southern杂交实验方法和步骤

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实验七Southern印迹法

实验七Southern印迹法Southern印迹法是分子生物学中常用的 DNA 转移与杂交技术。

Southern印迹法的目的是分离 DNA 片段，并根据它们的长度和数量测定第一种样品中特定 DNA 片段的存在。

该方法是以 Edward M. Southern 1975 年提出的。

Southern印迹法是一种将 DNA 片段转移到硝酸纤维素膜上的技术。

该方法的基本原理是将目标 DNA 的片段分离出来，通过凝胶电泳分离出 DNA 后，将它转移到硝酸纤维素或其他荧光杂交膜上。

转移后进行 DNA 与膜的固定和预处理，然后涂上 DNA 探针发现和显示 DNA 片段的方法。

这些探针经常是标记的核酸分子，它们与目标 DNA 片段杂合并可以通过荧光或放射性探测器进行检测。

1. DNA 片段的制备从需要研究的DNA中，通过限制酶切或PCR扩增等方法，将所需 DNA 片段制备出来。

2. 电泳用琼脂糖电泳分离DNA片段，根据分子大小排列。

3. 转移将分离出的 DNA 片段转移到硝酸纤维素或其他荧光杂交膜上。

4. 增强和固定增强和固定DNA与膜之间的结合力，以便进行杂交。

5. 杂交将贴有 DNA 片段的膜和DNA探针，一起置于一定的条件下进行杂交，以检测特定的DNA 片段是否存在。

6. 洗涤和显影通过洗涤和显影等操作，观察到探针与 DNA 片段的杂交情况，以得到所需的信息。

Southern印迹法在生物学领域中的应用广泛。

它被广泛用于研究 DNA 片段，如发现基因缺失、揭示癌症的起源等方面的研究。

此外，它还可以用于检测利用基因工程技术制造的 DNA 片段与细胞内的核酸结合情况。

总之，Southern印迹法是一种常用的 DNA 分析方法，它可以用于很多领域，比如基因工程、细胞生物学、药物研究和疾病诊断等。

该方法分离DNA 片段的能力和灵敏度高，可以对 DNA 片段进行量化，是分子生物学中不可或缺的重要技术手段。

Southern杂交实验

Southern 杂交实验Southern 杂交的原理是将待检测的DNA分子用限制性内切酶消化，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按照其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其他标记物标记的DNA探针进行反应。

如果待测物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补原理进行结合，游离的探针洗涤后用显影或其他合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。

一、溶液配制(1)20 X SSC(1000 mL) :组分浓度 3.0M的Nacl，0.3M的柠檬酸钠NaCl 175.32g柠檬酸钠88.26gNaOH调PH值到7.0，高温高压灭(2)洗涤缓冲液Washing buffer 200ml组分浓度：0.1M Maleic acid, 0.15M Nacl; pH 7.5(20℃); 0.3%(v/v) Tween20.Maleic acid：2.32gNacl： 1.75gTween20 0.6mlNaOH固体约1.7g调Ph值7.5(3)马来酸缓冲液Maleic acid buffer 200ml组分浓度：0.1M Maleic acid, 0.15M Nacl; pH 7.5 (20ºC)Maleic acid：2.32gNacl： 1.75gTween20 0.6mlNaOH固体约1.7g调Ph值7.5(4)检测缓冲液Detection buffer 100ml组分浓度：0.1M Tris-HCl, 0.1M Nacl, pH 9.5(20ºC)Tris 1.21g,NaCl 0.584gMgCl2 1.01g调ph值到9.5(5)变性溶液(500 mL)： 1 mol／L NaCl (43.83 g)， 0.5 mol／L NaOH (10 g)，(6)中和溶液(500 mL)：0.5 mol / L Tris (30.27 g)，3 mol／L NaCl (87.66 g)，用1 mol／L HCl调(7)5 × TBE (250 mL)：13.5g Tris 6.9g硼酸, 0.9 g EDTA-Na2，定容250 mL(8)6 ×溴酚蓝载样液：0.25 ％溴酚蓝，40 ％蔗糖(9)4 mol／L EDTA 100 mL(10)1M Tris-HCl (pH 8.0): 称取12,。

