Northern印迹杂交技术教案资料
Northern-Blot印迹杂交
10 X Buffer, Sephadex G-50,SDS，双
氧水, 灭菌水等。
2021/10/10
5
四、实验步骤
1. 用具的准备：180度烤三角锥瓶、量筒、镊子、
刀片等4h；清洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸 泡过夜，用DEPC (diethypyrocarbonate，焦碳酸 二乙酯) 水冲洗，干燥备用；处理DEPC水(2 L) 备用
2021/10/10
3
三、实验材料
1、仪器 恒温水浴箱，电泳仪，凝胶成像系统，真空
转移仪，真空泵，UV 交联仪，杂交炉，恒温摇 床，脱色摇床，漩涡振荡器，分光光度计，微量 移液器，电炉（或微波炉），离心管，烧杯，量 筒，三角瓶等。
2、材料
总RNA样品或mRNA样品，探针模板DNA(25
ng)，尼龙膜
② 95 ℃加热3 min后，迅速放置于冰冷却5 min。
③在离心管中按下列顺序加入以下溶液：
10×Buffer
2.5 μl
dNTP Mixture
2.5 μl
111 TBq/mmol[a-32P]dCTP 5 μl
Exo-free Klenow Fragment 1 μl
混匀后（25ul），37 ℃下反应30 min。短暂离 心，收集溶液到管底。
② 连接真空泵和真空转移仪，剪取一块适当大小 的膜，在Transfer buffer 浸湿 5 min后，放置在 多孔渗水屏的适当位置。
③ 盖上塑胶屏，盖上外框，扣上锁，将胶的多余 部分切除，切后的胶四边缘要能盖过塑胶屏孔， 并至少盖过边缘约2mm，以防止漏气。
④ 将胶小心放置在膜上，膜与胶间不能有气泡。
NorthernBlot
2021/10/10
Northern杂交试验指导手册
Northern杂交试验指导手册Northern杂交试验指导手册DIG标记的Northern杂交试验指导一、 RNA提取方法一、改良异硫氰酸胍提取法试剂及其配制异硫氰酸胍变性液：贮存液－在含484ml 水（经DEPC处理）, 17.6ml 0.75mol/L柠檬酸钠（pH7.0）和26.4ml10%Sarkosyl的溶液中加入250g异硫氰酸胍，加热至60~65℃并持续搅拌使之充分溶解。
贮存液室温保存备用（不超过3个月）。
工作液－在每50ml贮存液中加入0.35ml2-ME即配制成工作液。
工作液于室温下保存不超过1个月。
工作液各成分的终浓度为：4mol/L异硫氰酸胍25mol/L柠檬酸钠pH 7.00.5%(w/v)N-十二烷基肌氨酸(Sarkosyl)0.1mol/L巯基乙醇(2-ME)其它溶液：2mol/L乙酸钠 (NaAc) 缓冲液 (pH 4.0)水饱和酚（pH 3.5）49∶1 (v/v) 氯仿/异戊醇100%异丙醇70%乙醇（用DEPC处理水配制）DEPC处理后高压灭菌水试验程序1．取0.5~1g左右新鲜植物组织置于研钵中，加入液氮，迅速研磨成均匀的粉末。
2．将粉末全部移入冰上预冷的离心管中，并向其中加入5ml异硫氰酸胍变性液，轻轻摇动离心管使混合均匀。
3．顺序加入2mol/l NaAc 0.5ml、水饱和苯酚5ml、氯仿/异戊醇1ml，每加入一种试剂都轻轻摇动离心管混合均匀，最后将离心管盖紧，倒转几次混合均匀，冰浴15min.。
4．4℃条件下15000g离心30min.，将上层水相转移至另一干净的离心管中，并加入等体积的异丙醇，混匀后置于－20℃冰箱冷冻1h.。
5．4℃条件下13000g离心25min.，小心去除上清液，沉淀溶于1.5ml异硫酸胍变型液中（体积为第一次变性液的1/3），再加入等体积的异丙醇，混匀后置于－20℃冰箱冷冻1h.。
6．4℃条件下13000g离心20min.，沉淀用70%乙醇洗一次，晾干后溶于适量体积（50μg/100μl）的DEPC处理水中，检测后分装，置于－70℃低温条件下保存。
Northern印迹杂交技术
5.酶联免疫染色 5.酶联免疫染色
• 室温，用缓冲液Ⅰ洗膜 1-5 min，缓冲液 室温，用缓冲液Ⅰ min， min，再用缓冲液Ⅰ Ⅱ洗膜 30 min，再用缓冲液Ⅰ洗膜 1-5 min。 min。 • 用缓冲液Ⅰ稀释抗体缓冲液（1：2000）， 用缓冲液Ⅰ稀释抗体缓冲液（ 2000）， 稀释后的抗体溶液在4℃只能稳定12 h。 4℃只能稳定 稀释后的抗体溶液在4℃只能稳定12 h。室 温下将膜在抗体稀释液中浸泡30 min。 温下将膜在抗体稀释液中浸泡30 min。 • 缓冲液Ⅱ洗膜2次，每次15 min，以除去未 缓冲液Ⅱ洗膜2 每次15 min， 结合的抗体复合物。再用20 mL缓冲液 缓冲液Ⅲ 结合的抗体复合物。再用20 mL缓冲液Ⅲ平 衡膜2 min。 衡膜2-5 min。
