人小细胞肺癌细胞新耐药基因的探索

基因Hale Waihona Puke 云在阅员 郧蕴陨员 云砸在月
表 圆摇 基因芯片筛选及 匝砸栽 原 孕悦砸 验证结果
基因芯片筛 匝砸栽 原 孕悦砸 检
行基因芯片检测合成
选上调倍数 测上调倍数 糟阅晕粤 时所用引物序列（缘忆 原 猿忆）
怨援 员怨
远怨援 远
粤郧悦粤悦粤郧悦粤悦栽郧粤悦悦粤粤粤栽郧
源援 猿猿
苑援 源
粤悦粤郧粤悦栽悦粤郧郧悦栽悦粤郧郧悦栽栽悦栽
云在阅员
圆援 远愿 员员援 缘缘 远猿援 缘远 猿援 圆怨 员圆援 缘员 员苑援 远猿
郧蕴陨员
圆援 源愿 猿援 苑源 怨援 怨苑 源援 怨圆 员苑援 圆员 怨援 园远
云砸在月
缘援 缘远 源援 怨远 源猿怨援 远 员圆援 圆员 远援 员缘 猿援 怨苑
猿摇 讨论
临床上小细胞肺癌患者初次接受化疗多数可以达 到理想效果，但是随着化疗周期的进展，常较早地出现 复发和转移。多药耐药机制是小细胞肺癌化疗失败的 主要原因，有 研 究 认 为 多 药 耐 药 现 象 的 发 生 与 责 原 早责［圆］、酝砸孕［猿］、蕴砸孕［源］、月悦砸孕［缘］等基因的过 表 达 密 切 相 关。目前未找到理想靶点逆转小细胞肺癌多药耐药。
员援 源援 猿摇 小细胞肺癌分期摇 采用美国退伍军人医院和 国际肺癌研究会制定的 灾粤 分期，分为局限期（ 造蚤皂蚤贼藻凿 凿蚤泽藻葬泽藻，蕴阅）和广泛期（ 藻曾贼藻灶泽蚤增藻 凿蚤泽藻葬泽藻，耘阅）。
圆摇 结果
圆援 员摇 基因芯片筛选结果摇 本实验经基因芯片筛选，比 较小细胞肺癌亲本细胞株 匀远怨 细胞，耐药细胞株 匀远怨粤砸 明显上调或下调的基因有 圆园园 多个。匀远怨粤砸 细胞与亲 本细胞 匀远怨 比较的基因芯片散点图见图 员，其中挑选了 猿 个明显上调的基因分别是 云在阅员、郧蕴陨员 和 云砸在月，表达 增高 源郾 猿猿 耀 怨郾 员怨 倍，并进行后续实验。见表 圆。
远援 愿愿
缘援 苑
栽粤悦悦粤郧粤悦栽栽郧郧粤郧悦栽郧粤郧栽郧郧
万方数据
圆援 猿摇 临床血液样本验证摇 收集的 远 例临床血液标本， 平均初诊到产生耐药时间（员圆园郾 愿猿 依 源猿郾 园园）凿。对其化 疗前与化疗后 猿 个基因的表达行 匝砸栽 原 孕悦砸 检测，结 果显示，与化疗前比较，产生耐药时小细胞肺癌患者血 液中 云在阅员、郧蕴陨员 和 云砸在月 基因表达明显上调（ 表 猿）。
广东医学摇 圆园员员 年 源 月 第 猿圆 卷第 愿 期摇 郧怎葬灶早凿燥灶早 酝藻凿蚤糟葬造 允燥怎则灶葬造摇 粤责则援 圆园员员，灾燥造援 猿圆，晕燥援 愿
·怨怨怨·
人小细胞肺癌细胞新耐药基因的探索
关俊明员 ，闫玉生员△ ，郭琳琅圆△ ，白义凤圆
南方医科大学珠江医院员 心胸外科，圆 病理科（ 广州 缘员园圆愿圆）
表 猿摇 远 例小细胞肺癌患者基本资料及耐药时外周血 云在阅员、 摇 郧蕴陨员 和 云砸在月 基因表达相对化疗前上调倍数
项目
例员 例圆 例猿 例源 例缘 例远
性别
女女男男男男
年龄（ 岁）
缘愿 源园 苑猿 缘缘 缘愿 苑猿
初诊时肿瘤分期
蕴阅 蕴阅 蕴阅 蕴阅 耘阅 耘阅
初诊到耐药间隔时间（ 凿） 员愿圆 远缘 员园怨 愿远 员缘员 员猿圆
表 员摇 明显上调的 猿 个基因的 匝砸栽 原 孕悦砸 引物（缘忆 原 猿忆）
基因
正向引物
反向引物