southern杂交

Southern杂交概述Southern杂交是一种常用于分析DNA序列和判定基因组结构的实验技术。

该技术由英国分子生物学家爱德华·南方于1975年首次提出，并以他的名字命名。

Southern杂交操作简单，适用于各种生物材料，被广泛应用于基因组学和分子生物学研究领域。

原理Southern杂交的原理基于亲和性结合和DNA互补碱基配对的特性。

该技术通过将待检测的DNA样品与一段标记的DNA探针进行杂交，通过探针与待检测样品DNA的配对形成稳定的双链DNA形式。

随后，通过探针上的标记进行检测，从而确定目标DNA序列的存在与否。

步骤Southern杂交主要包括以下几个步骤：1.DNA提取：从样本中提取待检测的DNA。

2.DNA消解：将DNA样本通过限制性内切酶消解为较小的DNA片段。

3.凝胶电泳：将消解后的DNA片段在琼脂糖凝胶上进行电泳分离，根据DNA片段的大小形成DNA条带。

4.DNA定位：将凝胶中的DNA片段转移到薄膜或膜纸上。

5.杂交处理：将转移到膜上的DNA片段与一段标记的DNA探针进行杂交，探针可以是放射性同位素标记的DNA或荧光标记的DNA等。

6.杂交条件优化：调整温度、盐浓度和杂交时间等条件，以提高杂交效率和特异性。

7.杂交探测：通过探针上的标记进行检测，如放射性同位素检测或荧光检测。

8.数据分析：根据杂交的结果，确定目标DNA序列的存在与否。

应用Southern杂交技术在许多生物学研究中得到广泛应用，主要包括以下几个方面：1.基因型分析：可以通过Southern杂交技术确定目标基因的存在、拷贝数和序列变异等信息。

2.基因组结构研究：可以通过Southern杂交技术确定目标基因组的结构和大小。

3.DNA重组检测：可以通过Southern杂交技术检测DNA重组事件的发生和定位。

4.DNA甲基化分析：可以通过Southern杂交技术研究DNA甲基化修饰的分布和变化。

5.遗传疾病诊断：可以通过Southern杂交技术检测遗传疾病相关基因的缺失、重复或突变等。

Southern杂交分析原理和操作

Southern杂交分析原理和操作【原理】Southern杂交是分子生物学的经典实验方法。

其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上,与标记的核酸探针进行杂交,在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。

通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。

一．基因组DNA的限制酶切【操作】DNA (1μg/ml)20μg、10×酶切buffer5.0μl、限制性内切酶(lOU /μl) 5.0μl、加ddH2O至50μl,在最适温度下消化1～3h。

消化结束时可取5μl电泳检测消化效果。

如果消化效果不好,可以延长消化时间,但超过6h己没有必要。

或者放大反应体积,或者补充酶再消化。

如仍不能奏效,可能的原因是DNA样品中有太多的杂质,或酶的活力下降。

消化后的DNA 加入1/10体积的0.5mol/L EDTA,以终止消化。

然后用等体积酚抽提、等体积氯仿抽提,2.5倍体积乙醇沉淀,少量TE溶解(参见DNA提取方法,但离心转速要提高到12000g,以防止小片段DNA的丢失)。

如果需要两种酶消化DNA,而两种酶的反应条件可以一致,则两种酶可同时进行消化；如果反应条件不一致,则先用需要低离子强度的酶消化,然后补加盐类等物质调高反应体系的离子强度,再加第二种酶进行消化。

二．基因组DNA消化产物的琼脂糖凝胶电泳【操作】1.制备0.8%凝胶一般用于Southern杂交的电泳胶取0.8%。

2. 电泳电泳样品中加人6×Loading缓冲液,混匀后上样,留一或两泳道加DNAMarker。

1～2V/cm,DNA从负极泳向正极。

电泳至溴酚蓝指示剂接近凝胶另一端时,停止电泳。

取出凝胶,紫外灯下观察电泳效果。

在胶的一边放置一把刻度尺,拍摄照片。

正常电泳图谱呈现一连续的涂抹带,照片摄人刻度尺是为了以后判断信号带的位置,以确定被杂交的DNA长度。

三．DNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持物【操作】1.碱变性室温下将凝胶浸入数倍体积的变性液中30min。

Southern 杂交试验方案—本实验室

Southern 杂交试验方案一、探针标记1、探针标记严格按照罗氏试剂盒说明书进行；2、标记探针检测：取标记产物和普通PCR扩增产物各1μl，1.0%的琼脂糖凝胶电泳。

由于大分子量的DIG掺入，标记产物泳动速度比普通PCR产物要慢。

所以根据电泳图就可以判断是否标记上和有没有非特异标记！其余标记产物-20℃保存。

如果要准确检测标记效率（一般不必），取标记产物1μl和Dig标记的对照DNA，用DNA 稀释液按10倍系列稀释后点样于带正电荷尼龙膜上。

用紫外交联仪或真空烘烤固定DNA探针，按杂交检测方法进行信号检测，然后与膜条上的Dig标记的对照DNA信号强度对比，推算出标记的探针浓度。

如初始模板量较大，可取1μl标记产物稀释10~100倍后定量。

二、基因组DNA酶切1、采用EcoRI和一对甲基化敏感同裂酶HPaIl、MspI消化高粱基因组DNA 5ug，3 Unit/ug DNA，50uL反应体系，在37℃条件下酶切消化10h。

2、酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳（电压小于1v/cm，12h）分离。

凝胶在0.2mol/L的HCl 中脱嘌呤处理，至溴酚蓝变为黄色，弃去HCl后用蒸馏水洗几次，然后以0.4mol/L的NaOH 为转移液，利用毛细管作用将DNA转移到Hybond N+尼龙膜上，转移过夜后将膜取出夹放于滤纸间，80℃烘烤2小时。

