化学发光免疫分析中的标记物质及类型
化学发光免疫分析
糖尿病
Albumin C-peptide Insulin
唐氏筛查
PAPP-A free βHCG HCG＋β AFP
心肌标志
骨标志
肝纤维
CK-MB
ß-Crosslaps
LN
Digoxin
25-(OH) Vit. D
HA
Digitoxin
Intact PTH
PIIINP
Myoglobin
Intact PTH
试剂有效期长 有效期可长达1年以上，放射免疫分析由
于放射性同位素的衰变，一般有效期只有一 个月，而酶免的底物贮存性差，都无法与化 学发光相比，有效期长可以降低使用成本， 利于推广应用。
梦想——之以恒、真正为实现纳米科技事业的梦想而奋斗！
3 化学发光免疫分析的优越性
➢ 中国免疫诊断现状
中国
国际（欧美为主）
种类
方法
检测原理
酶联免疫
酶与样本反应，依据颜色变化程度确定结果
免疫 化学发光
诊断
将抗原抗体同样本结合，由磁珠捕捉反应物，加入 发光促进剂加大反应发光速度与强度，进而诊断
根据镧系元素螯合物发光特点，用时间分辨技术测 时间分辨荧光
量荧光，检测波长和时间两个参数进行信号分辨
分子 诊断
PCR 基因芯片
DNA高温变成单链，低温互补配对链合成
激发态ν
的中间体。这种激发态中间体，当其回到稳定的基态时，可同时发射出
光子。利用发光信号测量仪器即可测量光量子产额，该光量子产额与样
品中的待测物质的量成正比。由此可以建立标准曲线并计算样品中待测
能量
h.ν
物质的含量。
基态ν0 梦想——之以恒、真正为实现纳米科技事业的梦想而奋斗！
血检四项化学发光法调查
血检四项化学发光法调查目前血检四项（HBsAg、HCV、HIV、TP）的检测方法主要有酶联免疫（ELISA）、核酸扩增（PCR）、胶体金标记、以及化学发光（CLIA）。
现就CLIA在血检项目中的应用情况做一调查分析。
一．化学发光免疫分析法简介。
化学发光免疫分析法(Chemiluminescence imnunoassay，CLIA)是建立在放射免疫分析技术(radioimmunoassay，RIA)理论的基础上，以标记发光剂为示踪物信号建立起来的一种非放射标记免疫分析法。
CLIA是利用化学反应中释放大量自由能，产生激发态中间体，当其回到稳定的基态时发射出光子（hν），用发光信号测量仪对所发出的光量子进行定量测量。
鲁米诺(1umino1)、异鲁米诺(isolumino1)及其衍生物、吖啶酯(acIidinim ester)衍生物、辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)是目前CLIA中使用最多的四类标记物。
表1 化学发光法类型注：* 严格意义上属于荧光免疫。
二．国内外化学发光法的仪器和试剂情况。
国外化学发光法检测仪器的生产厂家以贝克曼、雅培、罗氏、拜耳这四家的市场占有率较高。
其中罗氏拥有唯一的电化学发光技术，雅培则独占微粒子酶联免疫（EMIA）。
不同厂家的仪器有各自的优势检测项目，主流的仪器型号如下：表2 国外主要化学发光免疫分析仪厂家国内也逐渐有厂家研制化学发光试剂，配合国外引进的仪器（多为半自动）共同销售，也有自发研制的化学发光仪（泰格科信）。
针对血检四项（HBsAg、HCV、HIV、TP），除北京科美生物（科美东雅）外，所有厂家试剂均只有HBsAg试剂。
表3 国内主要厂家仪器和试剂情况国外厂家的试剂大多随仪器配送，并没有在SFDA单独注册。
目前SFDA注册的血检四项化学发光法试剂列表如下。
就检测项目来看，除梅毒外，其余三项均可使用化学发光法；就现有资料，国内外只有北京科美东雅配有梅毒检测试剂。
化学发光免疫标记分析技术基本原理
化学发光免疫标记分析技术基本原理化学发光免疫标记分析技术主要包括两个步骤：标记物制备和检测过程。
在标记物制备阶段，通常使用特定的荧光染料或荧光标记物来与待检测物质进行反应，并形成稳定的标记物-待检测物质复合物。
而在检测过程中，通过光学系统激发和采集标记物产生的化学发光信号，从而获得待检测物质的信息。
1.标记物制备：在化学发光免疫标记分析技术中，常用的标记物包括酶标记物和荧光标记物。
酶标记物的原理是将特定酶与待检测物质结合，并通过酶反应产生化学发光信号。
例如，常用的酶标记物有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）等。
而荧光标记物的原理则是将特定荧光染料或荧光物质与待检测物质发生物理或化学反应，从而产生荧光信号。
荧光标记物具有高灵敏度、高分辨率和多颜色检测等优点。
2.检测过程：在化学发光免疫标记分析技术中，通常采用放射性同位素或者化学合成的光感受物质作为化学发光底物。
这些光感受物质在一定条件下与酶标记物或荧光标记物发生反应，产生化学发光信号。
这种化学发光反应通常是一种酶催化反应，通过酶的催化作用将底物转化为高能态的中间产物，进而使中间产物与发光底物反应产生化学发光。