云在阅员
郧栽郧粤郧悦悦郧粤悦悦粤粤郧郧栽郧栽粤栽 粤郧悦粤悦粤郧悦粤悦栽郧粤悦悦粤粤粤栽郧
郧蕴陨员
栽郧郧粤栽粤栽郧粤栽郧郧栽栽郧郧悦粤粤郧栽郧 粤悦粤郧粤悦栽悦粤郧郧悦栽悦粤郧郧悦栽栽悦栽
云砸在月
悦栽粤粤郧栽郧悦悦粤栽郧粤栽郧栽郧粤悦栽郧悦粤郧 栽粤悦悦粤郧粤悦栽栽郧郧粤郧悦栽郧粤郧栽郧郧
摇 摇 【 摘要】摇 目的摇 筛选小细胞肺癌耐药相关的基因，为小细胞肺癌多药耐药的诊断及治疗寻找理想靶标。方 法摇 从基因芯片结果中筛选人小细胞肺癌多药耐药细胞株 匀远怨粤砸 相对亲本 匀远怨 细胞高表达的基因 云在阅员、郧蕴陨员 和 云砸在月，并使用 匝砸栽 原 孕悦砸 验证。匝砸栽 原 孕悦砸 分析 猿 种基因在 远 例化疗前与产生耐药时小细胞肺癌患者血液标 本中的表达状况。结果摇 基因芯片证实 云在阅员、郧蕴陨员 和 云砸在月 在 匀远怨粤砸 细胞相对 匀远怨 细胞高表达 怨郾 员怨、源郾 猿猿 和 远郾 愿愿 倍。匝砸栽 原 孕悦砸 验证得出一致的结果：远 例小细胞肺癌患者耐药时血液标本的 云在阅员、郧蕴陨员 和 云砸在月 表达水平 明显高于化疗前。结论摇 云在阅员、郧蕴陨员 和 云砸在月 基因可作为逆转小细胞肺癌多药耐药的理想靶点。
·员园园园·
广东医学摇 圆园员员 年 源 月 第 猿圆 卷第 愿 期摇 郧怎葬灶早凿燥灶早 酝藻凿蚤糟葬造 允燥怎则灶葬造摇 粤责则援 圆园员员，灾燥造援 猿圆，晕燥援 愿
阅葬贼葬 软件分析。然后对 圆 张芯片的数据进行归一化处 理，并以荧光信号强度比值的对数来表示基因差异性 表达的高低。 员援 源援 圆摇 匝砸栽 原 孕悦砸摇 在 匀远怨、匀远怨粤砸 细胞基因芯片证 实了大量的基因表达有差异，明显上调基因的引物由 陨灶增蚤贼则燥早藻灶 公司合成（ 表 员）。使用 糟阅晕粤 合成试剂盒合 成 糟阅晕粤，取 员园 μ蕴 的 孕悦砸 反应试剂进行 孕悦砸 反应，反 应试 剂 包 括 员 μ蕴 砸栽责则燥凿怎糟贼，员 伊 孕悦砸 酝葬泽贼藻则 酝蚤曾，员缘 灶皂燥造 辕 蕴 正向引物和 员缘 灶皂燥造 辕 蕴 负向引物。
摇 △通信作者。闫玉生，科主任，主任医师，耘 原 皂葬蚤造：赠葬灶赠泽岳 枣蚤皂皂怎援 糟燥皂；郭琳琅，教授，博士研究生导师，耘 原 皂葬蚤造：造蚤灶造葬灶早早岳 赠葬澡燥燥援 糟燥皂
万方数据
例，共 远 例。保留 远 例资料完整患者化疗前后的血液 标本，年龄 源园 耀 苑猿 岁，平均（缘怨郾 缘 依 员圆郾 源）岁，其中局限 期 源 例，广泛期 圆 例。 员援 圆摇 基因芯片摇 为首都生物公司设计的人类基因组 芯片，该 芯 片 包 含 有 圆员 缘圆圆 转 录 本。 细 胞 株 匀远怨、 匀远怨粤砸 细胞购于美国 栽赠责藻 悦怎造贼怎则藻 悦燥造造藻糟贼蚤燥灶（ 粤栽悦悦） 公司。圆 种细胞分别培养在 员园豫 、圆园豫 砸孕酝陨 员远源园 稀释 的胎牛血 清 中，猿苑益 、缘豫 悦韵圆 培 养 箱 中 孵 育；匀远怨粤砸 细胞以无药与 园郾 愿 μ皂燥造 辕 蕴 的阿霉素交替培养，维持其 耐药性。 员援 猿摇 血液标本及 匀远怨、匀远怨粤砸 细胞总 砸晕粤 的提取摇 抽取的临床血液标本立即采用 栽则蚤扎燥造 试剂分别提取白细 胞总 砸晕粤，并于 原 愿园益 冰箱保存。