的研究提供新的参考和依据，推动整个行业的发展。