1.样品制备：将待检测的样品进行适当处理和净化，以去除干扰物并保留待测物质。
2.标记物制备：选择适当的酶标记物或荧光标记物，并将其与待检测物质结合，形成稳定的复合物。
3.反应过程：将标记物与样品中的待测物质进行反应，形成标记物-待检测物质复合物。
4.分离与清洁：根据实验需求，通过特定的分离技术分离出标记物-待检测物质复合物，并清洁除去未结合的杂质。
5.光学系统激发和采集信号：将分离出的标记物-待检测物质复合物放置于化学发光仪或荧光显微镜等设备中，通过特定的光源激发标记物产生的化学发光或荧光信号，并通过相应的光学系统采集和记录信号。
6.数据分析和结果解读：通过对采集得到的化学发光或荧光信号进行数据处理和分析，根据标定曲线或标准样品，计算出待检测物质的含量或其它相关信息，并根据实验目的对结果进行解读。
化学发光免疫标记分析技术(基本原理)
优化技术操作流程，降低对专业人员的依赖，提高检测的便捷性和 普及性。
开发新型标记物
研究开发更多种类的化学发光标记物，拓展该技术的应用范围，满足 更多不同检测需求。
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THANKS
放射免疫标记技术
利用放射性核素标记抗体或抗原，通 过放射性信号检测，常用的有放射免 疫分析法。
化学发光免疫标记技术
利用化学发光物质标记抗体或抗原， 通过化学发光信号检测，常用的有化 学发光免疫分析法。
免疫标记技术的原理
抗原-抗体反应
信号放大
免疫标记技术的基本原理是抗原 和抗体之间的特异性结合反应。 标记物（抗体或抗原）与待测样 本中的目标抗原或抗体结合，形 成标记的抗原-抗体复合物。
02
化学发光反应原理
化学发光反应的分类
偶合反应
01
通过两个化学反应的偶合，将化学能转变为光能。
氧化还原反应
02
通过电子的得失，将化学能转变为光能。
化学发光复合反应
03
通过化学反应将能量传递给另一物质，使其激发并发出光子。
化学发光反应的机制
激发态的形成
反应物吸收能量后跃迁至激发态。
能量传递与光子的发射
抗体标记
抗体选择
选择与目标抗原特异性结合的抗体，确保抗 体的纯度和特异性。
抗体标记技术
采用荧光染料、酶、同位素等标记抗体，以 便后续检测和信号放大。
标记效率与质量控制
对标记后的抗体进行质量评估和控制，确保 标记效率和稳定性。
免疫反应
1 2
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ加样
将待测样本、标记抗体和抗原加入反应体系中， 进行免疫反应。
激发态的反应物将能量传递给另一物质，使其跃迁至激发态并释放 光子。
化学发光免疫分析
化学发光免疫分析的类型介绍更新：2012-05-16 12:26:51 | 来源：标签：化学发光反应参与的免疫测定分为以下几种类型：（一）化学发光酶免疫测定化学发光酶免疫测定（CLEIA）是采用化学发光剂作为酶反应底物的酶标记免疫测定。
经过酶和发光两级放大，具有很高的灵敏度。
以过氧化物酶为标记酶、以鲁米诺为发光底物、并加入发光增强剂以提高敏感度和发光稳定性。
应用的标记酶也可以为碱性磷酸酶，发光底物为dioxetane磷酸酯，固相载体为磁性微粒医学教|育网搜集整理。
（二）化学发光免疫测定化学发光免疫测定（CLIA），是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的一类免疫测定方法。
吖啶酯是较为理想的发光底物，在碱性环境中即可被过氧化氢氧化而发光。
用作标记的化学发光剂应符合以下几个条件：1.能参与化学发光反应。
2.与抗原或抗体偶联后能形成稳定的结合物试剂。
3.偶联后仍保留高的量子效应和反应动力。
4.应不改变或极少改变被标记物的理化特性，特别是免疫活性。
鲁米诺类和吖啶酯类发光剂等均是常用的标记发光剂。
（三）微粒子化学发光免疫分析该免疫分析技术有两种方法：一是小分子抗原物质的测定采用竞争法；二是大分子的抗原物质测定采用双抗体夹心法。
该仪器所用固相磁粉颗粒极微小，其直径仅1.0μm，这样大大增加了包被表面积，增加抗原或抗体的吸附量，使反应速度加快，也使清洗和分离更简便。
其反应基本过程：（1）竞争反应：用过量包被磁颗粒的抗体，与待测的抗原和定量的标记吖啶酯抗原同时加入反应杯温育，其免疫反应的结合形式有两种，一是标记抗原与抗体结合成复合物；二是测定抗原与抗体的结合形式。
（2）双抗体夹心法：标记抗体与被测抗原同时与包被抗体结合成一种反应形式，即包被抗体-测定抗原-发光抗体的复合物。
（四）电化学发光免疫测定电化学发光免疫测定（ECLI）是一种在电极表面由电化学引发的特异性发光反应，包括电化学和化学发光两个部分。
分析中应用的标记物为电化学发光的底物三联吡啶钌或其衍生N-羟基琥珀酰胺（NHS）酯，可通过化学反应与抗体或不同化学结构抗原分子结合，制成标记的抗体或抗原。