匀远怨 及 匀远怨粤砸 细胞 总 砸晕粤 提取使用 砸晕藻葬泽赠 酝蚤灶蚤 运蚤贼（ 匝蚤葬早藻灶），按照说明 书提取，变性后通过琼脂凝胶电泳法评价 砸晕粤 质量，并 通过分光光度计测量浓度。从每个样品中取 圆 μ早 使用 糟阅晕粤 合成试剂盒（ 宝生物科技公司）用于合成 糟阅晕粤， 糟阅晕粤 的合成使用逆转录酶及 怨 原 灶贼 随机引物。 员援 源摇 方法 员援 源援 员摇 基因芯片摇 在杂交之前 缘忆、猿忆 端分别标记红色 及绿色染料用于杂交，杂交信号的收集使 用 蕴怎曾杂糟葬灶 员园运 原 粤 共聚焦扫描仪，并通过首都生物公司的 杂责燥贼鄄
摇 横轴：匀远怨 细胞经归一化处理后的杂交信号强度；纵轴：匀远怨粤砸 细
胞经归一化处理后的杂交信号强度；云在阅员、郧蕴陨员 和 云砸在月 均位于 凿葬 上象限 匀远怨粤砸 细胞高表达区域
图 员摇 基因芯片杂交信号扫描结果与散点图
圆援 圆摇 匝砸栽 原 孕悦砸 验证摇 云在阅员、郧蕴陨员 和 云砸在月 基因分别 上调 远怨郾 远、苑郾 源 和 缘郾 苑 倍，与基因芯片结果相吻合，见表 圆。
【 运藻赠 憎燥则凿泽】摇 糟阅晕粤 皂蚤糟则燥葬则则葬赠；泽皂葬造造 糟藻造造 造怎灶早 糟葬灶糟藻则；皂怎造贼蚤凿则怎早 原 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻
摇 摇 肺癌是导致人类癌性死亡的首位疾病。小细胞肺 癌（ 泽皂葬造造 糟藻造造 造怎灶早 糟葬灶糟藻则，杂悦蕴悦）占肺癌总数的 员园豫 耀 员缘豫 ，各病理 分 型 中 其 恶 性 程 度 最 高，缘 年 生 存 率 仅 缘豫 左右［员］。因小细胞肺癌对化疗敏感，故化疗为其主 要治疗方式，但小细胞肺癌细胞非常容易对化疗产生 耐受。目 前 认 为 多 药 耐 药 机 制（ 皂怎造贼蚤凿则怎早 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻， 酝阅砸）是导 致 小 细 胞 肺 癌 对 化 疗 产 生 耐 药 的 主 要 原 因，多药耐药机制与多药耐药蛋白、多药耐药基因表达 密切相关。本研究以多药耐药的 匀远怨粤砸 细胞以及亲 本细胞 匀远怨 为研究对象，利用基因芯片技术筛选与小 细胞肺癌细胞多药耐药相关的基因，并以临床标本加 以验证。 员摇 资料与方法
员援 员摇 标本采集摇 圆园园怨 年 员员 月到 圆园员园 年 员园 月我院经 病理证实的小细胞肺癌患者 员圆 例，并开始接受顺铂和 依托泊苷 的 规 范 联 合 化 疗。 在 化 疗 前 抽 取 血 液 标 本 猿 耀 缘 皂蕴，经规范化化疗出现肿块较前增大、复发或转 移，再次抽取血液标本 猿 耀 缘 皂蕴。化疗疗程中拒绝化 疗 员 例，未完成规范化化疗 源 例，合 并 有 其 他 肿 瘤 员
【 关键词】摇 基因芯片；小细胞肺癌；多药耐药
