第2章 核型与染色体显带

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MetaphaseMetaphase- FISH
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• 荧光原位杂交 （Fluorescence in situ hybridization FISH）在原有的 放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性 原位杂交技术。 • 应用：动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分 析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因 组进化研究待许多领域。 • 原理：用已知的标记的单链核酸为探针，按照碱基互补 的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合， 形成可被检测的杂交双链核酸。 • 优点：快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染 色。
& 芥子喹吖因，碱性染料，是被第一个用于染色体显带的物质 & T.Caspersson 和同事发展起来的技术 & 芥子喹吖因染色后，在荧光下观察会看到明暗条带 & 明带主要是富含AT的区域，暗带是富含GC的区域 & 芥子喹吖因在DNA上的结合主要是通过插入或者结合 在G的烷基上 & Q带的产生主要是因为结合在不同区域的芥子喹吖因 的荧光激发效率不同 & 结合在AT富含区域的芥子喹吖 富含区域的芥子喹吖因会更比结合在 富含区域的芥子喹吖 GC富含区域的更亮
Disadvantages:
• Very expensive equipments. • The technique is labor intensive. • Dose not detect structural rearrangements within a single chromosome. • Low resolution (up to 15 mb ). • Specific, not a screening method.
可以提高染色体分析的敏感性，特 异性和精度 Increased the sensitivity , specificity ,and resolution of chromosome analysis. • 荧光标记的DNA探针约40kb，用 于检测基因和染色体的异常其精度 是常规遗传学无法比的。 Fluorescently labeled DNA probe ~40 kb.to detect or confirm gene or chromosome abnormalities that are beyond the resolution of routine cytogenetics. • Metaphase FISH • Interphase FISH
• 探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。
– 间接标记是采用生物素标记DNA探针，杂交之后用藕联有 荧光素亲和素或者链霉素亲和素进行检测，同时还可以利 用亲和素-生物素-荧光素复合物，将荧光信号进行放大，从 而可以检测500bp的片段。 – 而直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸或磷酸戊糖骨 架共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三 磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单，但由于不能进 行信号放大，因此灵敏度不如间接标记的方法。
SKY-cont.
Advantages:
• Mapping of chromosomal breakpoints. • Detection of subtle translocations. • Identification of marker chromosomes,homogeneously staining regions,and double minute chromosomes. • Characterization of complex rearrangements.
• 染色体（不同颜色的探针）
FISH的优点
• • • • • 精度更好(L ~ 2mb). 可应用于分裂ห้องสมุดไป่ตู้不分裂期的细胞 技术简单 多探针杂交，可检测易位 可以鉴定一系列突变
FISH的缺点
• • • • 不能检测小的突变 不能检测单亲二倍体 不能检测倒位 整个染色体区域的探针还不能商业化
光谱核型分析和多色FISH
Q banding
G banding
Model of G- and R-banding
Low/High Resolutions Karyotype
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人类染色体的正常核型（4） 类染色体的正常核型（ ） The normal human karyotype p：短臂 q：长臂 • 界标 landmark
Spectral Karyotyping (SKY) and Multiple Fluorescence In Situ Hybridization(M-FISH)
多色FISH
Multiple Fluorescence In Situ Hybridization(M-FISH) • FISH一个最大的特点是可利用不同颜色的 FISH一个最大的特点是可利用不同颜色的 一个最大的特点是可利用不同颜色 荧光素标记不同的探针 不同的探针， 荧光素标记不同的探针，同时对一张制片 进行杂交，从而对不同的靶DNA 进行杂交，从而对不同的靶DNA 同时进行 定位分析。但是， 定位分析。但是，由于不同荧光素之间的 光谱重叠，一般只限于同时用三种 三种不同颜 光谱重叠，一般只限于同时用三种不同颜 色进行标记。 色进行标记。
– 可观察到基因组的全部染色体 – 适合于当怀疑有染色体异常，可作为一般的染 色体异常的检测工具。
• 缺点
– 只能检测较大的结构异常
• ( one band = 6mb of DNA ~ 150 genes ).