• Northern 杂交是用于RNA定量和定性分析的常用 杂交是用于RNA RNA定量和定性分析的常用 技术，它是将RNA RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维 技术，它是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维 素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上， 素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，再进行核 酸分子杂交的一种实验方法。 酸分子杂交的一种实验方法。 • 可以鉴定总RNA或poly(A)+RNA样品中同源RNA的存 可以鉴定总RNA RNA或 RNA样品中同源RNA的存 样品中同源RNA 在与否、测定样品中特定mRNA分子的大小和丰度， mRNA分子的大小和丰度 在与否、测定样品中特定mRNA分子的大小和丰度， 是分子生物学中研究基因表达在转录水平上的调 节以及cDNA合成的重要手段。 节以及cDNA合成的重要手段。 cDNA合成的重要手段
浸泡在 250 ml tris*NaCI 室温、 室温、30r/min 30min。 。
Northern blot技术
Northern杂交试验指导手册－Northern 印迹杂交A．探针准备DIG标记的RNA探针与DNA探针相比，显示较强的杂交信号和较地的非特异性背景，因此，只要可能选用RNA探针可以比DNA探针获得更好的杂交结果。
如果必须使用DNA探针，建议使用高SDS杂交缓冲液或DIG Easy Hyb以减少背景。
在正式杂交试验之前，优化杂交探针浓度是避免颜色背景所必须的。
探针浓度的确定可通过模拟杂交进行。
取一小片空白膜，将其浸入不同探针浓度的溶液中（如：1μl/ ml、3μl/ ml、5μl/ ml …），可观察到背景颜色的浓度即可作为杂交探针浓度。
在采用荧光检测或采用CSPD 化学发光检测时，建议试验探针浓度50－100ng/ml，如果采用CDP-Star化学发光检测，由于灵敏度很高，在此探针浓度下会产生很高的背景，因此，要适当降低探针浓度。
B. 印迹条件对于1%的变性琼脂糖胶向尼龙膜上印迹转膜，在10×和20×的SSC盐浓度下可以获得相同的结果，转膜时间是在4℃或室温下过夜。
C. 试剂及其配制MOPS缓冲液（10×）: 200mmol/L MOPS ( pH 7.0 )50mmol/L NaAc10mmol/L EDTA上样染料：50%甘油，1mmol/L EDTA，0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝甲醛（37%溶液，13.3mol/L）染液：0.5mol/L NaAc(pH 5.2)中含0.04%的亚甲蓝甲酰胺（去离子）70%乙醇SSC(20×)：3mol/L NaCl (175g/L)0.3mol/L 柠檬酸三钠•2H2O (88g/L)用1mol/L HCl调整至pH 7.0Denhardt溶液（100×)：10g Ficoll 400 + 10g PVP + 10g BSA(Penta x组分V)用DSPC处理水溶解，定容至500ml，过滤后分装成每份25ml于-20℃保存。
northern印迹法原理和流程
northern印迹法原理和流程英文回答：The Northern Blot technique is a widely used method for detecting the presence of a specific RNA molecule in a sample. The principle behind this technique is to separate RNA molecules based on their size using gel electrophoresis and then transfer them onto a membrane for hybridization with a labeled probe. The labeled probe will bind to the specific RNA molecule of interest, allowing for its detection and quantification.The Northern Blot technique involves several key steps. First, RNA is extracted from the sample of interest, typically using a method such as phenol-chloroform extraction. The extracted RNA is then separated by size using gel electrophoresis, which involves applying an electric field to the gel matrix to separate the RNA molecules based on their size. The separated RNA molecules are then transferred from the gel onto a membrane,typically a nylon membrane, through a process called capillary or vacuum transfer.After the transfer, the membrane is cross-linked to immobilize the RNA, making it available for hybridization with