医学分子生物学第九章印迹杂交技术

辣根过氧
化物酶
底物
产物， 并发出光
辣根过氧化物酶：HRPO 底片曝光
③ Blotting过程
1）牛血清白蛋白封闭硝酸纤维素膜 2）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与
膜上的蛋白结合。 3）洗去未结合的一抗。 4）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。 5）清洗掉未结合的二抗。 6）显影，检测
④结果 单抗blotting 结果
四、显影检测
二、印迹技术的类别及应用
（一）DNA印迹 (Southern blotting)
用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。
（二）RNA印迹 (Northern blotting)
用于RNA的定性定量分析。
（三）蛋白质的印迹 (Western blotting)
用于蛋白质定性定量及相互作用研究。
组织蛋白芯片
组织芯片
（2）Western blotting
① Western（转膜）
电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转 到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、中性尼 龙膜等）。
胶里的蛋白质带在电场
的作用下横向转移到正
胶
膜
极一侧的膜上。
蛋白
Western装置
② Blotting
PAGE胶 待测蛋白
硝酸纤 维素膜
待测蛋白 一抗 二抗
3.139409 7.4948105 3.5414525 4.8324688 3.4086302 4.7152206 3.1677641
3.701377
组织芯片（tissue microarry）
是近年发展起来的以形态学为基础的分子生 物学新技术。它是将数十倒上千种微小组织切片 整齐排列在一张基片上制成的高通量微阵列，可 以进行荧光原位杂交（FISH）或者免疫组化 （immunohistochemistry）分析。因此组织芯片 是传统的核酸原位杂交或免疫组化分析的集成。
基本程序（1）细胞或组织固定及切片 （2） 预杂交及杂交（3）冲洗 （4）放射自显影或 标记酶显色
原位杂交的原理
原位杂交的原理
肌肉 组织 块
石蜡切片机
切片
显色
http://www.56.com/u62/v_NDA2NDUxMzk. html
杂交
蛋白印迹法
（四）免疫印迹（western blotting）法
在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测 胶上的蛋白质泳带。
（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）：
是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线 性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷。
② 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） （Polyacrylamide gel electrophoresis）
6744 8989.5
9067 8188.5 11189.5 11970.5
标准值
model
0.5266084
0.1231144 0.1709812 0.1681187 0.0986358 0.0467252
0.304313 0.2205064 0.2132026 0.3539745 0.4776853
（一）核酸的变性与复性
复性
RNA
DNA
（二）探针标记
用放射性核素、生物素或荧光染料标记其 末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为 “探针”，探针可以与固定在NC膜上的核苷 酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。
放射性标记
P32
非放射性标记
（三）印迹技术
利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子 转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。 这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因 此称之为“blotting”，译为印迹技术。
normal
0.1404062
0.0374126 0.0423561 0.0535511 0.0131605 0.0131938 0.0629726 0.0646906 0.0452158 0.1117427 0.1290561
比值
model vs normal 3.7506058
3.2907207 4.0367534
其他： 斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交 (in situ hybridization) DNA点阵 (DNA array) DNA芯片技术 (DNA chip) 菌落杂交（colony hybridization ）
三 种 印 迹 技 术 的 比 较
Sourthern杂交步骤
基因表达谱芯片
分别从不同器官或组织中分离mRNA，反转录 生成cDNA
基因表达谱芯片