– 需要大量的劳动并高度依赖操作者的经验和技术
二、荧光原位杂交
Fluorescence in situ hybridization (FISH)
细胞核能被染料染成深色－－染色质 染色体的行为与孟德尔的规律表现一致－－遗传物质 遗传物质包括核酸和蛋白：噬菌体侵染实验，肺炎双球菌的转化 实验 一个物种到底有多少条染色体？？？？
Karyotype preparation
Q带：喹丫因染色后，紫外照射下的明暗带（富含AT的明带， 富含GC的暗带）； G带：Giemsa染料染色后所呈现的染色体区带；（AT区是深 色） R带：是中期染色体经碱性磷酸盐处理，丫啶橙或Giemsa染 色后所呈现的带型，一般与G带正好相反； C C带：显示着丝粒结构异染色质及其它染色体区段的异染色质。 T带：是染色体端粒部位经丫啶橙染色后呈现的区带； N带：Ag-As染色，主要染核仁组织者区域的酸性蛋白。 1975年建立了染色体高分辨显带技术。 染色体微切割和分子克隆技术。
• BSG（氢氧化钡/盐/Giemsa）方法被认为 是标准的C显带方法 • C显带的机制可能再蛋白而不是DNA C DNA • 在C带上的蛋白可能对Giemsa有更强的亲 和性
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更常用于鉴定昆虫和植物的染色体 鉴定减数分裂染色体 终变期时用两个着丝粒的位置鉴定二价体 用于亲子鉴定和基因图谱
简单，用途广泛 G带不可用时，可用Q带 用于研究染色体变异
用于研究Y染色体
R带是G带的反带 G带中量的地方在R带中是暗带
R带染色时，用热的盐溶液处理，使富含AT区域变性， 然后再用Gimsa染色
The normal human karyotype 染色体显带 Q-; G-; R-; C-;
（臂的末端、着丝粒 和某些带）界标之间 为区
• 区 region（区内有
连续排列的带，作为界 标的带命名为远端区的 第1带）
• 带 band（带的命名
由连续的符号命名）
1p35：1号染色体，
短臂，第三区，第5带
染色体显带技术的应用
1，染色体变异 2，基因定位
传统核型分析技术的优势和缺点
• 优势
第二章 核型与染色体显带 Karyotype and bands
一、核型与染色体显带
对人类到底有多少条染色体这样的问题一直争论到1956年才 年才 对人类到底有多少条染色体这样的问题一直争论到 得以确认，主要归功于50年代以后逐步发展起来的低渗处理 年代以后逐步发展起来的低渗处理， 得以确认，主要归功于 年代以后逐步发展起来的低渗处理， 压片技术以及秋水仙处理和细胞培养技术 以及秋水仙处理 技术。 压片技术以及秋水仙处理和细胞培养技术。 二十世纪60年代末至70年代发展起来的各种染色体分带技 二十世纪60年代末至70年代发展起来的各种染色体分带技 60年代末至70年代发展起来的各种 使染色体的研究进入了一个黄金时代。为人类遗传病的鉴 术，使染色体的研究进入了一个黄金时代。为人类遗传病的鉴 物种的亲缘关系与进化研究、遗传育种等方面提供了重要 亲缘关系与进化研究 定，物种的亲缘关系与进化研究、遗传育种等方面提供了重要 的依据。 的依据。
解决的办法
• 组合标记技术：一个探针同时利用一种或 组合标记技术： 几种不同颜色的荧光素标记， 几种不同颜色的荧光素标记，原则上可标 记的探针数2n -1。 记的探针数2 • 比例标记FISH：用不同比例的各种荧光素 比例标记FISH： FISH 对每个探针进行标记，组合标记FISH的容 对每个探针进行标记，组合标记FISH的容 FISH 量将进一步增加，并能进行定量分析。 量将进一步增加，并能进行定量分析。
• 1种荧光素 • 2种：X，y，xy • 3仲：x，y，z，xy，xz，yz
光谱核型分析
Spectral Karyotyping (SKY) • 可以同时观察人和小鼠的 所有染色体 • 染色体显示不同的颜色 • 组合了5中荧光素对人22条 常染色体和x、y染色体进 行复合染色，根据他们特 有的激发光进行分析。
SKY是 M-FISH一种 SKY采用干涉成像技术。 是 一种, 采用干涉成像技术。 一种 采用干涉成像技术 公司在Thomas Ried的合作下成功进 是1995年ASI公司在 年 公司在 的合作下成功进 行的实验。 行的实验。 SKY是一种光谱影像分析方法，它运用了光 是一种光谱影像分析方法，它运用了光 是一种光谱影像分析方法 谱干涉仪及傅立叶变换， 谱干涉仪及傅立叶变换，将图像中每一像素做光 谱分析后，在做重新显示， 谱分析后，在做重新显示，增强了对多种荧光分 子的辨别。其结果分显色图像和分色图象两部分， 子的辨别。其结果分显色图像和分色图象两部分， 前者可用于图象获取后即可评估所有探针的杂交 质量；后者用特定的SKY软件，参照每一条染色 软件， 质量；后者用特定的 软件 体特有的光谱信息特征进行分析。 体特有的光谱信息特征进行分析。
NonNon-Banded Karyotype
Normal Karyotype
Ideograms
^ 只要是能证明结构异染色质（constitutive heterochromatin） 只要是能证明结构异染色质（ 结构异染色质 ） 的方法都称为C带方法 的方法都称为 带方法 ^ 用于鉴定着丝粒 异染色质 用于鉴定着丝粒 着丝粒/异染色质 只要是能证明C带 ^ 异染色质区 * 包含重复序列 * 高度凝集的染色质纤维 ^ 通常会用酸、碱和高温处理 通常会用酸、 ^ 细胞DNA在这些处理下会变性 细胞 在这些处理下会变性 ^ 高度重复的 高度重复的DNA，例如结构异染色质 ，例如结构异染色质DNA会在相应的条件下 会在相应的条件下 复性，但单拷贝的DNA不会复性，这样会创造不同的染色条件。 不会复性， 复性，但单拷贝的 不会复性 这样会创造不同的染色条件。
FISH的应用
• 用于微缺失综合症的检测 • 三染色体检测和性别决定 • 癌症检测
– Single Gene Probes( deletion or amplification) P58 CLK-1 Locus (1p36). D7S486 (7q31). Retinoblastoma (13q14). P53 (17p13.1). Her-2/ neu (17q11.2-q12).
Genomic Comparative Hybridization(CGH)
Fluorescent molecular tech. that identifies DNA gains,losses,and amplifications (mapping to)metaphase chromosomes. Based on quantitative two-color FISH (FITC for tumor DNA and TRITC for the normal DNA).