a labeled probe. The labeled probe is a single-stranded DNA or RNA molecule that is complementary to the target RNA of interest. This probe is typically labeled with a radioactive or fluorescent tag for detection. The membrane is then incubated with the labeled probe, allowing it to hybridize specifically to the target RNA molecule.Following hybridization, the membrane is washed to remove any unbound probe, and then it is exposed to X-ray film or scanned using a fluorescent scanner to visualize the labeled RNA molecule. The intensity of the signal on the film or scanner corresponds to the abundance of the target RNA molecule in the original sample.Overall, the Northern Blot technique provides a valuable tool for studying gene expression and RNA abundance in biological samples.中文回答：北方印迹法是一种用于检测样本中特定RNA分子存在的常用方法。
Northern杂交实验
b)在可见光下用黄色滤光片对染色的膜照像。
c)照像后，将膜放入0.2×SSC和1%（m/v）SDS中室温脱色15min。
注：用适宜的方法将RNA固定在膜上后，可直接进行杂交，也可用锡箔纸或滤纸宽松包装，真空下储存于室温。
总RNA的甲醛凝胶电泳、变性RNA的转膜及固定。
A：在含有甲醛的琼脂糖凝胶上进行的RNA电泳
方法采用萨姆布鲁克《分子克隆实验指南》第三版。
注：可加入溴化乙锭在甲醛凝胶中
试剂：溴化乙锭（用DEPC处理的水配制）
甲醛37%--40%
甲酰胺
试剂：
10×甲醛凝胶电泳加样缓冲液
50%甘油
10 m mol/L EDTA(Ph8.0)
转移膜的准备
5、用新的解剖刀或切纸刀裁一张长宽均大于胶1MM的尼龙膜。
6、将尼龙膜漂浮在去离子水表面直至滤膜从下往上全部湿透，然后将膜侵入10×SSC中至少5分钟，用干净的解剖刀切去滤膜一角，使其与凝胶的切角相对应。
转移系统的安装和RNA转移
7、将胶倒转后置于平台上滤纸的中央，确保厚滤纸和胶之间没有气泡滞留。
含1%SDS的0.2*SSC
20*SSC：
在800mL水中溶解175.3g NaCL和88.2g柠檬酸钠，加入数滴10mol/L NaOH溶液调pH值至7.0，加水定容至1L，分装后高压灭菌。
转移缓冲液：
碱性转移至带正电荷的膜：用0.01mol/L NaOH和3mol/L NaCL
中性转移至不带电荷的膜：用20*SSC
50×TAE：242克Tris碱，57.1 ml冰乙酸，100 ml 0.5M EDTA(Ph8.0)，定容至1000ml
Northern Blot 实验 Protocol
Northern Blot（Northern印迹杂交）是一种用于检测RNA表达水平的方法，它通过将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上，然后与特定基因互补配对的探针进行杂交，从而检测目的片段。
实验原理：Northern Blot利用了RNA的分子量大小不同，通过电泳方法将其按照大小分离，然后转移至硝酸纤维素膜上。
探针与特定的基因互补配对，当探针与目标RNA片段杂交时，可以检测到特定基因的表达情况。
所需试剂和耗材：1.RNA样品或mRNA样品。
2.探针模板DNA。
3.尼龙膜。
4.NorthernMax Kit（Cat. # 1940,Ambion, Inc.）等试剂。
实验仪器：1.恒温水浴箱。
2.电泳仪。
3.凝胶成像系统。
4.真空转移仪和真空泵。
5.UV交联仪。
6.杂交炉。
7.恒温摇床。
8.脱色摇床。
9.漩涡振荡器。
10.分光光度计。
11.微量移液器。
12.电炉或微波炉。
13.离心管。
14.烧杯。
15.量筒。
16.三角瓶等。
准备工作：1.准备好所需的试剂和耗材，确保它们在有效期内，并按照要求储存和使用。
2.确保实验区域干净整洁，并无菌操作。
3.了解和掌握实验步骤，以及如何解决可能出现的问题。
4.使用DEPC水处理相关玻璃器皿，保证无RNA酶的污染。
实验方法：1.将RNA样品进行电泳分离，根据分子量大小将RNA分子分离至琼脂糖凝胶中。
2.将凝胶中的RNA分子转印到硝酸纤维素膜上。
3.将硝酸纤维素膜上的RNA与特定基因的探针进行杂交。
4.通过底片暗盒制作X光底片，以检测RNA的表达情况。
5.对硝酸纤维素膜进行脱色处理，以便进一步检测和分析。