化学发光免疫分析技术
• 化学发光免疫分析仪是通过检测患者血清内待测物质从而 对人体进行免疫分析的医学检验仪器。将定量的患者血清 和辣根过氧化物（HRP）加入到固相包被有抗体的白色不 透明微孔板中，血清中的待测分子与辣根过氧化物酶的结 合物和固相载体上的抗体特异性结合。分离洗涤未反应的 游离成分。然后，加入鲁米诺Luminol发光底液 ，利用化 学反应释放的自由能激发中间体，从基态回到激发态，能 量以光子的形式释放。此时，将微孔板置入分析仪内，通 过仪器内部的三维传动系统，依次由光子计数器读出各孔 的光子数。样品中的待测分子浓度根据标准品建立的数学 模型进行定量分析。最后，打印数据报告，以辅助临床诊 断。
血清FT3和FT4降低： ⑴甲减病人两者皆下降，但轻型甲减、甲减初期多 以FT4下降为主；⑵低T3综合征仅有FT3下降； ⑶某些药物，如苯妥英 钠、多巴胺、糖皮质激素也可使FT3和FT4降低。
• T3、T4均升高：高TBG血症、甲亢、甲状腺激素不敏感综合征。
化学发光免疫分析
一、化学发光免疫技术的概念 二、化学发光免疫分析基本原理 三、化学发光免疫分析的类型 四、临床应用 五、发展与展望
一、化学发光免疫技术的概念
化学发光免疫技术：化学发光分析是根据化学反应统与免疫反应相结合，用化学发光相关的物质标记抗体或抗原，与 待测的抗原或抗体反应后，经过分离游离态的化学发光标记物，加入 化学发光系统的其它相关物产生化学发光，进行抗原或抗体的定量或 定性检测。
磁微粒模式图
特点 – 抗原和抗体结合与未结合 部分的易分离
Y
3.2、化学发光酶免疫分析
化学发光酶免疫分析（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是用参与催化某一化学发光反应的酶 如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶(ALP)来标记抗原或抗 体，在与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固 相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物 (发光剂)，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光 电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至 计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。
化学发光标记免疫分析法
不同IgG浓度下CRET免疫传感器的荧光光谱。IgG浓度分别为：0 (a), 0.5 (b), 1 (c),1.5 (d), 2 (e), 2.5 (f), 3 (g), 3.5 (h), 及4 nM (i)。插入的曲线为荧 光强度比率（R=I425/I525）随浓度变化曲线
01 吖啶酯 Add your texts here
02 三联吡啶钌
03 鲁米诺及其衍生物 04 AMPPD
化学发光剂
吖啶酯:在碱性条件下被H2O2氧化时,发出波长为470nm 的光，具有很高的发光效率，其激发态产物N-甲基吖啶酮 是该发光反应体系的发光体。
化学发光剂
三联吡啶钌: [RU(bpy)3]2+是电化学发光剂，它和电子供 体三丙胺（TPA）在阳电极表面可同时失去一个电子而发生 氧化反应。
化学发光剂
电化学发光剂反应原理
化学发光剂
鲁米诺:化学名称为3-氨基邻苯二甲酰肼 鲁米诺发光原理
化学发光剂
AMPPD:化学名称为 3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧 酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐
AMPPD发光原理
标记技术
发光物标记 酶标记 元素标记
标记技术：将
化学发光剂的 分子与某些分 子结合，直接 或间接地测定 待测组分。通 过分析被标记 物来完成对待 测组分的测定
人体免疫球蛋白A检测
化学发光夹心法检测lgA装置：多毛细管玻璃板的微孔示意图
化学发光免疫分析检测IgA过程
化学发光强度和lgA浓度的关系
人体免疫球蛋白A检测 集束板与96孔板检测lgA的比较
冲洗后
（2） 加入碱 （pH>10）
发光
免疫发光试剂作用原理
免疫发光试剂作用原理
免疫发光试剂是一种用于检测生物分子（例如抗体、抗原、核酸等）的试剂，利用免疫学和光学技术的结合来实现高灵敏度的检测。
其作用原理涉及到荧光发光的产生和检测，通常基于化学发光的原理，而非荧光染料。
以下是一般免疫发光试剂的作用原理：
1.标记物：在免疫发光试剂中，常用的标记物是荧光标记的抗体或抗原。
这些标记物通过特异性的抗原-抗体反应与待测生物分子结合。
