Northern印迹杂交技术教案资料

仪器
• 恒温水浴箱，电泳仪，杂交袋，真空转移 仪，真空泵，杂交炉，恒温摇床，脱色摇 床，漩涡振荡器，分光光度计，微量移液 器，电炉（或微波炉），离心机，烧杯， 量筒，三角瓶，紫外灯等。
1.RNA电泳
琼脂糖与纯水一定 比例于微波炉内混 匀、冷却到75°C
加mops缓冲液、 甲醛，混匀。
制备成电泳用胶 待胶凝过程中， 准备RNA样品。
3、探针标记
探针模 模板、随 机引物 、双蒸
水。 冰块
离心、 混匀。 变性
顺序加
随机引
缓冲液
、dNTP 、dUTP
室温
Klenow 3h
酶，混
匀。
75°C 保温10 Min。
加预冷 无水乙 醇、混 匀。
1000r/min
15min、
去上清
-20
℃、
、乙醇洗 涤、真 空干燥
2 h 、TE溶解
、-20°C
tris*NaCI 室温、30r/min 30min。
浸泡在250ml 10*SSC约1min
。
RNA转膜前的处理
转膜的 方法
毛细管洗脱法 真空转移法 电印迹法
叠放的滤纸，凝胶和膜之间不能有气泡，转膜约 10 h。
电泳后的凝胶 → 放置 → 室温转移10—25h → 漂洗（SSC）除碎胶片 →80℃烘烤2h固 定核酸.
northern 印迹杂交流程图
所用材料、试剂及仪器 方法与步骤 参考书籍及文献
材料
总RNA样品或mRNA样品、 探针模板DNA、随机引物、地高 辛-dUTP、klenow酶、硝酸纤维 素虑膜等。
试剂
• 10*MOPS缓冲液、DEPC水、6*RNA上样 缓冲液、37%甲醛、甲酰胺、 20*ssc(pH7.0) 杂交缓冲液、2*洗膜缓冲液 (2*ssc)、预杂交液、杂交缓冲液、缓冲液 Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ、NBT(硝基四氮唑蓝 )、 BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐) 、TE缓冲液、 显色液、琼脂糖等。
Northern印迹杂交技术
• Northern 杂交是用于RNA定量和定性分析的常 用技术，它是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸 纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，再进 行核酸分子杂交的一种实验方法。
• 可以鉴定总RNA或poly(A)+RNA样品中同源 RNA的存在与否、测定样品中特定mRNA分子的 大小和丰度，是分子生物学中研究基因表达在转 录水平上的调节以及cDNA合成的重要手段。
备用。
4.杂交
• 将待杂交的滤膜放入杂交袋中，按 20mL/100cm2滤膜计算加入预杂交 液、68℃水浴摇床杂交1-2 h。
• 将标记好的DNA探针煮沸5min，迅 速在冰上冷却。将探针加入预热的杂 交液中，充分混匀。
• 倒去预杂交液，按250mL/c㎡滤膜计 算向杂交袋中加入含地高辛标记探针 的杂交液，68℃杂交6 h以上。
结果示例
参考书籍及文献
[1] 朱玉贤,李 毅.现代分子生物学[M].高等教育出版 社,2002，173-178.
[2] 黄怡森,张光毅.生化与分子生物学[M].科学出版社， 2008，345-347.
[3] 郝福英,朱玉贤,朱圣庚，等.分子生物学实验技术[M].北 京大学出版社,1998,68-72.
[4] 魏春红,李毅.现代分子生物学实验技术[M].高等教育出版 社,2006,156-162.
[5] 汪天虹.分子生物学实验[M].北京大学出版社,2009,76-79.
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• 缓冲液Ⅱ洗膜2次，每次15 min，以除去 未结合的抗体复合物。再用20 mL缓冲液 Ⅲ平衡膜2-5 min。
• 在黑暗条件下将膜与显色液放入密封 的暗盒中显色。通常 2 min后出现颜 色，充分显色应在16 h以上。膜可以 在弱光下短时间暴露以检测显色强度。
• 显色完毕后用TE缓冲液停止染色，照 相记录显色结果。
• 洗膜：在室温下用50mL 2*SSC， 0.1% SDS 溶液洗膜两次以上，每次 5 min。膜即可以立即用于显色检测或 储存备用（干燥环境中）。
5.酶联免疫染色
• 室温，用缓冲液Ⅰ洗膜 1-5 min，缓冲液 Ⅱ洗膜 30 min，再用缓冲液Ⅰ洗膜 1-5 min。
• 用缓冲液Ⅰ稀释抗体缓冲液（1：2000）， 稀释后的抗体溶液在4℃只能稳定12 h。室 温下将膜在抗体稀释液中浸泡30 min。
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上样
用标尺测量加样 孔与条带的距离
，拍照
切去凝胶一角，用 用SSC冲洗并浸泡 胶板，以除去甲醛
。
电泳：用1*MOPS缓冲液 ，先用20V使样品进胶， 再用5V/cm电泳1 h ，停 止电泳。
2.转膜
浸泡在250 ml 50 Mmol/l NaOH ,室 温、30r/min 30 min。
浸泡在 250 ml