6.通过分光光度计测定X光底片的吸光度，以定量分析RNA的表达水平。
7.根据定量分析结果进行数据分析，绘制图表等。
注意事项：1.在实验过程中，要注意防止污染，尤其是避免交叉污染，因为这会对实验结果产生极大的影响。
2.所有溶液都应该是新鲜的，并且在使用之前应该进行充分的过滤和离心处理。
northern印迹杂交原理
northern印迹杂交原理北方印迹杂交（Northern blot）是一种用于检测和分离特定RNA序列的实验技术。
它是南方印迹技术的衍生物，南方印迹技术是用于检测和分离DNA序列的一种实验技术。
北方印迹技术常用于研究基因的表达调控机制和RNA水平的变化。
北方印迹杂交的原理基本上与南方杂交的原理相似，但有一些具体差异。
北方印迹的主要步骤包括RNA提取、转印到膜上、固定RNA到膜上、杂交和检测。
首先，从细胞或组织中提取总RNA。
通常使用酚-氯仿法或商业RNA 提取试剂盒进行提取。
在提取过程中，应严格遵循消毒和无RNase污染的条件。
接下来，将提取的RNA样品加载到琼脂糖凝胶中进行电泳分离。
通过电泳可以将RNA按分子大小进行分离，从而得到RNA带。
在电泳结束后，在凝胶上用碱性溶液溶解凝胶，将RNA转移到尼龙或硝酸纤维膜上。
然后，固定RNA到膜上。
这通常是通过使RNA与膜上的阳离子进行静电相互作用来实现的。
可以使用UV交联来增强RNA与膜的结合。
在固定RNA后，开始进行杂交。
杂交是将与目标RNA序列具有互补序列的DNA或RNA探针与膜上的RNA进行配对。
探针可以是标记有荧光物质或放射性同位素的分子探针。
探针的选择应根据研究的具体目的来确定。
杂交的条件包括温度、时间和杂交液的组成。
温度通常选择在50-65摄氏度之间，时间通常在几小时到一夜之间。
杂交液中通常包含盐、DENHART's溶液、聚丙烯醇等。
最后，进行检测。
检测的方法可以是放射自显影、化学发光或荧光检测。
如果使用放射性标记的探针，可以使用放射自显影技术来检测。
如果使用化学发光或荧光标记的探针，可以使用相应的检测仪器进行检测。
北方印迹杂交技术可以用于许多研究领域，例如研究基因表达的调控机制、RNA的稳定性和降解等。
它的优点包括对RNA分子的特异性检测和分离，以及对研究RNA变化的敏感性和定量性。
它的局限性在于需要较长的处理时间和较大的RNA样品量，以及需要较高的实验技术要求。
Northern-Blot印迹杂交
杂交信号弱或无信号的问题及解决方案
• 转录水平低：考虑使用其他组织 或细胞类型进行实验，以确定目 标基因是否在所选样本中表达。
杂交信号弱或无信号的问题及解决方案
解决方案
2. 使用更高效的RNA提取方 法，确保获得高质量的RNA 样品。
样本电泳
01
02
03
选择合适的胶浓度
根据RNA的大小选择适合 的琼脂糖凝胶浓度，确保 RNA片段能够充分分离。
点样与电泳
将处理好的RNA样品点在 凝胶上，并进行电泳分离。
检测RNA条带
通过染色或放射自显影等 技术观察电泳结果，确保 RNA片段已成功分离。
样本转移
制备滤纸
选择适合的硝酸纤维素膜 或印迹膜，并将其固定在 滤纸上。
northern-blot印迹杂交
contents
目录
• northern-blot技术概述 • northern-blot实验原理 • northern-blot实验材料与设备 • northern-blot实验步骤 • northern-blot实验结果分析 • northern-blot实验问题与解决方案
01 northern-blot技术概述
定义与特点
定义
Northern-blot印迹杂交是一种用于 检测RNA在样本中的表达水平的分 子生物学技术。
特点
具有高灵敏度、高特异性和高分辨率 ，能够检测出微量的RNA分子，并可 对RNA分子进行定性、定量和定位分 析。
northern-blot技术的应用范围
1. 重新设计探针并进行验证， 确保与目标基因完全匹配。
3. 优化实验条件，如延长杂 交时间和提高探针浓度。
northern印迹杂交操作步骤
northern印迹杂交操作步骤标题：Northern印迹杂交技术的操作步骤详解Northern印迹杂交是一种研究基因表达的分子生物学技术，主要用于检测细胞中特定mRNA的存在和数量。
其基本原理是利用核酸之间的碱基配对原则，将放射性或非放射性的DNA探针与固定在硝酸纤维素膜上的RNA进行杂交，然后通过显影、放射自显影或者化学发光等方式显示结果。
以下是Northern印迹杂交的基本操作步骤：1. RNA的提取：首先从待测样本中提取总RNA。
常用的RNA提取方法有酚氯仿法、Trizol法等。
提取后的RNA需要进行定量和质量检查，以确保后续实验的准确性。
2. RNA的电泳分离：将提取到的总RNA通过琼脂糖凝胶电泳进行分离。
根据RNA的大小不同，会在凝胶上形成不同的条带。
通常情况下，28S rRNA的迁移速度比18S rRNA慢，因此可以根据这两个条带的位置和强度来判断RNA的质量。
3. RNA的转移：将电泳分离后的RNA通过毛细管作用转移到硝酸纤维素膜上。
这个过程称为“转膜”。
转膜时需要注意的是，硝酸纤维素膜的正反两面不能混淆，因为转膜后要进行的杂交反应只在膜的一面上进行。
4. RNA的固定：转膜后的RNA需要被固定在硝酸纤维素膜上，防止其在后面的杂交过程中脱落。
常用的固定方法是在高盐溶液中进行热处理。