2.激发和发光：荧光标记的抗体或抗原与待测物结合后，形成免疫复合物。
该免疫复合物被引入检测系统中，其中含有激发发光的化学物质（例如过氧化物化合物或者酶）。
在检测系统中，化学物质受激发后产生活性物质，这个活性物质激发荧光标记，使其发光。
3.发光检测：产生的荧光通过光学系统进行检测。
光学系统包括光源、滤光片和光电二极管等部分。
通过测量产生的荧光强度，可以确定样品中所含有的目标生物分子的量。
4.信号检测和数据分析：通过检测发光信号的强度，可以定量或定性地分析样品中的目标物质。
这个信号可以与标准曲线或控制样品进行比较，以得出样品中目标物质的浓度。
免疫发光试剂在生物医学研究、临床诊断和生物化学实验中得到了广泛应用，其主要优势包括高灵敏度、广泛的动态范围、低检测限和可自动化程度高等特点。
这使得免疫发光技术成为许多生物学和医学实验的首选方法之一。
化学发光免疫标记分析技术(基本原理)
吖啶酯化学发光系统-CH3-HOO-C=0-OH-光子+C02+-R
碱性磷酸酶化学发光系统-金钢烷（发光底物）及其衍生物的增敏化学发光系统-OCH3-AP-0P032-碱性磷 酶及其衍生物的化-·光子477nm
化学发光的检测类型-化学发光按化学反应类型分为：-◆直接化学发光（非酶促化学发光-吖啶酯系统-●-异鲁米诺 统-◆间接化学发光（酶促化学发光-·辣根过氧化物酶一鲁米诺系统（HRP系统-碱性磷酸酶一金刚烷系统AP系统 其它-电化学发光
板式化学发光-,适合流行病调查、疾病预防与控制、-体检中心，以及医院血站等大样本检-测项目的使用（比如HI 、TP、HCV和-乙肝两对半等。-通常采用96孔白色不透明微孔板进行包-被，不方便随到随测和医院急诊；-对 定量检测需要做标准曲线。-◆-国内厂家主要是板式化学发光系统
管式化学发光-采用管式或微粒子发光，测定快速、准确；-可以随到随测，适用于医院急诊；-定量检测的标准曲线存 在试剂条形码中，-可在2-4周内直接使用。-国外厂家全部是管式化学发光系统
间接化学发光-以碱性磷酸酶系统为例-洗涤清除团-间接化学发光：用参与发-◆》回+-光反应的酶来标记抗原或体，免疫反应后，加入-抗体包被-的磁珠-标记抗体-双抗体夹心复合物-发光底物，测定发光体系-的发光强度来进 抗原或-◆可茶-抗体的检测。-AMPPD-AMPD发光-两大反应体系：-辣根过氧化物酶-HRP系统：氧化还 反应，稳定性差-·源德、科美、安图-碱性磷酸酶（AP系统：水解反应，灵敏度较高-●-贝克曼：Access1 Access2,DXI600、DXI800-西门子：mmulite:1000,Immulite2000-达 生物：AULIN200
免疫学检测-◆-免疫学检测是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、-抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验手 及分子-生物学技术在免疫学研究中的应用。它包括：-抗原抗体的检测技术-免疫细胞的检测-细胞因子的检测-免疫 关基因分析-免疫标记技术-免疫PCRIM-PCR技术-杂交瘤技术与T细胞克隆技术
五大化学发光标记材料原理详解及检测应用
化学发光及生物发光的原理及其应用第一部分概述化学发光 (ChemiLuminescence ，简称为 CL) 分析法是分子发光光谱分析法中的一类，它主要是依据化学检测体系中待测物浓度与体系的化学发光强度在一定条件下呈线性定量关系的原理，利用仪器对体系化学发光强度的检测，而确定待测物含量的一种痕量分析方法。
化学发光与其它发光分析的本质区别是体系产生发光 ( 光辐射 ) 所吸收的能量来源不同。
体系产生化学发光，必须具有一个产生可检信号的光辐射反应和一个可一次提供导致发光现象足够能量的单独反应步骤的化学反应。
化学发光体系用化学式表示为：依据供能反应的特点，可将化学发光分析法分为： 1 ）普通化学发光分析法 ( 供能反应为一般化学反应 ) ； 2 ）生物化学发光分析法 ( 供能反应为生物化学反应；简称 BCL) ； 3 ）电致化学发光分析法 ( 供能反应为电化学反应，简称ECL) 等。
根据测定方法该法又可分为：1 ）直接测定 CL 分析法；2 ）偶合反应 CL 分析法 ( 通过反应的偶合，测定体系中某一组份；3) 时间分辨 CL 分析法 ( 即利用多组份对同一化学发光反应影响的时间差实现多组份测定 ) ；4 ）固相、气相、掖相 CL 。
分析法；5 ）酵联免疫 CL 分析法等。
化学发光的系统一般可以表示为：在整个的检测系统中其关键的部分为 PMT ，其直接影响到仪器的检测性能，其最高检测极限为 10 － 22 mol/L 。
不同型号的仪器其检测技术不一样，但基本原理都是利用待测组份与体系的化学发光强度呈线性定量关系，而化学发光强度随体系反应进行的速度增强或衰弱。
记录仪记录峰形，以峰高定量，也可以峰面积定量。