将标记后的cDNA与点好的芯片进行杂交。
Tumor Sample
Normal Sample
基因表达谱芯片
激光扫描芯片杂交结果，计算机处理
杂交需要进行重 复性实验，主要的 方法是两次平行杂 交反应，将每个基 因在两个反应中的 表达水平做成对应 散点图，只要绝大 多数基因杂交结果 都在45度斜线附近， 就说明实验结果是 可靠的。
23 ICK
4 IL-3
22 MIP-3 alpha
25 MMP-8
原始值
model
normal
30386
12625 14732 14606 11547.5 9262.5 20601 16912 16590.5 22787 28232.5
12482.5
7836.5 8059.5 8564.5 6742.5
数据分析
二、蛋白质芯片
蛋白质芯片(protein chip) 是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点
阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反 应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统 对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。
蛋白质芯片作用原理 蛋白质分子间的亲和反应
干姜附子肉桂造模的血清细胞因子芯片检测（L Series 90: RayBio® Labelbased Rat Antibody Array ，货号：AAR-BLM-1-2 ） Normal
商品化供应
道尔顿(质量单位, 等于 一氧原子质量的十六分 之一。 一克约为6×1023道尔顿
Dalton SDS PAGE
④凝胶中的蛋白质染色：
1）直接染色
考马斯亮蓝： 灵敏度低、只能检出>0.3-1μg/带，但可 褪色回收。
硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。
2）转到膜上进行染色。
直接染色电泳结果
1、提取基因组DNA
2、用限制性内切酶消化DNA， 使其变成DNA片段
3、将Leabharlann Baidu化过的DNA片段跑琼 脂糖凝胶电泳
4、将核酸样品转移到固体支 持的滤膜上
5、将具有核酸印迹的滤膜与 带有放射性标记或其它标记的 DNA或RNA探针进行杂交。
6、进行显影（进行曝光或者 是染色显影）
②
③ ①
http://v.youku.com/v_show/id_XMzQyNzU4 OTIw.html http://v.youku.com/v_show/id_XMjYwODM 5MTY4.html
电泳buffer 在电场的作用下线性蛋白 质链在聚丙烯酰胺凝胶介 质中向正极移动，移动的 速率主要取决于其分子量 大小（链的长短），从而 把不同分子量的肽链分开。
电泳buffer
点样
电泳方向
③蛋白质电泳的
Da
分子量标准
已知分子量的蛋白质混合 液，与待测样品一起电泳， 为样品蛋白质提供分子量 估计。
第八章 印迹杂交技术
分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization and Blotting Technique
一、分子杂交与印迹技术的原理
核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链
分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一 起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定 的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形 成杂化双链(heteroduplex) 。
多克隆抗体 Blotting的结果
基因芯片及数据分析
一、基因芯片的技术原理 二、基因芯片的点制过程 三、基因芯片的数据分析
基因芯片
基因芯片发展历史
Southern & Northern Blot Dot Blot
Macroarray
Microarray
基因芯片
芯片杂交操作流程：
经大规模PCR扩增获得独立cDNA插入片段； 用机悈手将PCR产物点在玻璃板上，变性、固定。 分别从不同器官或组织中分离mRNA，反转录生成
Model
造模后，基因上调3倍的细胞因子
Colum n
Name
8 Activin A (激活素A)
15 beta-Catenin（连环蛋白）
16 basic-FGF（成纤维生长因子）
17 beta-NGF（神经生长因子）
23 CNTF R alpha（睫状神经营养因子）
26 EGFR
22 ICAM-1/CD54（细胞间黏附分子）
cDNA； 分别用cy3(绿色)和cy5红色两种荧光燃料标记两种
cDNA。 将标记后的cDNA与点好的芯片进行杂交。 激光扫描芯片杂交结果，计算机处理。 分析杂交数据。
基因芯片
芯片杂交操作流程：
基因芯片
经大规模PCR扩增获得独立cDNA插入片段
人工制作芯片
商业化芯片
分别用cy3(绿色)和cy5红色两种荧光燃料标记两 种cDNA
菌落杂交
滤膜
将滤膜与标记探针杂 交
挑选相应的菌落 进行培养
细菌平 板
原位杂交的原理
原位杂交由Gall，Pardue和Buongiorno于 1969年首次报道，是用标记好的核酸做探针， 在原位检测细胞或组织切片内特定核酸序列的 方法。原位杂交根据检测物的不同可分为细胞 内原位杂交和组织切片原位杂交。