5. 杂交：将标记好的DNA探针与固定的RNA进行杂交。
杂交过程一般在恒温水浴中进行，温度应设定在Tm值以下5℃左右。
杂交的时间视探针的长度和浓度而定，一般为过夜。
6. 洗脱：杂交后的硝酸纤维素膜需要进行洗涤，目的是洗去未与RNA杂交的游离探针。
常用的洗涤液是SSC缓冲液，洗涤次数视具体情况而定。
7. 显影：将洗涤后的硝酸纤维素膜用X光片覆盖，并放置在暗盒中曝光一段时间，然后进行显影。
如果使用的是放射性标记的探针，则需要进行放射自显影；如果是非放射性标记的探针，则可以采用化学发光的方式进行显影。
总的来说，Northern印迹杂交是一种相对传统的分子生物学技术，虽然操作步骤较为繁琐，但因其能够直接反映mRNA的存在和量的变化，因此在基因表达的研究中仍具有重要的地位。
northern印迹杂交原理
northern印迹杂交原理北方印迹杂交是一种分离和分析DNA的方法，通常用于分离和分析基因组和DNA样品的特定序列。
这种方法基于DNA的电泳运动和杂交化学，使得DNA序列的特定区域可以被形成的杂交分子所识别和捕获。
在这篇文章中，我们将探讨北方印迹杂交的原理和应用。
一、北方印迹杂交的基本原理北方印迹杂交的过程可以被分为以下几个步骤：1. DNA提取：从样品中提取出所需DNA序列。
2. DNA切割：使用限制性内切酶将DNA切割成所需的片段。
3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳：将DNA片段通过凝胶电泳进行分离。
4. DNA转移：使用电泳将DNA分离到含有纤维素醇和盐的膜上。
5. DNA杂交：在膜上加入标记了所需DNA序列的探针，使其与目标DNA序列形成杂交。
6. 暴露于X光片：将膜暴露在X光片上，使得探针与目标DNA序列形成的杂交分子被记录下来。
由于DNA的电泳运动特性，分离的DNA片段可以根据其分子量在凝胶上定位，这使得这种方法可以大规模分析DNA样品中特定的序列。
而加入标记的DNA探针可以识别特定的目标DNA序列，从而使得这种方法具有很高的专业性和灵敏性。
二、北方印迹杂交的应用北方印迹杂交主要用于以下几种应用：1. 分析基因表达：通过北方印迹杂交可以分离出RNA序列，从而分析某个基因是否被表达和其表达的水平。
2. 检测基因突变：通过北方印迹杂交可以检测DNA序列中的特定突变，从而判断某一基因是否存在突变表达。
3. 确定DNA序列：通过北方印迹杂交可以进一步分析和确定DNA 序列中的某些特定区域。
总之，北方印迹杂交是一种比较常用的分子生物学方法，其原理简单，操作方便，可以用于基因表达和突变检测等多种应用。
在人类基因组研究和分析中有着广泛的应用价值。
Northern 杂交技术
变性： 由于RNA直接与尼龙膜结合力差，且 具有茎环结构，必须将RNA先经变性剂 （甲醛/羟甲基汞/戊二醛）处理，一方面使 RNA变性，另一方面可促进RNA与滤膜有 效结合。 注意：RNA变性与DNA变性方法不同，不 能用碱变性，否则易引起RNA水解。
转移： 用刀片修饰凝胶，弃去不需要部分和加 样孔以上部分，并在一角切成三角形缺口 以做记号。剪取一张略大的尼龙膜，一角 剪成与凝胶缺口同样大小的三角形缺口， 将膜漂浮在一盘去离子水表面，待完全侵 湿后在10倍SSC中侵泡至少5min。 转膜有两种方法：电转移法和毛细管转 移法
毛细管转移法图示：
电转移法图示：
取出尼龙膜，甩掉多余液体，将有 RNA的一面朝上，在滤纸上晾几分钟。 将尼龙膜晾干后，夹在两滤纸之间，在 真空烘烤箱中80℃烘烤2h。
• 杂交 将放射性同位素标记的DNA探针经100 ℃ 煮沸5min和冰浴2min变性，然后将探针 和膜放入袋中杂交，在68℃水浴中杂交过 夜。
杂交结束后，将尼龙膜在一定量的 0.1% SDS-1倍SSC中室温下轻轻摇动洗涤 10min，然后在一定量的预热至68℃的 0.1%SDS-0.5倍SSC中洗涤3次。
注意事项： 1、EB会影响RNA与尼龙膜的结合，所以在 胶中不能加核酸染料EB。 2、实验所用的器具、试剂以及实验环境一 定要防止RNase的污染。 3、所有用于Noethern印迹的溶液均需用 DEPC处理后高压消毒的高质量去离子水制 备。 4、操作人员必须戴防护手套和口罩，防止 RNase污染和操易降解，而RNA酶不仅无处 不在，而且很难消除，所以在操作过程中 必须采取必要的措施，包括使用专门准备 的用具、试剂和溶液等，所有溶液尽量用 DEPC处理后高压消毒的高质量去离子水制 备。由于手汗含有大量的RNA酶，因此操 作人员必须戴防护手套。
northern印迹杂交操作步骤
northern印迹杂交操作步骤
Northern 印迹杂交是一种用于检测 RNA 的技术，以下是一般的 Northern 印迹杂交操作步骤：
1. RNA 提取：从样品中提取 RNA，可以使用适当的 RNA 提取方法，如苯酚-氯仿提取或商业化的 RNA 提取试剂盒。
2. RNA 质量评估：通过琼脂糖凝胶电泳或分光光度计等方法，评估 RNA 的完整性和浓度。
3. RNA 变性：将 RNA 样品在加热的缓冲液中进行变性，使其变成单链形式。
4. 凝胶电泳：将变性的 RNA 样品加载到琼脂糖凝胶上进行电泳，根据 RNA 的大小分离不同的 RNA 分子。
5. 转膜：将电泳后的 RNA 转移到固相支持物上，通常使用硝酸纤维素膜或尼龙膜。