因化学发光多为闪烁式发光 (1—2s 左右 ) ，故进样与记录时差短，分析速度快。
第二部分、化学发光常用的化学试剂及其原理化学发光是某种物质分子吸收化学能而产生的光辐射。
任何一个化学发光反应都包括两个关键步骤，即化学激发和发光。
五大化学发光标记材料原理详解及检测应用
五大化学发光标记材料原理详解及检测应用发光标记技术是一种重要的生物化学分析方法，广泛应用于生物学、医学、环境科学等领域。
化学发光标记材料是发光标记技术的核心组成部分，它能够通过化学反应产生发光信号，实现目标物的高灵敏度、高选择性检测。
本文将详细介绍五大化学发光标记材料的原理及应用。
1.化学发光酶标记材料化学发光酶标记材料是一种常用的发光标记材料，其原理是利用酶催化底物的氧化还原反应产生激发态的中间体，进而释放出光子能量。
常用的化学发光酶包括辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）等。
这些酶标记物具有高灵敏度、高选择性、稳定性好等特点，广泛应用于免疫分析、分子生物学等领域。
2.化学发光荧光素标记材料化学发光荧光素标记材料是另一种常见的发光标记材料，其原理是利用荧光素催化底物的化学反应产生发光。
常用的化学发光荧光素包括二甲基二氯化苯醚（DAB）、萤光素（luciferin）等。
这些荧光素标记物具有较高的灵敏度、稳定性强、信号倍增等特点，广泛应用于细胞成像、荧光定量PCR等领域。
3.量子点标记材料量子点是一种具有独特光学和电学性质的纳米结构材料，其原理是在半导体材料中，电子在受到能量激发后，跃迁到能带的价带，产生发光。
量子点标记物具有窄的发射光谱、较长的寿命、高荧光稳定性等特点，可以实现多种目标物的多通道检测，广泛应用于生物分析、单细胞分析等领域。
4.金纳米棒标记材料金纳米棒是一种形状特殊的金纳米颗粒，其原理是金纳米棒除了具有金颗粒的性质外，还具有长轴吸收特征峰，可以实现近红外（NIR）光激发产生短波长光的发射。
金纳米棒标记物具有较高的灵敏度、较长的寿命等特点，广泛应用于组织成像、生物芯片等领域。
5.荧光共振能量转移（FRET）标记材料荧光共振能量转移是一种特殊的能量转移过程，其原理是通过荧光捕捉体与能量给体之间的非辐射能量转移，实现荧光信号的转换。
常用的FRET标记物包括生物素-亲合素、DNA探针等。
化学发光免疫分析的类型-临床医学检验考试
化学发光免疫分析的类型-临床医学检验考试化学发光反应参与的免疫测定分为以下几种类型：（一）化学发光酶免疫测定化学发光酶免疫测定（CLEIA）是采用化学发光剂作为酶反应底物的酶标记免疫测定。
经过酶和发光两级放大，具有很高的灵敏度。
以过氧化物酶为标记酶、以鲁米诺为发光底物、并加入发光增强剂以提高敏感度和发光稳定性。
应用的标记酶也可以为碱性磷酸酶，发光底物为dioxetane磷酸酯，固相载体为磁性微粒。
（二）化学发光免疫测定化学发光免疫测定（CLIA），是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的一类免疫测定方法。
吖啶酯是较为理想的发光底物，在碱性环境中即可被过氧化氢氧化而发光。
用作标记的化学发光剂应符合以下几个条件：1.能参与化学发光反应医学`教育网搜集整理。
2.与抗原或抗体偶联后能形成稳定的结合物试剂。
3.偶联后仍保留高的量子效应和反应动力。
4.应不改变或极少改变被标记物的理化特性，特别是免疫活性。
鲁米诺类和吖啶酯类发光剂等均是常用的标记发光剂。
（三）微粒子化学发光免疫分析该免疫分析技术有两种方法：一是小分子抗原物质的测定采用竞争法；医学|教育网搜集整理二是大分子的抗原物质测定采用双抗体夹心法。
该仪器所用固相磁粉颗粒极微小，其直径仅1.0μm，这样大大增加了包被表面积，增加抗原或抗体的吸附量，使反应速度加快，也使清洗和分离更简便。
其反应基本过程：（1）竞争反应：用过量包被磁颗粒的抗体，与待测的抗原和定量的标记吖啶酯抗原同时加入反应杯温育，其免疫反应的结合形式有两种，一是标记抗原与抗体结合成复合物；二是测定抗原与抗体的结合形式。
（2）双抗体夹心法：标记抗体与被测抗原同时与包被抗体结合成一种反应形式，即包被抗体-测定抗原-发光抗体的复合物。
（四）电化学发光免疫测定电化学发光免疫测定（ECLI）是一种在电极表面由电化学引发的特异性发光反应，包括电化学和化学发光两个部分。
分析中应用的标记物为电化学发光的底物三联吡啶钌或其衍生N-羟基琥珀酰胺（NHS）酯，可通过化学反应与抗体或不同化学结构抗原分子结合，制成标记的抗体或抗原。
化学发光标记
化学发光标记化学发光标记技术按照标记反应的过程和形成结合物的结构特点，可分为直接偶联和间接偶联两种方式。
直接偶联是指通过偶联反应使标记物分子中的反应基团直接连接在被标记物分子的反应基团上。
间接偶联的特点是在标记物与被标记物之间插入一条链或一个基团，使两种物质通过引进的“桥”连接成结合物。
