southern杂交实验方法和步骤

southern杂交实验方法和步骤

一、主要仪器：

离心机

恒温水浴锅

Orbital shaker恒温摇床

Poner PAC300核酸电泳仪

VersaDoc凝胶成像系统

水平摇床

HL-2000Hybrilinker分子杂交仪

烘箱

二、主要材料

whatman3mm滤纸尼龙膜吸水纸玻璃板玻璃棒废旧胶片方形果盘平板

三、主要试剂

RNase A

真菌基因组提取试剂盒

DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I

DNA Maker

NaOH，NaCl，浓盐酸，Tris碱，柠檬酸钠，马来酸

四、试剂准备

变性液：0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl；

Southern blot中和液：0.5mol/L Tris-HCl（pH=7.5），1.5mol/L NaCl；

20×SSC：3mol/L NaCl，0.3mol/L柠檬酸钠，浓盐酸调节pH至7.0；

2×SSC：取100mL20×SSC溶液，灭菌去离子水定容至1L；

2×SSC+0.01%SDS：取100mL20×SSC溶液，10mL10%SDS，灭菌去离子水定容至1L；

0.5×SSC0.01%SDS：取25mL20×SSC溶液，10mL10%SDS，灭菌去离子水定容至1L；

洗涤缓冲液：0.1M马来酸，0.15M NaCl，pH7.5，0.3%（v/v）Tween20；

马来酸缓冲液：0.1M马来酸，0.15M NaCl，用NaOH（固体）调节pH值至7.5；

检测缓冲液：0.1Tris-HCl，0.1M NaCl，pH9.5；

封阻溶液：将DIG试剂盒内的6号瓶置于37℃水浴锅中预热，充分溶解后，取12mL，与108mL马来酸缓冲液混匀备用（新鲜配制，立即使用）；

抗体溶液：将DIG试剂盒内的4号管10000rpm高速离心5min，取4µL上清，加入20mL封阻溶液中，备用；

底物显色液：取20mL检测缓冲液，避光加入400µL DIG试剂盒内的5号管。

五、实验安排

确定实验样本，查找序列，进行酶切位点及探针设计，并合成引物；

培养样本，配制杂交所用试剂，PCR探针合成，回收，质量检测，DIG标记探针；

提取样本基因组，检测基因组质量，酶切预实验；

正式酶切，电泳，转膜；

烘干固定，预杂交，杂交过夜；

洗膜，显色。

六、大量真菌基因组的提取

取绿僵菌孢子接种于20mL的1/4SDAY培养液中，250rpm×28℃培养2d；抽滤收集菌丝，灭菌水冲洗3次以上；将抽滤的菌丝加液氮速冻后研磨成粉末，研磨3次以上，取约500mg粉末至2mL的离心管中，按照真菌基因组提取试剂盒的方法步骤依次进行操作：

①加入400μL的LE Buffer，震荡使其充分混匀，再加入4μL的100mg/mL的RNaseA，混匀，置于65℃水浴锅中温浴半小时；

②加入130μL DA Buffer，混匀后冰浴5min后14000g高速离心3min；

③将离心后上清转移到新的1.5ml的PE管中，加入750μL E Binding Buffer，充分混匀，将混合液体转移到Spin colum中，6000g离心1min，弃去管中液体；

④向Spin colum中加入500μL G Binding Buffer，10000g高速离心30s，弃去管中液体；

⑤向Spin colum中加入600μL Wash Buffer，10000g高速离心30s，弃去管中液体；

⑥重复上一步；

⑦再次将Spin colum于10000g高速离心1min，并将Spin colum放置在一个新的1.5ml离心管上；

⑧室温静置3min，向Spin colum中加入40μL灭菌去离子水，室温放置1min，12000g高速离心1min。

检测提取得到的基因组的质量和浓度。

七、Southern blot验证敲除转化子

①基因组酶切：

将敲除转化子和野生型菌株的基因组用X1和X2双酶切，反应体系如下：

10×FD buffer 4.5μl

X12μl

X22μl

样品DNA6μg

ddH2O水至45μl

总体积45μL

37℃恒温反应2h。

②电泳分离

酶切1.5h后，取2μL酶切DNA样品于1%的琼脂糖凝胶上进行检测，判断酶切程度。当酶切充分时，制备1%的琼脂糖电泳凝胶，样品中加入10×loading buffer，于30-40V稳压电泳4-5h（包括DNA Marker和阳性对照质粒），电泳完成之后，切下样品及质粒部分的凝胶，剩余DNA Marker部分则单独浸泡在添加了10μL10 mg/ml溴化乙锭（EB）的100mL1×TAE buffer中染色30min。

③电泳凝胶预处理

1)将凝胶浸于适量变性液中（浸没凝胶），室温，于水平摇床上低速晃动15 min，并重复一次；

2)再将凝胶浸于灭菌的ddH2O中，室温，轻轻晃动10min；

3)将凝胶浸在中和液中，室温轻轻晃动15min，并重复一次；

4)在20×SSC缓冲液中平衡凝胶10min以上。

④转膜

1)裁剪一张大小合适（19cm×20cm）的whatman3mm滤纸，经20×SSC buffer 浸湿后，放在比凝胶稍大的支撑平台上，两端浸入20×SSC buffer，形成一个“桥”；

2)将与凝胶等大的滤纸Ⅰ放在搭好桥的滤纸上，再将凝胶放置于滤纸Ⅰ上（凝胶背面向上放置），切掉左上角，注意两者之间杜绝气泡；

3)裁剪尼龙膜，与凝胶等大，放置在凝胶上，利用玻棒使其平整，杜绝气泡出现；

4)将三张与膜等大的whatman3mm滤纸放在膜上，利用玻棒使其平整后，放置一叠与凝胶大小一致的吸水纸，并用玻璃板作为放置重物的平台，压在吸水纸上，再添加500g左右的砝码；