常温放于干燥处保存备用。

（转膜：1、将胶裁成9.8cm×8.0cm 大小，于平皿中用蒸馏水冲洗一次；（此步一定记好胶的大小，后面裁纸/膜以及杂交液体积的选择都要用到）2、加入100ml 0.25 mol/L 的盐酸脱嘌呤，室温振荡15~30 min，至溴酚蓝完全变成黄色。

（如果限制性片段＞10kb，酸处理时间可适当延长；若限制性片段很小，此步可省略）3、用蒸馏水冲洗2 次。

加入变性液（1.5mol/L NaCl、0.5mol/L NaOH）室温振荡20~30min；至溴酚蓝完全恢复到原来的蓝色。

生物化学实验southwestern blotting实验步骤 -回复

生物化学实验southwestern blotting实验步骤-回复生物化学实验：southwestern blotting实验步骤南方杂交（southwestern blotting）是一种用于检测DNA结合蛋白的实验技术。

在这项实验中，我们可以确定哪些蛋白与DNA结合，进而揭示它们在基因调控和细胞功能方面的作用。

下面将详细介绍southwestern blotting实验的步骤。

步骤一：制备RNA和DNA探针在进行southernwestern blotting实验之前，首先需要制备两个探针：一个用于检测特定DNA序列的DNA探针，另一个用于检测DNA结合蛋白的RNA探针。

DNA探针可以通过PCR扩增特定的DNA片段，然后用荧光标记的核苷酸或放射性同位素标记的核苷酸标记。

RNA探针则需要用逆转录酶将RNA反转录成cDNA，然后用荧光标记的核苷酸或放射性同位素标记的核苷酸标记。

步骤二：制备细胞核提取物1. 收集细胞：收集含有目标蛋白的细胞样品。

可以根据需要使用贴壁培养的细胞或悬浮培养的细胞。

2. 细胞裂解：将细胞悬液离心后，将细胞沉淀洗涤一次，然后用细胞裂解液裂解。

细胞裂解液可以根据实验要求自制，也可以购买商业提供的细胞裂解液。

3. 离心：将细胞裂解液离心，将上清转移至新离心管中。

4. 蛋白浓度检测：使用BCA或其他蛋白浓度检测试剂盒对离心上清中的蛋白质进行定量。

步骤三：SDS-PAGE凝胶电泳分离1. 准备SDS-PAGE凝胶：根据需要制备聚丙烯酰胺凝胶。

根据样品量的不同，选择不同的均聚丙烯酰胺百分比凝胶。

2. 添加样品和分子量标记物：向凝胶槽中加载约10-50微克的蛋白样品，并加入适当的分子量标记物。

3. 开始电泳：将凝胶槽放入电泳槽中，并加入足够的电泳缓冲液。

启动电泳仪，并根据需要调整电压和电流。

4. 疏水处理：电泳结束后，将凝胶浸入缓冲液中，使凝胶疏水。

步骤四：转移蛋白到NC膜1. 混合转移缓冲液：根据实验需要制备转移缓冲液。

Southern印迹杂交及其他相关印迹技术简介

Southern印迹杂交及其他相关印迹技术简介姜永均 (江苏省如东高级中学 226400)摘要 Southern印迹杂交(Southern b l ot)是分子生物学领域中最常用的技术方法之一,该技术是1975年英国爱丁堡大学的E. M.Sou t h ern首创的,Sou t h ern印迹杂交故因此而得名。

后来相继出现了三个原理、过程相似,但是操作对象不同的印迹方法,缘于学界前辈的幽默分别将其称为N ort h ern b l ot、W estern blot和Eastern b l ot,这些技术的命名与发明人姓氏并没有关系。

本文简要介绍了Sou t hern印迹杂交及其相关生物技术。

关键词 Sou t hern印迹杂交 Northern印迹杂交 W estern印迹杂交 Eastern印迹杂交在近年的一些省、市中学生生物奥赛试卷中常涉及到Southern印迹、N outhern印迹、W este m印迹等分子生物学技术。

本文将Sout hern印迹杂交及其相关生物技术作一个简单介绍。

Souther n印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法,是研究DNA图谱的基本技术,在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。

Souther n印迹杂交技术1975年由英国人埃德温迈勒萨瑟恩(Ed w i n M ellor Southern)创建。

1977年詹姆斯艾尔文(Ja mes A l w ine)等把此方法应用到RNA的研究方面,称作Northern印迹法。

1979年乔治斯塔克(G eor ge Stark)等则把该方法扩展应用到单向电泳后的蛋白质分子的分析方面,被称作W estern印迹法。

1982年Re i nhart报道双向电泳后蛋白质分子的印迹分析,称之为Eastern印迹法。

目前,有人把Sou hern、Nort hern、W esther印迹法分别称作DNA印迹法、RNA印迹法和蛋白质印迹法。

southern_杂交实验流程

SOUTHERN BLOTTING实验操作流程A.小麦基因组DNA的提取1)采集5g鲜嫩的小麦幼苗，将其剪成2cm左右的片段，用液氮冷冻后在研钵中将其研成粉末（研磨15min左右）。