通过插入“桥”可以在原有的结构中引进新的活性基团、增加反应活性，还可以减弱参与偶联双方存在的空间阻碍效应。
小分子物质结合物主要通过偶联反应制备；大分子物质结合物主要交联剂使标记物与被标记物结构中的游离的氨基、羧基、咪唑基、酚基、羟基等形成不可逆连接。
常用的标记技术有以下几种：1.碳二亚胺缩合法水溶性碳二亚胺成功的用于制备大分子-大分子或大分子-半抗原衍生物的交联结合物。
经过碳二亚胺缩合反应，蛋白质分子中的游离竣基能与发光剂分子中的氨基形成较为稳定的酞胺键。
反应条件比较温和，应用范围广。
结构中含有羧基或氨基的标记物均可选用此方法进行标记。
可供使用的缩合剂有：二环己基碳二亚胺（DCC）、1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）-碳二亚胺-HCI（EDC）等。
2.重氮盐偶联法此法也称为“重氮化法”是在酸性和低温条件下，用亚硝酸盐将发光剂的伯氨基重氮化得到重氮盐。
再与蛋白质作用生成发光剂-蛋白质结合物。
蛋白质分子能偶合重氮盐的位置有酪氨酸残基上酚羟基邻位，组氨酸残基的咪哇环、色氨酸残基的吲哚环等。
重氮化反应用于标记发光剂具有简便易行、成本低、重复性好等优点。
但因反应是建立在NO2-与-NH2作用的原理上，若标记物结构中无伯氨基则不易选用此方法。
同时因脂肪族伯氨基与NO2-的反应产物不稳定，易分解。
所以，像ABEI、AHEI等伯氨基位于侧链的发光剂也不能选用此法进行直接标记。
这使重氮化法的应用受到一定的限制。
3.混合酸酐法在三乙胺或正三丁胺存在下，结构中带有羧基的分子与氯甲酸酯反应生成活性混合酸酐中间体。
混合酸酐可以与另一个分子的氨基反应，形成由酰胺键连接的共价化合物。
化学发光免疫分析中的标记物质及类型
化学发光免疫分析中的标记物质及类型
化学发光免疫分析所使用的标记物可分为三类：
1.发光免疫分析反应中直接参与发光反应的标记物；
2.以催化作用或能量传递参与发光反应的酶标记物；
3.以能量传递参与氧化反应的非酶标记物。
（一）直接参与发光反应的标记物
这类标记物在化学结构上有产生发光的特殊基团，在发光免疫分析过程中直接参与发光反应，并没有本底发光。
最常用的标记物主要有吖啶酯类化合物。
吖啶酯类化合物发光是典型的瞬间发光，其化学发光分析时间很短，在加入氧化剂和pH纠正液后，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光，在1秒内光子散射达到高峰，整个过程在2秒内完成。
（二）以催化反应或能量传递参与发光的酶标记物
在这类发光反应中，采用某些酶作为标记物。
这类标记物作为发光反应的催化剂或作为一种能量传递过程中的受体，其本身直接参与发光反应。
主要有两种酶：
1.辣根过氧化物酶（HRP）
2.碱性磷酸酶（ALP）
（三）以能量传递参与氧化反应的非酶标记物
这类标记物作为化学发光反应的催化剂或能量传递过程中的中间体（或受体），不直接参与化学发光反应。
最常用的有三联吡啶钌标记物。
化学发光免疫标记分析技术
化学发光免疫标记分析技术化学发光免疫标记分析技术（Chemiluminescent immunoassay，CLA）是一种利用免疫标记物的化学发光进行生物分析的技术。
它结合了免疫学和化学发光技术的优势，广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物研发等领域。
化学发光免疫标记分析技术的原理是通过特异性抗体与待检测物（抗原、抗体等）结合，形成免疫复合物。
免疫复合物经过一系列处理步骤后，与化学发光底物反应产生化学发光信号。
这种化学发光信号可以被光学仪器检测到，并与待测物的浓度呈正相关。
1.高灵敏度：化学发光信号的强度与待测物的浓度呈正相关，灵敏度高于传统免疫学方法，可检测到非常低浓度的目标物。
2.宽线性范围：化学发光信号的强度与浓度之间具有良好的线性关系，可以在较宽的浓度范围内准确测量物质的浓度。
3.专属性强：化学发光免疫标记分析技术基于特异性抗体-抗原反应，对目标物具有高度的特异性和选择性，可以准确识别和测定目标物。
4.快速便捷：化学发光免疫标记分析技术操作简单，试验时间短，不需要复杂的操作步骤，适用于高通量分析。
5.高复现性：化学发光免疫标记分析技术具有较好的重复性和稳定性，结果可靠且一致。
1.基质干扰：复杂样品基质的存在可能影响化学发光信号的产生和检测，导致假阳性或假阴性结果。
2.试剂成本高：化学发光免疫标记分析技术中使用的免疫标记物和化学发光底物成本较高，对于大规模应用有一定的限制。
3.数据分析复杂：光学仪器读取的化学发光信号需要经过复杂的数据分析和处理，需要专业知识和经验。
总结起来，化学发光免疫标记分析技术是一种高灵敏度、高特异性的生物分析技术，具有许多优点，并且在临床诊断和药物研发等领域有广泛应用。