陨灶增藻泽贼蚤早葬贼蚤燥灶 燥枣 皂怎造贼蚤凿则怎早 原 则藻泽蚤泽贼葬灶贼 则藻造葬贼藻凿 早藻灶藻泽 燥枣 澡怎皂葬灶 杂悦蕴悦 怎泽蚤灶早 糟阅晕粤 皂蚤糟则燥葬则则葬赠援 摇 郧哉粤晕 允怎灶 原 皂蚤灶早☆ ，再粤晕 再怎 原 泽澡藻灶早，郧哉韵 蕴蚤灶 原 造葬灶早，月粤陨 再蚤 原 枣藻灶早援 ☆ 阅藻责葬则贼皂藻灶贼 燥枣 悦葬则凿蚤燥 原 栽澡燥则葬蚤糟 杂怎则早藻则赠，在澡怎躁蚤葬灶早 匀燥泽责蚤贼葬造， 杂燥怎贼澡藻则灶 酝藻凿蚤糟葬造 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠，郧怎葬灶早扎澡燥怎 缘员园圆愿圆，悦澡蚤灶葬 悦燥则则藻泽责燥灶凿蚤灶早 葬怎贼澡燥则：再粤晕 再怎 原 泽澡藻灶早，郧哉韵 蕴蚤灶 原 造葬灶早援 摇 摇 【 粤遭泽贼则葬糟贼】摇 韵遭躁藻糟贼蚤增藻摇 栽燥 泽糟则藻藻灶 贼澡藻 泽皂葬造造 糟藻造造 造怎灶早 糟葬灶糟藻则（ 杂悦蕴悦）则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 原 则藻造葬贼藻凿 早藻灶藻泽，责则燥增蚤凿蚤灶早 蚤凿藻葬造 贼葬则早藻贼泽 枣燥则 泽藻灶泽蚤贼蚤扎蚤灶早 贼澡藻 皂怎造贼蚤凿则怎早 原 则藻泽蚤泽贼葬灶贼 杂悦蕴悦 贼燥 糟澡藻皂燥贼澡藻则葬责赠援 酝藻贼澡燥凿泽摇 韵增藻则藻曾责则藻泽泽藻凿 早藻灶藻泽 蚤灶 皂怎造贼蚤凿则怎早 原 则藻鄄 泽蚤泽贼葬灶贼 杂悦蕴悦 憎藻则藻 泽藻造藻糟贼藻凿 葬糟糟燥则凿蚤灶早 贼燥 贼澡藻 糟阅晕粤 皂蚤糟则燥葬则则葬赠援 匝砸栽 原 孕悦砸 憎葬泽 葬责责造蚤藻凿 枣燥则 葬泽泽藻泽泽皂藻灶贼 燥枣 贼澡藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 贼葬则早藻贼藻凿 早藻灶藻泽 蚤灶 远 责葬贼蚤藻灶贼泽 憎蚤贼澡 杂悦蕴悦 遭藻枣燥则藻 糟澡藻皂燥贼澡藻则葬责赠 葬灶凿 葬贼 贼澡藻 责则藻泽藻灶贼葬贼蚤燥灶 燥枣 凿则怎早 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻援 砸藻泽怎造贼泽摇 悦燥皂责葬则藻凿 憎蚤贼澡 贼澡藻 早藻灶藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 造藻增藻造 蚤灶 责葬则藻灶贼葬造 匀远怨，猿 怎责 原 则藻早怎造葬贼蚤燥灶 早藻灶藻泽 蚤灶糟造怎凿蚤灶早 云在阅员，郧蕴陨员 葬灶凿 云砸在月 憎藻则藻 则藻增藻葬造藻凿 蚤灶 匀远怨粤砸，憎澡蚤糟澡 憎葬泽 增藻则蚤枣蚤藻凿 遭赠 匝砸栽 原 孕悦砸 憎蚤贼澡 皂怎造贼蚤责造蚤糟葬贼蚤燥灶 遭赠 怨郾 员怨，源郾 猿猿 葬灶凿 远郾 愿愿，则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠援 杂蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶贼 蚤灶鄄 糟则藻葬泽藻 憎葬泽 燥遭泽藻则增藻凿 蚤灶 责葬贼蚤藻灶贼泽 憎蚤贼澡 杂悦蕴悦 责则藻泽藻灶贼蚤灶早 皂怎造贼蚤凿则怎早 原 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻，糟燥皂责葬则蚤灶早 憎蚤贼澡 贼澡葬贼 遭藻枣燥则藻 糟澡藻皂燥贼澡藻则葬责赠援 悦燥灶糟造怎泽蚤燥灶摇 云在阅员，郧蕴陨员 葬灶凿 云砸在月 葬则藻 责则燥遭葬遭造赠 贼澡藻 蚤凿藻葬造 贼葬则早藻贼泽 枣燥则 泽藻灶泽蚤贼蚤扎蚤灶早 贼澡藻 皂怎造贼蚤凿则怎早 原 则藻泽蚤泽贼葬灶贼 杂悦蕴悦 贼燥 糟澡藻皂鄄 燥贼澡藻则葬责赠援