细胞裂解方法
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裂解方法包括化学裂解、酶裂解和机械裂解。化学裂解和酶裂解通常是比较温和的方法,通常会很少使DNA断裂。这两种方法(包括SDS和溶菌酶处理等)提取纯化DNA中常用的方法。机械裂解可以更均一的裂解细胞,同化学裂解相比,机械处理具有更高的裂解效率和更低的选择性。机械处理可以更剧烈和全面的裂解细胞,但也会造成DNA的断裂。
一、机械裂解法主要有以下两中:
1.热休克(Thermal shock),既反复冻溶法,是一种常用的机械裂解方式比,通常由冷冻和解冻两部分组成(freezing and thawing),。原理:由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎。冷冻通常在液氮或-20°C冰上进行,解冻可以在37、50、65或100℃水浴中进热休克比化学裂解温和,但是很有效,有资料表明用热休克和溶菌酶与SDS的方法获得了90%的细胞裂解率。
2.超声波处理(Ultrasonication)既利用超声加热的方法,把细胞破碎。但这种处理会导致DNA的断裂,所以加热不宜过剧烈,要设定好超声时间和间隙时间,一般超声时间不超过5秒,间隙时间最好大于超声时间,这些都有利于保护酶的活性。bead-beating也是常用的机械处理方式,有报道指出bead-beating比热休克和化学裂解的细胞裂解效果更好虽然DNA产量较高,但通常得到的DNA片段较小。
二、化学裂解和酶裂解法(在提核酸时联合使用)
主要是裂解液处理法,细胞裂解液的主要目的有以下几种:(1)利用去污剂破坏脂质双分子层,破裂细胞;(2)溶解蛋白;(3)蛋白变性使其稳定;(4)抑制蛋白酶活性。
主要根据不同的目的,裂解液的组成有所不同,主要有提取核酸和蛋白两中。在提取RNA 或DNA时,我们主要是要充分裂解细胞,得到更多的核酸;如果我们的目的是蛋白,那要根据蛋白的位置、特性等因素考虑裂解液,在提取蛋白后,再根据实验需要复性蛋白等。以下是细胞裂解中常用试剂和其作用:
50mM Tris-HCl pH7.4(缓冲体系),150mM NaCl(等渗体系),1mM PMSF(强大的蛋白酶抑制剂),1mM EDTA(变性剂和稳定剂),5μg/ml Aprotinin(蛋白酶抑制剂),5μg/ml Leupeptin(蛋白酶抑制剂),1%Triton x-100(破坏细胞),1%Sodium deoxycholate(中度变性剂和蛋白溶解剂),0.1%SDS(强变性剂和蛋白溶解剂)。7M尿素,2M硫脲(可以提高膜蛋白的融解),蛋白酶K等。