随着技术的进一步发展和改进，相信化学发光免疫标记分析技术将会在更多领域展现出更大的潜力。
化学发光免疫分析法的操作指南
化学发光免疫分析法的操作指南在现代医学和生物科学研究中，化学发光免疫分析法（Chemiluminescence Immunoassay，简称CLIA）被广泛应用于检测、诊断以及药物研发等领域。
本文将为读者提供一份关于CLIA操作的指南，旨在帮助其更好地掌握该实验技术。
I. 基本原理CLIA是一种利用特定抗原与抗体结合的免疫反应来检测和定量分析物质的方法。
其基本原理是，通过特定抗体与待测物结合，在化学发光剂的作用下，产生可见的光信号，从而实现对分析物的检测。
II. 常用试剂的准备在进行CLIA实验前，准备好以下常用试剂是非常重要的。
1. 化学发光底物：通常是由低转化率的底物与催化剂混合而成。
根据不同的实验要求，可选择不同的化学发光底物。
2. 抗体或抗原：抗体与抗原应根据待测物的特性进行选择。
记得进行适当的稀释以保证实验的准确性。
3. 辅助试剂：包括洗涤缓冲液、稳定液等。
洗涤缓冲液用于洗涤试剂盒中的固相、去除非特异性反应；稳定液用于稳定试剂的保存时间。
4. 加标物：用于制作标准曲线、样品稀释等操作。
5. 底物溶剂：溶解底物粉末的溶剂。
III. 实验步骤1. 样品处理：根据实验要求，对待测样品进行适当的稀释和预处理。
例如，对血液样本进行离心，收集上清液作为待测样品。
2. 准备标准曲线：使用加标物制备一系列浓度梯度的标准溶液。
将不同浓度的标准溶液分别加入试管中，每个浓度至少复制3个。
3. 加入试剂：按照实验要求，将试剂依次加入样品和标准曲线中。
注意控制每个试剂的加入量和反应时间。
4. 反应和发光：将试管中的反应液在恒温恒湿箱中进行反应，反应完毕后，将试管放入化学发光仪中测量光信号。
根据实验仪器的要求操作，记录光信号数值。
5. 数据处理与结果分析：根据标准曲线和样品的光信号数值，计算出待测物的浓度。
IV. 实验注意事项1. 严格按照实验步骤操作，保持实验操作的准确性和一致性。
2. 注意试剂的保存条件，避免受潮和高温。
发光免疫分析仪
仪器的核心部分， 是指挥控制中心。 其功能有程控操 作、自动监测、 指示判断、数据 处理、故障诊断 等，并配有光盘。
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三、发光免疫分析的基本结构
传送舱
全自
动微
粒子
电子
主探针
化学
系统
微电脑
系统
发光 免疫
控制
分析
仪
流体
分析
系统
系统
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三、发光免疫分析的基本结构
全自动电化学发 光免疫分析仪
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五、操作与维护及常见故障处理
开机
打开供水系统和操作电源，开启启动程序， 输入操作者ID，进入软件，启动系统操作
全 自
工作前准备
设置仪器参数，装载各种耗材，运行校准程 序，再运行质控和定标
动
电 化 学
样品装载
将样本装入标本架，选择标本类型，输入标 本架号、标本号以及检测项目
发 光 样本测定 免
确认启动条件后，按“Start”键，仪器会自 动对标本进行测定
75或30个标本
试剂盘
13种试剂
24种试剂
18或25种试剂
急诊标本
均可随到随做，无需中断运行
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五、仪器的使用与维护及常见故障的处理
开机
打开仪器电源，等待仪器自检，按 “STARTUP”键启动
全 自 动
参数设置
进入菜单，设定测量参数，放置检测试剂和 消耗品
化
学 发 光
样品装载
将被测样品放入样品架，输入起始样品栏的 位置和起始样品编号，选择样品的测试项目
控制单元
就是一台完整 的计算机，并 配有支架及打 印系统。
化学发光标记免疫分析法
化学发光标记免疫分析法化学发光标记免疫分析法（Chemiluminescent Immunoassay，CLIA）是一种常用于检测生物样本中特定分子的高灵敏度和高特异性的方法。
该技术利用化学发光效应，通过特异性抗体与抗原结合，进而检测出样品中的目标物质。
本文将探讨化学发光标记免疫分析法的原理、应用领域以及优点。
化学发光标记免疫分析法的原理是在化学反应中产生发光信号，该信号与目标物质的浓度成正相关。
这种发光反应一般是通过酶-底物体系进行催化反应来实现的。
常用的催化体系有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。
当特异性抗体与抗原结合时，HRP或AP被引入，与底物反应，产生可观察的发光信号。
该发光信号可以通过光子计数器或相关设备进行测量和定量，从而获得目标物质的浓度。
化学发光标记免疫分析法在许多领域中得到广泛应用。
