天然产物活性多糖结构与功能研究进展 (1)

换法、氧化法、金属络合物法和吸附法（纤维素、硅 藻土、活性炭）等[11-13]。DEAE-纤维素法是通过离子 交换作用来达到脱色的目的， 并且能够分离纯化 多糖。 对于无机盐、色素、单糖和寡糖等小分子物 质，可以采用透析的方法除去。
提取、除杂后所得粗多糖通常是混合多糖，若 要获得均一多糖，还需对多糖进行分离纯化。 分离 纯化多糖的方法很多 ， [14-20] 如 分 步 沉 淀 法 、季 铵 盐 沉底法、柱层析法、超滤法和超离心法等，然而往 往一种方法只能除去其中一种或几种杂质， 不能 一次性地获得均一组分。 只有综合利用几种纯化 方法才能达到纯化的效果。 离子交换柱层析适合 于分离各种酸性、中性粘多糖，是目前多糖纯化中 应用最广的一种方法， 特别是对于体积较大的多 糖溶液，大多采取阴离子交换柱层析纯化的策略， 使多糖得到初步纯化，甚至可以分离到均一组分[21]。 使用较为普遍的交换剂（填料）有二乙基氨基纤维 （DEAE -cellulose）、DEAE - 葡 聚 糖 （DEAE Sephadex） 和 DEAE - 琼 脂 糖 （DEAE -Sepharose）。 这些交换剂具有三度空间网状结构， 不仅具有离 子交换作用，而且具有分子筛作用，柱效较高。 凝 胶柱层析常用的凝胶填料有葡聚糖凝胶 （Sephadex）、 琼 脂 糖 凝 胶 （Sepharose） 和 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 （Bio -gel） 等 ， 以 及 后 来 开 发 出 来 的 Sephcryl、Superdex 等系列。 使用凝胶填料进行多 糖的分离纯化时， 通常以不同浓度的盐溶液和缓
因此多糖氧化后定量测定过碘酸盐的消耗、 甲酸 的生成和剩余糖的比例， 就可确定多糖中各种单 糖的键型及其比例。 多糖的过碘酸盐氧化一般在 pH 3~5 的水溶液中进行（暗处）。 过低 pH 导致酸 水解，过高 pH 引起无选择性氧化。 确定糖苷键的 位置时，需要与 Smith 降解相结合。 2.2.4 Smith 降解 Smith 降解是将高碘酸氧化的 产物还原后进行酸水解。 由于糖基之间不同的位 置缩合，因此用高碘酸氧化后生成不同的产物。 将 氧化产物用硼氢化钠还原成稳定的多羟基化合 物， 水解后用纸层析或者 GLC 鉴定水解产物，由 降解的产物推断糖苷键的位置。 由于实验中加入 乙二醇终止反应， 所以检测终产物中乙二醇没有 意义，一般以甘油、赤藓醇和其它糖等作为糖苷键 的特征终产物。 2.2.5 甲基化分析 甲基化分析是确定寡糖和多 糖中单糖间糖苷键位置的重要手段。 其原理是：先 将多糖中各种单糖残基中的游离羟基全部甲基 化， 将甲基化多糖水解得到甲基化的单糖进行衍 生处理， 最后用 GC-MS 方法结合标准谱图分析， 可得到部分甲基化单糖衍生物的归属， 从而确定 单糖残基的连接位点。 同时根据不同甲基化单糖 的比例推出这种连接键型在多糖重复结构中的比 例[30-31]。 然而甲基化分析无法确定异头碳糖苷键构 型和单糖残基的顺序信息。
项目
方法
多糖纯度及相对分子质量测定
HPGPC、渗 透 压 、黏 度 法 、光 散 射 法 、聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 法 等
单糖组成及比例
完 全 酸 水 解 、HPLC、GC、GC-MS、高 效 离 子 色 谱 等
糖苷的糖环形式（吡喃环、呋喃环）
红外光谱等
单糖残基类型和糖苷键连接位点
甲基化分析、GC-MS 等
1 多糖的分离纯化