2)将研磨好的样品转移到预冷的50ml离心管中，加入20ml预热的S buffer，颠倒混匀。

S Buffer成分100mM Tris.Cl pH8.5100mM NaCl50mM EDTA pH8.02％ SDS3)于65℃水浴锅中温育1-2h，并不时轻柔混匀。

4)加入20ml（等体积的）酚/氯仿，轻柔地颠倒混匀，直至呈乳状（注意：保证混匀。

为有效除去蛋白，此步可以重复）。

5)用水平转子离心机以2000rpm的转速离心20-30min。

6)加入等体积的氯仿，轻柔地颠倒混匀，2000rpm离心20min。

7)转移上清到1个灭菌的50ml离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置一段时间，用玻璃勾将DNA钩出。

8)用70％的乙醇清洗DNA 2-3次后，将其挑在玻璃钩上晾干，然后溶解在5ml 1×TE中。

9)待DNA完全溶解后接入10μl RNase，于37℃恒温箱中温育1h。

10)加入等体积的酚/氯仿，轻柔颠倒混匀，以2000rpm的转速离心15min。

11)转移上清至1个灭菌的离心管中，加入等体积的氯仿，混匀，以2000rpm的转速离心15min。

12)转移上清至1个灭菌的离心管中，加入1/10 体积 3M pH 5.0的乙酸钠（终浓度为0.3M），混匀后再加入2倍体积95％的乙醇，混匀。

13)用玻璃勾将DNA钩出，然后用70％的乙醇清洗2-3次，晾干后加入1.8-2ml 1×TE溶解。

14)待DNA完全溶解后，取1μL DNA电泳，检测DNA的浓度和完整性。

15)DNA样品可以放在4℃保存备用。

B.小麦基因组DNA的酶切1）通常情况下采用下列酶进行谷类作物DNA分析。

识别6碱基序列的酶识别4碱基序列的酶Apa I Hind III Bam HI Alu I Mbo I Hha ISal I Bgl I Sst I Dde I Msp I Taq IDra I Pvu II Eco RV Hae III Rsa I Hinf IEco RI Xba I2）如果一次酶切DNA的量在10μg左右，一般采用30μL反应体系。

Southern 印迹杂交实验报告

Southern 印迹杂交实验报告姓名：陆叶学号：14211020062 专业：公共卫生实验时间：12.18；12.25 带教老师：潘銮凤【实验目的】学习核酸杂交的基本过程和操作【实验原理】将待检测的DNA分子用或不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应，检测靶DNA片段中是否存在与探针同源的序列。

如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。

用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。

【实验步骤】1、基因组DNA的限制性内切酶酶切取1个1.5ml离心管按下列量依次加入基因组DNA、10X酶缓冲液，酶，做好标记。

老师给的HL60基因组DNA 10μg（7.6μL）；10×Buffer E（10.4μL）；EcoR I（10 u/μL）（2μL）。

总体积20μL。

37℃保温1.5小时。

2、1％琼脂糖电泳先制备凝胶，称取1.2 g Agarose放入三角烧瓶中，加入60 mL TAE溶液，微波炉中加热令其完全溶解，稍作冷却后加入GelRed核酸染液6μL（稀释10,000倍）。

浇板，水平放置，待凝。

胶凝后按照以下顺序加样。

两组共用一块凝胶，共7个样。

①基因组DNA10 20μl （自己的）②基因组DNA10 μg（老师的）③酶切样品④阳性对照（c-myc 4.7 kb线性片段，30pg/μl, 10μl)⑤酶切样品⑥基因组DNA10 μg （老师的）⑦基因组DNA10 20μl （自己的）插上电源，负极在样品槽一边，DNA将向阳极跑，80V电泳2小时左右，直到溴酚蓝染料跑到接近凝胶尾部，在电泳期间做好胶变性和转移准备。

sourthern印迹法

sourthern印迹法摘要：一、Southern印迹法的原理二、Southern印迹法的实验步骤三、Southern印迹法的应用领域四、Southern印迹法的优缺点五、我国在Southern印迹法的研究与发展正文：一、Southern印迹法的原理Southern印迹法（Southern blotting）是一种分子生物学技术，主要用于检测DNA分子中的特定序列。

该技术的核心原理是将DNA从凝胶转移到膜上，然后通过与标记的探针进行杂交，从而检测目标DNA序列。

二、Southern印迹法的实验步骤1.制备样品：提取生物组织中的DNA，并进行纯化和定量。

2.电泳分离：将DNA样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据分子量分离出不同的DNA片段。