在临床诊断中，它常用于检测生物体内的各种生物标志物，如肿瘤标志物、病毒抗原、抗体和药物浓度等。
在食品和环境安全领域，它可以用于检测食品中的农药残留、重金属和有毒物质等。
此外，化学发光标记免疫分析法还可应用于药物研发、生物学研究和环境监测等各个领域。
化学发光标记免疫分析法具有不少优点。
首先，它具有极高的灵敏度。
由于信号的产生是通过酶催化反应而非染色反应完成的，因此其灵敏度高于传统的染色法。
其次，该方法具有极高的特异性。
由于特异性抗体与抗原的结合是特异性的，因此它不会受到其他物质的干扰。
第三，化学发光标记免疫分析法的操作相对简单。
只需要将样品与标记抗体和底物反应，然后测量发光信号即可得到结果。
最后，该方法具有广泛的线性范围。
不同浓度的目标物质都可以在一定范围内进行准确测量。
尽管化学发光标记免疫分析法具有许多优点，但也存在一些局限性。
首先，该技术需要贵重的设备和试剂，因此成本较高。
此外，发光信号的持续时间较短，限制了信号的记录和测量时间。
最后，由于发光信号的产生涉及一系列的酶反应，因此在一些特殊样品（如高脂血样品）中可能会受到脂质干扰，影响结果的准确性。
常用的化学发光试剂有哪些？
化学发光免疫分析中常用化学发光试剂有哪些？化学发光免疫测定是目前发展和推广应用最快的免疫分析方法，也是目前最先进的标记免疫测定技术，灵敏度和精确度比酶免法、荧光法高几个数量级，可以完全替代放射免疫分析、彻底淘汰酶联免疫分析。
主要具有灵敏度高、特异性强、试剂价格低廉、试剂稳定且有效期长（6-18个月）、方法稳定快速、检测范围宽、操作简单自动化程度高等等优点。
用作标记的化学发光试剂应符合的条件鲁米诺类和吖啶酯类发光剂等均是较常用的标记发光剂，它们符合以下几种条件：1、能参与化学发光反应。
2、与抗原或抗体偶联后能形成稳定的结合物试剂。
3、偶联后仍保留高的量子效应和反应动力。
4、应不改变或极少改变被标记物的理化特性，特别是免疫活性。
化学发光免疫分析中所使用的标志物分类（一）直接化学发光剂直接化学发光剂指的是直接用化学发光剂标记抗原或抗体，主要有如下几种。
1、吖啶酯在碱性条件下被H2O2氧化时，发出波长为470nm的光，具有很高的发光效率，其激发态产物N-甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。
吖啶酯类发光剂可直接用于标记半抗原和蛋白质等。
用于标记抗体时，结合稳定，结合后并不减少光量子的产生，可获得较高的比活性，有利于双位点化学发光免疫分析的建立，吖啶酯是较为理想的发光底物。
2、三联吡啶钌三联吡啶钌是电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（TPA）在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。
（二）酶促反应发光剂：利用标记酶（辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）的催化作用，使发光剂（底物）发光。
1.辣根过氧化物酶催化的发光剂为鲁米诺及其衍生物；除此之外还有异鲁米诺及其衍生物都有化学发光特性，鲁米诺是最早合成的发光物质。
2、碱性磷酸酶催化的发光底物为AMPPD，AMPPD是一种新的化学发光剂，其分子结构中有两个重要部分，一个是连接苯环和金刚烷的二氧四节环，它可以断裂并发射光子；另一个是磷酸基团，它维持着整个分子结构的稳定。
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化学发光免疫分析所使用的标记物可分为三类： 1.发光免疫分析反应中直接参与发光反应的标记物； 2.以催化作用或能量传递参与发光反应的酶标记物； 3.以能量传递参与氧化反应的非酶标记物。
（一）直接参与发光反应的标记物这类标记物在化学结构上有产生发光的特殊基团，在发光免疫分析过程中直接参与发光反应，并没有本底发光。
最常用的标记物主要有吖啶酯类化合物。
吖啶酯类化合物发光是典型的瞬间发光，其化学发光分析时间很短，在加入氧化剂和pH纠正液后，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光，在1秒内光子散射达到高峰，整个过程在2秒内完成。
（二）以催化反应或能量传递参与发光的酶标记物在这类发光反应中，采用某些酶作为标记物。
这类标记物作为发光反应的催化剂或作为一种能量传递过程中的受体，其本身直接参与发光反应。
主要有两种酶： 1.辣根过氧化物酶（HRP） 2.碱性磷酸酶（ALP）（三）以能量传递参与氧化反应的非酶标记物这类标记物作为化学发光反应的催化剂或能量传递过程中的中间体（或受体），不直接参与化学发光反应。
最常用的有三联吡啶钌标记物。
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