6. 杂交：将带有 RNA 的膜与放射性或荧光标记的探针进行杂交，探针是与目标 RNA 互补的核酸序列。
7. 洗膜：在杂交后，进行洗膜步骤，以去除未结合的探针，降低背景信号。
8. 信号检测：使用放射性自显影或荧光检测方法，检测杂交信号，并进行图像分析。
9. 数据分析：根据杂交信号的强度和分布，分析 RNA 的表达水平和特异性。
需要注意的是，Northern 印迹杂交是一项技术要求较高的实验方法，操作过程中需要严格控制实验条件和避免 RNA 的降解。
此外，探针的设计和选择也对实验结果有重要影响。
在进行 Northern 印迹杂交实验之前，建议详细阅读相关的实验方案和参考文献，并根据具体的实验需求进行适当的优化和改进。
如果你对具体的实验操作有更详细的问题，建议参考相关的实验手册或向专业的实验室技术人员咨询。
希望这些信息对你有所帮助！如果你还有其他问题，欢迎随时提问。
Northern blot技术-1
Northern blot技术-1核酸杂交技术(Southern Blot、Northern Blot )(一)Southern Blot 原理: 将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二…(一)Southern Blot原理:将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途:检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
(二)Northern Blot原理:在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。
用途:检测样品中是否含有基因的转录产物(mRNA)及其含量。
(三)探针标记技术1 标记物:放射性和非放射性两种放射性:非放射性:生物素、地高辛素、荧光素2、标记方法(1)切口平移法(2)随机引物法(3)末端标记法(4)单链DNA探针标记(5)寡核苷酸探针标记法northern blot简介Northern blot 是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过northern blot的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。
Northern blot 首先通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。
Northern杂交实验步骤
Northern杂交实验步骤第17章 Northern杂交技术Northern杂交技术（Northern blot）是一种用于检测分析RNA 的核酸杂交技术，因为其基本原理和操作过程与Southern blot十分类似，所以称为Northern blot。
常用于检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。
17.1主要内容1. Northern Blot方法的原理和操作步骤。
2. RNA琼脂糖凝胶电泳。
3. RNA转移至硝酸纤维膜及膜处理。
17.2目的要求掌握Northern blot方法的原理和操作步骤；掌握RNA电泳，RNA转膜及膜处理方法。
17.3实验原理在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交、显色检测，以确定待检RNA样品中是否含有目的基因的转录产物（mRNA）及其含量。
17.4材料、试剂及器材17.4.1材料、试剂1.总RNA样品或mRNA样品，探针模板DNA(至少25ng)，DIG Easy Hyb杂交液(Roche公司)，10×nucleotide mix (10mmol/L each dA TP, dGTP, dCTP , DIG-11-dUTP)，琼脂糖，DEPC，Random Primer，KlenowⅠ酶，SDS，双氧水，DEPC处理水；EDTA (0.2mol/L pH 8.0)，RNA-free water (含40 U RNase inhibitor)。
2.试剂配制：1) 5×MOPS: 0.1mol/L MOPS，0.04mol/L NaAc，0.005mol/L EDTA。
使用时用DEPC水稀释5×倍使用。
在400ml的DEPC水中溶解10.46g MOPS，用HAc或NaOH 调节pH至7.0，然后加入1.64g NaAc 及5ml 0.5mol/L EDTA，用DEPC水定容至500ml，用0.22μm的滤膜过滤除菌，避光保存。
Northern-blotting
（一）RNA的提取及质量检测
RNA的提取 紫外吸收检测RNA的纯度和浓度 1.取RNA样品5ul，用水稀释50-100倍，转入分 光光度计的石英比色杯中。 2.在260nm和280nm分别读出样品OD值。根据 260nm时RNA浓度=OD260×40ug/ml×稀释 倍数。 3.若OD260/ OD280小于2，说明可能有DNA 片段污染，可用无Rnase的Dnase处理样品。
0d
2d
4d
6d
8d
GAPDH
Northern blot 杂交分析mRNA的表达
三 种 印 迹 技 术 的 比 较