3.转移：将凝胶中的DNA转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上。

4.杂交：将膜放入含有标记探针的杂交液中，让探针与目标DNA序列结合。

5.洗涤：去除未结合的探针，洗涤膜以消除非特异性信号。

6.检测：使用放射性自显影或化学发光法检测杂交信号，分析结果。

三、Southern印迹法的应用领域Southern印迹法广泛应用于基因mapping、基因突变检测、基因表达分析和病原体检测等领域。

在基因研究中，它可以确定基因的位置、大小和数量；在医学领域，可用于检测肿瘤基因、病原体基因等。

四、Southern印迹法的优缺点优点：具有较高的灵敏度和特异性，可以检测到微量的目标DNA序列。

缺点：实验操作复杂，耗时较长，对实验环境要求较高，且存在放射性污染风险。

五、我国在Southern印迹法的研究与发展我国科研人员在Southern印迹法的研究方面取得了丰硕的成果，不仅在基础研究中有广泛应用，还将其应用于农业、医学等领域。

为降低放射性污染，我国科研人员还研发了非放射性Southern印迹法，如化学发光法等。

在未来，我国将继续加大对Southern印迹法的研究力度，推动分子生物学技术的发展。

【结束语】通过本文的介绍，我们对Southern印迹法有了更深入的了解。

Southern印迹杂交

Southern印迹杂交实验原理核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的具体方法之一。

其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。

由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。

但为了进一步构建出DNA分子的遗传图，或进行目的基因序列的测定以满足基因克隆的特殊要求，还必须掌握DNA分子中基因编码区的大小和位置。

有关这类数据资料可应用Southern印迹杂交技术获得。

Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）;二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。

该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。

早期的Southern印迹是将凝胶中的DNA变性后，经毛细管的虹吸作用，转移到硝酸纤维膜上。

近年来印迹方法和固定支持滤膜都有了很大的改进，印迹方法如电转法、真空转移法；滤膜则发展了尼龙膜、化学活化膜（如APT、ABM纤维素膜）等。

利用Southern印迹法可进行克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中某一基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片断长度多态性分析（RFLP）等。

实验方法本节以哺乳动物基因组DNA为例，介绍Southern印迹杂交的基本步骤。

一、待测核酸样品的制备（一）制备待测DNA基因组DNA是从动物组织（或）细胞制备。

1. 采用适当的化学试剂裂解细胞，或者用组织匀浆器研磨破碎组织中的细胞；2. 用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白质和RNA；3. 用有机试剂（酚/氯仿）抽提方法去除蛋白质。

（二）DNA限制酶消化基因组DNA很长，需要将其切割成大小不同的片段之后才能用于杂交分析，通常用限制酶消化DNA。

southern杂交标准步骤

一、试剂的选用和配置：不同种类的尼龙膜其所采用的转移缓冲液和洗膜液不同。

本实验标准采用带正电荷的尼龙膜。

变性液/碱性转移缓冲液（应用于带正电荷尼龙膜的碱性转移）0.4mol/L NaOH1mol/L NaCl配2×母液1L。

中和缓冲溶液Ⅱ（只用于碱性转移）0.5mol/L Tris-Cl (pH 7.2)1mol/L NaCl20×SSC800ml H2O溶解175.3g NaCl和88.2g柠檬酸钠，用几滴14mol/LHCl调pH至7.0，用水定容至1L。

分装后高压灭菌，试剂终浓度为3.0mol/L NaCl和0.3mol/L柠檬酸钠。

10%(m/V) SDS配制时68℃加热助溶，浓盐酸调pH至7．2，定容室温保存。

（pH极易调过，需小心！）二、技术操作步骤：Ⅰ、DNA酶切和低压电泳：概述：酶切所需DNA的量为10μg～30μg，所需限制性内切酶量为10Unit酶/1μg DNA，neb公司的限制性内切酶的最佳酶切条件为50μl体系酶切1～2μgDNA。

为了避免型号活性，注意所加酶的甘油含量和盐分含量（glycerol concentration > 5%, or pH > 8.0 may result in star activity酶储液含50% glycerol，因而酶最大用量不能超过酶切体系的10%），同时，选择内切酶时要注意其可能因甲基化的敏感性导致基因组酶切效果不好。

1、400μl的酶切反应体系：（10～30μg）30 μg DNA 酶300 U 37℃酶切16h。

电泳检测酶切效果。

1/10体积（40μl）3mol/L 醋酸钠 2.5倍体积的冷无水乙醇（或0.6～1倍体积的遇冷异丙醇）-20℃沉淀DNA，70%乙醇洗涤沉淀，溶解于25μl 1×TE。

2、荧光定量测定浓度后，加入5μl 6×上样缓冲溶液，56℃水浴5min，迅速置于冰上2min，以破坏粘性末端可能形成的碱基对。

Southern杂交操作步骤

一基因组酶切和电泳在200 μl 微量离心管中加入：25 μl DNA样品(约10μg)，3μl 限制性内切酶（MBI，10 U/ μl）5 μl 相应的10×buffer，补水到50μl。

