愈创木酚法测定过氧化物酶活性

愈创木酚法测定过氧化物酶活性

一、实验目的

过氧化物酶是植物体内普遍存在的､活性较高的一种酶，它与呼吸作用､光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断变化，可以反映某一时期植物体内代谢的变化｡

二、实验原理

在过氧化物酶(peroxidase POD)催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物｡此产物在470nm处有最大光吸收值，故可通过测470nm下的吸光度变化测定过氧化物酶的活性｡

三、实验材料

海滨锦葵叶片

四、实验设备与试剂

1、实验设备

①可见光分光光度计；②离心机；③研钵；④容量瓶；⑤量筒；⑥试管；⑦吸管｡

2、实验试剂

0.05mol/L的磷酸缓冲液(pH5.5)；

0.05mol/L愈创木酚溶液；

2%H2O2；

20%三氯乙酸

五、实验步骤

(一)酶液的制备

取1.0~5.0g洗净的海滨锦葵叶片，切碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆。将匀浆液全部转入离心管中，于3000rmp离心10min，上清液转入25mL容量瓶中。沉淀用5mL磷酸缓冲液再提取两次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，低温下保存备用。

(二)过氧化物酶活性测定

酶活性测定的反应体系包括: 2.9mL0.05mol/L磷酸缓冲液；1.0mL2%H2O2；

1.0mL0.05mol/L愈创木酚和0.1mL酶液。用加热煮沸5min的酶液为对照，反

应体系加入酶液后，立即于37℃水浴中保温15min，然后迅速转入冰浴中，并加入20%三氯乙酸2.0mL终止反应，然后过滤（或5000r/min离心10min），适当稀释，470nm波长下测定吸光度。

六、实验结果

以每分钟内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位(U)｡

过氧化物酶活性[

U

g·min

]=

△A470×V T

W×V S×0.01×t

式中:△A470——反应时间内吸光度的变化；

W——马铃薯鲜重(g)；

t——反应时间(min)；

V T——提取酶液总体积(mL)；

V S——测定时取用酶液体积(mL)｡

七、注意事项

酶液的的提取过程要尽量在低温温条件下进行｡H2O2要在反应开始前加，不能直接加入｡