T4噬菌体多 苷酸激酶催 化
（2）3’端标记法（大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片 段） 大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段有5’→3’DNA 聚合酶和微弱的3’→5’外切酶活性，但无5’→3’外 切酶活性。对残缺3’末端可进行标记。
35kD
76kD 5’ 3’聚合酶 3’外切酶 DNA聚合酶I全酶 3’ 5’外切酶
（五）杂交信号的检测
• 放射自显影 曝光：将滤膜用保鲜膜包住，固定在滤纸上 在暗室中在滤膜上覆盖一张X光片，并用两张 增感屏将滤膜和X光片夹住，放在暗盒中， 70℃曝光20min。 显影、定影 • 非放射性杂交分子的检测
应用
DNA探针检测特异mRNA的一种杂交技术，主要 用于分析mRNA的转录或mRNA分子大小。
2、杂交 将标记好的探针于 100℃煮沸 10～15分钟， 立即放冰浴冷却 10分钟。用杂交液稀释成所 需浓度。 将杂交袋中预杂交液倒出，加入 10ml 新鲜 的 Hyb杂交液（65℃预热，已加入变性的探 针)，小心排尽气泡，封口，放 65℃水浴振荡 杂交过夜。
3、洗脱 杂交完成后，取出杂交膜，放入装有 20mL 的 2×SSC/0.1% SDS 溶液的平皿中，在室温下振 荡洗涤两次，每次 5分钟。 然后放入 0.1×SSC/0.1%SDS溶液(先放 50℃水 浴预热)中，50℃水浴振荡洗涤两次，每次 15 分钟。
Southern印迹杂交作业指导书
Southern印迹杂交作业指导书实验目的学习和掌握Southern印迹杂交技术，检测重组DNA分子中是否含有目的基因片段。
实验原理具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异性的。
Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物(硝酸纤维素膜或尼龙膜)上，即印迹(blotting)；二是固定于膜上的核酸同同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。
这种技术是E．M．Southern l975年首创的，因此称Southern印迹杂交。
Southern印迹的印迹方法有毛细管法、电转法、真空转移法，滤膜有尼龙膜、化学活化膜(如ABM、APT纤维素膜)等。
这里主要介绍目前常用的电转法。
电转法是利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上，是近年来发展起来的一种简单、迅速、高效的DNA转移法。
一般只需2～3h，对于用毛细管法不理想的大片段DNA的转移较为适宜。
常用的电转仪有铂金丝电极和石墨电极。
实验内容材料和试剂印迹试剂l．待测样品，适当的限制性内切酶、琼脂糖。
2．变性液 1.5mol／L NaCl，0.5mol／LNaOH，高压灭菌。
3．中和液1mol／L Tris·HC1(pH8.0)，1.5mol／L NaCl，高压灭菌。
4．电泳液和转移液1×TBE或TAE。
5．尼龙膜、铂金丝电极电转仪。
杂交试剂1．预杂交液5×Denhardt试液，50mmol／L磷酸缓冲液(pH7.0)，0．2％SDS，500μg／m1变性的鲑精DNA片断，50％甲酰胺(也可不用)。
2．20×SSC，3mol／L NaCl 0.3mol／L柠檬酸钠。
3．2×SSC，0.1％SDS 溶液。
4．0.1×SSC，0.1％SDS溶液。
5．0.1×SSC溶液。
(完整版)Northern-blotting
（一）RNA的变性电泳
原理：RNA的二级结构使得RNA不能严格按 照其分子质量的大小在琼脂糖电泳中分离， 所以进行RNA电泳时，RNA必须经过变性剂 处理使二级结构解体，泳动时才能按分子质 量大小分离。
试剂：10×MOPS(0.2mol/L 3-N-吗啉-丙磺酸； 0.05mol/L 醋酸钠； 0.01mol/L EDTA）、RNA上样 缓冲液（去离子甲酰胺0.72ml；10×MOPS 0.16ml； 37%甲醛0.26ml；0.1%DEPC水0.18ml；80%甘油0.1ml ；饱和溴酚蓝0.08ml、琼脂糖、37%甲醛琼脂糖。
RNA印迹技术 (Northern blotting)
2010.03.28
Northern blot 印迹杂交原理示意图
核酸分子杂交（固相杂交）操作程序
制备待测核酸样品
制备核酸探针
分离、变性、转移、固化RNA片段
标记核酸探针
预杂交
加入标记核酸探针
杂交 漂洗去除未参与ห้องสมุดไป่ตู้交的标记探针
检测杂交信号
（一）RNA的提取及质量检测
2、切口平移法 胰DNA酶I在DNA双链上随机切开若干切口 ，切口处形成3’-OH末端。 大肠杆菌DNA聚合酶I以切口处开始作用， 以另一条DNA链为模板。 4种三磷酸脱氧核苷酸为原料，沿切口水解 5’端核苷酸和3’端修复加入标记核苷酸同 时进行，切口平行推移。 生成的两条链都被同位素均匀标记。
3、末端标记法
末端标记法是将标记物导入线型DNA或 RNA的5’端或3’端的一类标记法。
5’端标记法 3’端标记法
（1）5’端标记法（T4噬菌体多苷酸激酶） 用碱性磷酸酶切除DNA双链分子或RNA单链5’