然后加一滴矿物油覆盖, 稍微离心后放于37℃水浴8-12小时。

酶切完后，取5μl 酶切DNA样品于0.8%的琼脂糖凝胶上检测酶是否充分。

如果酶切充分，灌制0.8%的agrose胶，加入上样buffer后，在25—30V 稳压电泳12—16hrs。

注意：在southern杂交中对，DNA的质量要求较高，否则酶切不完全导致失败。

二转膜1 用0.2MHCl 脱嘌呤处理，偶尔轻轻振荡至溴酚蓝完全变成黄色，大约需要15~30分钟。

然后用水漂洗凝胶2~3次，将水倒尽，加入碱变性液，偶尔轻轻振荡至溴酚蓝完全恢复到原来的蓝色（大约需要20~30分钟）。

注意：此方法对酶切后目标片段大于15kb时用，如果小于15kb最好不要进行脱嘌呤处理，否则容易将片段打断，导致转膜后结合不紧密。

2 取一磁盘架上一洗净玻璃板，在磁盘中倒入适量的转膜缓冲液，在玻璃板上架两层长滤纸（30cm左右）（注意不要产生气泡）搭成盐桥。

（滤纸比胶弱宽）依胶大小裁好尼龙膜，写好标记，正面向下，紧贴于胶上，防止有气泡产生，接这压两张同样大小的滤纸，不可过大以免短路，胶周围用X光片压条。

胶应反面朝上因为DNA多在胶的底层。

堆积吸水纸。

上面放一小玻板，板上加一500 g左右的重物。

注意：防止短路3 转膜16---20hrs后，将尼龙膜取下，胶染色，观察转膜效果。

将膜用2xSSC浸泡20分钟，滤纸吸干后放在烘箱中烘2hrs（80℃）。

待用。

三杂交¨杂交炉与杂交管预热至65℃¨尼龙膜用2×SSC浸泡配置杂交液ssDNA沸水变性10min，冰浴10min，置冰浴备用Components Volume (ml) NoteddH2O 20.750×Denhardts 0.6P/H stock 8.120% SDS (OR 10% SDS) 0.3 (OR 0.6)Total 30 ml for 2 blots. 65℃预热.Add prepared ssDNA （10mg/L）≥0.3 ml倒入杂交液，加入尼龙膜，65℃预杂交4~5小时（新膜）注意：赶尽膜与膜之间的气泡后把几张膜同时放入杂交管，并用玻棒赶尽膜与管壁之间的气泡，最后加入杂交液，盖好管盖。

southern印迹杂交

southern印迹杂交Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。

一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量[1][2]。

[编辑本段]基本方法及主要步骤Southern印迹杂交的基本方法包括四部分，以下以植物southern印迹杂交为例。

（1）植物基因组DNA提取；（2）DNA的限制性内切酶酶解、电泳和Southern转移；（3）探针的标记和纯化；（4）杂交、洗膜、检测以及去除膜上探针。

主要操作步骤：1．琼脂糖电泳（1）取一定量的待测DNA样品，用适当的限制性内切酶酶切。

DNA的量根据样品的种类及实验目的的不同而异，对于克隆片段的限制性内切酶图谱分析，取0.1-0.5μg即可；而对于鉴定基因组DNA中的单拷贝基因序列，则需要10～20μg；当采用寡核苷酸探针或探针的比放射性活性较低时，则需要30～50μg。