多糖既可存在于细胞壁外， 又可存在于细胞 壁内。 若从动、植物中提取多糖，就要对细胞进行 破碎，使多糖容易释放出来。 因破碎后的细胞，其 中的脂类物质也易连同多糖被提取出来， 故需要 预先脱脂。 一般采用醇和醚类物质浸泡或回流提 取来除去脂质， 此时一些脂溶性色素也容易被除 去。 脱脂后的样品再用于多糖的提取。 以水、盐溶 液、稀酸或稀碱在不同条件下提取，提取液浓缩后 经透析、沉淀、干燥得到粗多糖。 当用碱性溶液提 取时， 需要在低温条件下提取， 避免多糖发生降 解。 近年来，微波、超声和酶法辅助提取技术也开 始应用于多糖的提取[4-7]。
1988 年，英国的 Rademacher 等几位多年从事 糖类研究的科学家首次提出了 “糖生物学”（Glycobiology）， 宣告了糖生物学这一分支学科的正式 诞生[2]。 美国、日本、欧盟等政府机构争相增加相关 研究和经费投入，致力于糖类研究。 现代科学研究 已经表明一切重要的生命活动， 如细胞识别都有 糖链的参与。 在第一届国际糖工作年会上，会议主 席宣称“生物化学中最后一个重大前沿，糖生物学 的时代正在加速到来！ ”[3]。 美国 《科学》 杂志于 2001 年 3 月 23 日出版了一期专辑 “糖和糖生物 学”，表明对多糖的研究在国际学术界日益得到重
提取得到的多糖溶液一般含有较多杂质，首 先需考虑除去多糖提取液中的蛋白质。 常用的脱 蛋白方法有 Sevag 法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸
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中国食品学报
2010 年第 2 期
法以及酶法等[8]，其中 Sevag 是脱除蛋白质的经典 方 法 ， [9-10] 但 其 效 率 不 高 （需 要 提 取 3 次 以 上 ），且
冲液作为洗脱剂，使洗脱液具有一定的离子强度。 多糖出柱的顺序是大分子先出柱，小分子后出柱，
多糖会有一定程度的损失。 多糖中也常含有一些 从而使不同分子质量的多糖得到其性质可采取 凝胶柱层析不适合粘多糖的分离。
不同的脱色方法。 目前常用的脱色方法有离子交
第 10 卷 第 2 期 2010 年4月
中国食品学报
Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology
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天然产物活性多糖结构与功能研究进展
谢明勇 * 聂少平 （食品科学与技术国家重点实验室 南昌大学 南昌 330047）
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2.1 相对分子质量的测定 测定多糖的相对分子质量是一项较为重要的
工作，多糖的性质往往与其相对分子质量有关。 多 糖的相对分子质量只代表相似链长的平均分布， 可 以 用 量 均 相 对 分 子 质 量 （Mw）、 数 均 相 对 分 子 质 量（Mn）、重均相对分子质量（Mw）和粘均相对分子 质量（Mv）表示。 通常文献报道的相对分子质量是 量均相对分子质量。 目前测定多糖相对分子质量 的 方 法[23-27]主 要 有 渗 透 压 法 、 蒸 汽 压 法 、 端 基 法 、 光 散射法、黏度法、超过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳 法、凝胶过滤法和 HPGPC 等。 HPGPC 测定多糖相 对分子质量具有快速、 高分辨率和重现性好等优 点，在国内外得到广泛使用 。 [28-29] 2.2 化学降解分析方法 2.2.1 单糖组成测定 多糖水解后生成的单糖混 合物或单糖甲基糖苷混合物可以用 TLC、HPLC 或 GC 等方法作定性鉴定和定量分析。 GC 分析时，待 测样品要转换成易挥发、热稳定性好的衍生物，如 糖三甲基硅醚、糖醇乙酸酯、糖三氟乙酸酯等。 样 品的水解方法有甲醇水解、盐酸水解、硫酸水解和 三氟乙酸水解等，其中三氟乙酸水解法最为常用。 2.2.2 部分酸水解 通过部分酸水解的方法将多 糖水解成易于分析的小片段。 一般来说，吡喃型糖 基比呋喃型糖基稳定，己糖比戊糖稳定，1-6 糖苷 键对酸水解相对稳定， 主链的糖基比支链的糖基 稳定。 因此，通过部分酸水解可以判断糖苷键的断 裂次序，推断可能的糖苷键类型。 多糖可在温和条 件下水解或者在剧烈条件（高温、较高浓度酸）下 水解。 在完全水解前，终止水解，可得到不同的寡 糖片段和可能的多糖主链， 然后综合采用单糖测 定、 甲基化分析和核磁共振等方法可深入解析多 糖结构。 2.2.3 高碘酸氧化 高碘酸及其盐可以选择性地 断裂糖分子中的连二羟基或连三羟基， 生成相应 的多糖醛、甲醛或甲酸。 糖的非还原末端或非末端 的 （1→6）-键与邻三元醇相似， 其与过碘酸盐作 用， 糖环开裂得一分子比例的甲酸而消耗二分子 比例之过碘酸盐。 非末端的（1→2）-或（1→4）-键 与邻二元醇相似， 其开裂后产生二分子醛而消耗 一分子比例之过碘酸盐。 对于非末端之（1→3）-键 或 C-2 和 C-4 有分枝的， 则不受过碘酸盐影响。
收稿日期： 2010-04-20 基金项目： 国家 863 计划项 目 （2008AA10Z325）； 国 家 自
然科学基金资助项目 （20802032）；国家重点实 验 室 自 主 研 究 目 标 导 向 项 目 （SKLF -MB 200806） 资 助 作者简介： 谢明勇，男，1957 年出生，教授
摘要 多糖是自然界含量丰富的重要生物大分子之一，具有复杂的结构和多方面的功能活性。 本文综述了天然 产物活性多糖提取、分离纯化和结构解析的技术和方法，以及多糖所具有的免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、降血糖、 抗氧化等生物活性。 虽然近几十年来多糖研究取得了很大进步，但是多糖的分离纯化方法发展依然缓慢，其结 构的复杂性也增加了研究的难度。 此外，多糖的功能活性测定大多停留在体外实验阶段，其在体内的具体作用 机制有待于进一步深入研究。
2 多糖的结构解析
多糖结构比蛋白质和核酸的结构更为复杂， 可以说是最复杂的生物大分子。 从化学观点来看， 多糖结构的复杂性无疑给其结构解析带来很大困 难。 糖的结构分类沿用了蛋白质和核酸的分类方 法，即多糖的结构可分为一级、二级、三级和四级 结构。
与其它生物大分子一样， 糖链的二级以上高 级结构是以一级结构为基础的。 不同的是，与蛋白 质或核酸大分子相比，糖链的一级结构“含义”要 丰富得多。 测定糖链的一级结构，要解决以下几个 问 题 ： （1） 相 对 分 子 质 量 ； （2） 糖 链 的 糖 基 组 成 ， 各 种 单 糖 组 成 的 摩 尔 比 ； （3） 有 无 糖 醛 酸 及 具 体 的 糖 醛酸类型和比例 ；（4） 各 单 糖 残 基 的 D-或 L-构 型 ， 吡 喃 环 或 呋 喃 环 形 式 ； （5） 各 个 单 糖 残 基 之 间 的连接顺序；（6）每个糖苷键所取的 α-或 β-异头 异 构 形 式 ；（7） 每 个 糖 残 基 上 羟 基 被 取 代 情 况 ；（8 ） 糖 链 和 非 糖 部 分 连 接 情 况 ； （9 ） 主 链 和 支 链 连 接 位 点 ； （10） 糖 残 基 可 能 连 接 硫 酸 酯 基 、 乙 酰 基 、 磷 酸 基、甲基的类型等。