末端的磷酸基团，使其成为5’-OH，然后在（γ32P）ATP存在下，经T4噬菌体多苷酸激酶催化， 将γ位上的32P转移到DNA或RNA分子的5’-OH 末端，使DNA片段或RNA或寡核苷酸5’端均带 32P标记。
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northern 印迹杂交流程图
所用材料、试剂及仪器 方法与步骤 参考书籍及文献
材料
总RNA样品或mRNA样品、 探针模板DNA、随机引物、地高 辛-dUTP、klenow酶、硝酸纤维 素虑膜等。
试剂
• 10*MOPS缓冲液、DEPC水、6*RNA上样 缓冲液、37%甲醛、甲酰胺、 20*ssc(pH7.0) 杂交缓冲液、2*洗膜缓冲液 (2*ssc)、预杂交液、杂交缓冲液、缓冲液 Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ、NBT(硝基四氮唑蓝 )、 BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐) 、TE缓冲液、 显色液、琼脂糖等。
上样
用标尺测量加样 孔与条带的距离
，拍照
切去凝胶一角，用 用SSC冲洗并浸泡 胶板，以除去甲醛
。
电泳：用1*MOPS缓冲液 ，先用20V使样品进胶， 再用5V/cm电泳1 h ，停 止电泳。
2.转膜
浸泡在250 ml 50 Mmol/l NaOH ,室 温、30r/min 30 min。
浸泡在 250 ml
仪器
• 恒温水浴箱，电泳仪，杂交袋，真空转移 仪，真空泵，杂交炉，恒温摇床，脱色摇 床，漩涡振荡器，分光光度计，微量移液 器，电炉（或微波炉），离心机，烧杯， 量筒，三角瓶，紫外灯等。
1.RNA电泳
琼脂糖与纯水一定 比例于微波炉内混 匀、冷却到75°C
加mops缓冲液、 甲醛，混匀。
制备成电泳用胶 待胶凝过程中， 准备RNA样品。
tris*NaCI 室温、30r/min 30min。
浸泡在250ml 10*SSC约1min
。
RNA转膜前的处理
转膜的 方法
毛细管洗脱法 真空转移法 电印迹法
叠放的滤纸，凝胶和膜之间不能有气泡，转膜约 10 h。
电泳后的凝胶 → 放置 → 室温转移10—25h → 漂洗（SSC）除碎胶片 →80℃烘烤2h固 定核酸.
3、探针标记
探针模 模板、随 机引物 、双蒸
水。 冰块
离心、 混匀。 变性
顺序加
随机引
缓冲液
、dNTP 、dUTP
室温
Klenow 3h
酶，混
匀。
75°C 保温10 Min。
加预冷 无水乙 醇、混 匀。1000r/min15min、去上清
-20
℃、
、乙醇洗 涤、真 空干燥
2 h 、TE溶解
、-20°C
• 洗膜：在室温下用50mL 2*SSC， 0.1% SDS 溶液洗膜两次以上，每次 5 min。膜即可以立即用于显色检测或 储存备用（干燥环境中）。
5.酶联免疫染色
• 室温，用缓冲液Ⅰ洗膜 1-5 min，缓冲液 Ⅱ洗膜 30 min，再用缓冲液Ⅰ洗膜 1-5 min。
• 用缓冲液Ⅰ稀释抗体缓冲液（1：2000）， 稀释后的抗体溶液在4℃只能稳定12 h。室 温下将膜在抗体稀释液中浸泡30 min。
• 缓冲液Ⅱ洗膜2次，每次15 min，以除去 未结合的抗体复合物。再用20 mL缓冲液 Ⅲ平衡膜2-5 min。
• 在黑暗条件下将膜与显色液放入密封 的暗盒中显色。通常 2 min后出现颜 色，充分显色应在16 h以上。膜可以 在弱光下短时间暴露以检测显色强度。
• 显色完毕后用TE缓冲液停止染色，照 相记录显色结果。
[4] 魏春红,李毅.现代分子生物学实验技术[M].高等教育出版 社,2006,156-162.
[5] 汪天虹.分子生物学实验[M].北京大学出版社,2009,76-79.
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Northern印迹杂交技术
• Northern 杂交是用于RNA定量和定性分析的常 用技术，它是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸 纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，再进 行核酸分子杂交的一种实验方法。
• 可以鉴定总RNA或poly(A)+RNA样品中同源 RNA的存在与否、测定样品中特定mRNA分子的 大小和丰度，是分子生物学中研究基因表达在转 录水平上的调节以及cDNA合成的重要手段。
结果示例
参考书籍及文献
[1] 朱玉贤,李 毅.现代分子生物学[M].高等教育出版 社,2002，173-178.
[2] 黄怡森,张光毅.生化与分子生物学[M].科学出版社， 2008，345-347.
[3] 郝福英,朱玉贤,朱圣庚，等.分子生物学实验技术[M].北 京大学出版社,1998,68-72.
备用。
4.杂交
• 将待杂交的滤膜放入杂交袋中，按 20mL/100cm2滤膜计算加入预杂交 液、68℃水浴摇床杂交1-2 h。
• 将标记好的DNA探针煮沸5min，迅 速在冰上冷却。将探针加入预热的杂 交液中，充分混匀。
• 倒去预杂交液，按250mL/c㎡滤膜计 算向杂交袋中加入含地高辛标记探针 的杂交液，68℃杂交6 h以上。