（2）酶切完毕，在琼脂糖凝胶中电泳。

（3）电泳结束后，EB染色，长波紫外线下观察电泳结果及照相。

2．印迹转移（1）切胶并作标记（左下角切除），以便于定位，然后将凝胶置于一容器中。

Southern印迹杂交转膜示意图（2）将凝胶浸泡于适量的变性液中，室温下放置1h 使之变性，不间断地轻轻摇动。

（3）将凝胶用去离子水漂洗1次，然后浸泡于适量的中和液中30 min，不间断地轻轻摇动。

更换中和液，继续浸泡15 min。

（4）将滤纸，硝酸纤维素膜NC膜(以下简称NC膜）剪成与胶同样大小，NC 膜浸入转移buffer中平衡30 min。

（5）按右图操作：逐层铺平，各层之间勿留有气泡和皱折。

（6）虹吸转移12-16h。

3．固定DNA（1）取出转移后的NC膜，用滤纸吸干NC膜，NC膜光面朝上平铺于变性液中变性5min。

Southern印迹杂交实验原理和方法-3

Southern印迹杂交实验原理和方法-3真空转移法的最大优点是迅速，可在转膜的同时进行DNA变性与中和整个过程约需3 0～60分钟。

但在操作中应注意两个问题，一是真空压力不能太大，若压力过大，凝胶被压缩，转移效率会降低；二是真空转移液要密封严，防止漏气影响压力的产生。

下表列出了不同的印迹方法。

表10－2 不同印迹方法的比较表五、探针标记用于Southern印迹杂交的探针可以是纯化的DNA片段或寡核苷酸片段。

探针可以用放射性物质标记或用地高辛标记，放射性标记灵敏度高，效果好；地高辛标记没有半衰期，安全性好。

人工合成的短寡核苷酸可以用T4 多聚核苷酸激酶进行末端标记。

探针标记的方法有随机引物法、切口平移法和末端标记法，详细方法参见本书相关章节。

这里介绍放射标记。

以下为 Promega公司随机引物试剂盒提供的标记步骤：（一）取25～50mg模板DNA于0.5ml离心管中，100℃水浴5min，立即置冰浴。

（二）在另一个0.5ml离心管中加入：Labeling 5×Buffer (含随机引物) 10μldNTPmix(含dCTP.dGTP.dTTP各0.5mmol/L) 2μlBSA(小牛血清蛋白) 2μl[α-32ρ] dATP 3μlKlenow 酶 5U（三）将变性模板DNA加入到上管中，加ddH2O至50μl混匀。

室温或37℃ 1h.（四）加50μl终止缓冲液终止反应标记后的探针可直接使用或过柱纯化后使用。

由于α-32ρ的半衰期只有14天，所以标记好的探针应尽快使用。

探针的比活性最好大于 1091计数/分/μl。

六、预杂交（prehybridizafion）将固定于膜上的DNA片段与探针进行杂交之前，必须先进行一个预杂交的过程。

因为能结合DNA片段的膜同样能够结合探针DNA，在进行杂交前，必须将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭，这就是预杂交的目的。

预杂交是将转印后的滤膜置于一个浸泡在水浴摇床的封闭塑料袋中进行，袋中装有预杂交液，使预杂交液不断在膜上流动。

Southern步骤

Southern杂交采用Roche 公司高辛标记试剂盒进行探针标记并进行Southern DNA分子杂交。

1.基因组的提取：（用SDS-CTAB法提取基因组，并测定OD值）取2μl于0.8%琼脂糖凝胶中，100V，电泳30min，拍照，其余置-20℃保存或直接用于酶切。

2.酶切及电泳1)酶切反应体系配制：基因组150~200 μg10×限制酶缓冲液50 μl限制性内切酶200 U灭菌水至总体积500 μl混匀体系，37℃过夜酶切。

2)酶切产物电泳：将酶切产物沉淀下来，并用50ul水溶解沉淀。

制备0.8%琼脂糖凝胶，加5μl 10×loading buffer到50μl 的酶切消化产物中，上样并电泳，35V电泳过夜。

3.转膜(1) 将凝胶加样孔及不含样品的多余部分切掉，置于0.25M HCl中浸泡10分钟；(2) 用蒸馏水稍冲洗后，浸于变性液(0.5M NaOH，1.5M NaCl)中室温变性，15分钟2次共30分钟，其间轻摇数次；(3) 用蒸馏水稍冲洗后，浸于中和液(0.5M Tris·Cl，pH7.4，1.5M NaCl)中于室温中和15分钟2次共30分钟，其间轻摇数次；(4) 洗净转膜仪，选窗口大小合适的封闭膜，剪一张略大于凝胶块的滤纸及尼龙膜，蒸馏水浸润后置于20×SSC中至少5分钟，剪去一角与凝胶块对应铺于底部，后将封闭膜压好，然后将凝胶铺在窗口的尼龙膜上，赶除气泡；(5) 真空转移，20×SSC中性转移缓冲液真空转移1.5-2小时，压力5 inch Hg；4.固定DNA：用UV交联仪（UPVL1000）将DNA固定在膜上5.探针的标记：探针可以提前制备好，冻存。

根据Roce公司的DIG标记试剂盒进行如下操作：（所用PCR仪Thermo Electron PxE基本型PCR仪）在25μl反应体系中加入2.5μl 10×PCR buffer（MBI），2.5μl 10×PCR DIG DNA labeling Mix（Roce），25pmol上游引物，25pmol下游引物，0.5μlTaq（MBI），50pg模板DNA，同时用未标记DIG的dNTP(MBI )作对照反应。

基因组DNA Southern杂交操作步骤

基因组DNA Southern杂交操作步骤1）基因组DNA Southern印迹的制备预备1．用适当的限制性内切酶消化基因组DNA样品（10μg）。

2．进行琼脂糖凝胶电泳。

一般用0.7～1.0％的琼脂糖凝胶分离基因组DNA，它在1～15kb的范围内有较好的分辨率，可选用TBE或TAE缓冲液。

琼脂糖凝胶电泳需在1V/cm的电压下进行，如果要分离片段大小相似的DNA带，应用较大的凝胶（20×25cm）。

常用的标准品是由Hind Ⅲ消化的λDNA、Hae Ⅲ消化的ΦX174 DNA和100或1000bp的梯形图谱。

电泳完毕，将凝胶放在紫外透射仪上，并在凝胶旁放一尺子进行拍照。

当把凝胶从盘内移动紫外透射仪时，小心不要将凝胶滑落或弄破。

Southern印迹的制备1．将凝胶转移至塑料盒内。

2．加入至少4倍凝胶体积的0.25mol/L HCl使DNA脱嘌呤，置室温摇床温育15min。

这时凝胶上样缓冲液中的溴酚蓝应变黄色，如果15min后仍呈蓝色，应再温育5min。

3．小心地塑料盒内HCl弃去，用蒸馏水漂洗凝胶一次。

4．加入至少4倍体积的变性缓冲液，置室温摇床温育20min。

5．用新鲜缓冲液重复步骤4，小心弃去变性缓冲液，用蒸馏水稍加漂洗。

6．加入至少4倍体积的中和反应缓冲液，置室温摇床温育15min。

7．用新鲜缓冲液重复步骤6。

8．当处理凝胶时，裁一张略大于凝胶的滤膜（硝酸纤维膜或尼龙膜），预先用蒸馏水将滤膜浸湿后用20×SSC浸泡至少15min。

9．安装转移装置。

在盘中加入印迹缓冲液（20×SSC），在缓冲液面作一平台，比如可倒置一凝胶盘，上面盖三张经20×SSC饱和过的滤纸（Whatman 3MM），平台两侧的滤纸应浸泡在缓冲液中，用10ml的玻璃吸管在其表面小心滚动以赶出所有气泡，并将滤纸推平。

10.倒数毫升20×SSC于滤纸表面，将凝胶面向下倒扣在滤纸上，小心赶出凝胶与滤纸间的气泡，凝胶四周用胶布或塑料薄膜包裹以防缓冲液从凝胶周围直接流至纸中（虹吸短路）。

Southern杂交

Southern 杂交（一）目的通过分子杂交，检测重组DNA分子中插入的外源基因是否确是原供体中的某一基因片段。

（二）原理Southern 印迹杂交是指将经凝胶电泳分离的DNA片段转移到合适的固相支持物上（通常是尼龙膜或硝酸纤维膜），再通过特异性的探针杂交来检测被转移的DNA的片段的一种技术。

Southern 杂交的实验流程如下：基因组DNA样品的限制性酶切-> 酶切样品的琼脂糖凝胶电泳-> DNA的变性、转膜与固定-> 杂交与杂交后清洗-> 杂交结果的检测（三）材料1.基因组DNA样品的限制性酶切：1）样品：GFP蛋白基因2）试剂：限制性内切酶；10x酶切缓冲液；0.5mol/L EDTA；Tris-饱和酚；氯仿/乙醇=24：1（体积比）；预冷无水乙醇和70%乙醇；TE缓冲液3）仪器及器材：恒温水浴锅；电泳仪；水平电泳槽；微波炉；紫外透射仪2.酶切样品的琼脂糖凝胶电泳：1）样品：上一个实验的酶切产物2）试剂：琼脂糖；1xTAE缓冲液；6xDNA加样缓冲液；EB溶液；DNA分子量标准（DNA Marker）3）仪器及器材：电泳仪；水平电泳槽；微波炉；紫外透射仪；凝胶成像分析系统；微量移液器3.DNA的变性、转膜与固定：1）样品：电泳后的琼脂糖凝胶2）试剂：水解液（0.25mol/L HCL）；变性液（1.5mol/L NaCl, 0.5mol/L NaOH, 0.2mol/L HCL）；中和液（1mol/L Tris-HCL pH=7.4, 1.5mol/L NaCl）；硝酸纤维膜（NC膜）或尼龙膜；碱性转移缓冲液（0.4mol/L NaOH, 1mol/L NaCl）；20xSSC（3mol/L NaCl, 0.3mol/L 柠檬酸三钠pH=7.0）；20xSSPE（3.6mol/L NaCl, 0.2mol/L NaH2PO4, 0.02mol/L EDTA pH=7.7）；50xDenhardt 试剂（5g聚蔗糖Ficoll 400, 5g聚乙烯吡咯烷酮和5g牛血清白蛋白，加入无菌蒸馏水至500ml）3）仪器及器材：印迹转膜装置（托盘、支持物、Whatman 3MM滤纸、纸巾、玻璃板、重物等），紫外交联仪4.杂交与杂交后清洗：1）样品：固定了DNA酶切样品的硝酸纤维膜2）试剂：预杂交液（6xSSC, 5xDenhardt试剂, 0.5% m/V SDS, 1μg/ml polyA, 100μg/ml 鲑鱼精DNA, 50% V/V 甲酰胺）3）仪器及器材：杂交管（瓶），杂交炉5.杂交结果的检测：1）样品：杂交后已清洗的NC膜2）试剂：显影液，定影液3）仪器及器材：X线胶片，X线胶片盒（带增感屏），保鲜膜（四）步骤基因组DNA样品的限制性酶切：1）酶切：在1.5ml离心管中依次加入ddH2O Xμl；1μg/μl DNA 20μg；10x酶切缓冲液4.0μl；10U/μl限制性内切酶5.0μl，总体积500μl。

southern印迹杂交中的操作流程原理

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