毛细管电泳-荧光结合微透析取样技术对丙二醛(MDA)含量进行实时、在体检测

4.2 Separation and identification
4.3 Reaction optimization
4.4 Microdialysis validation
Concluding remarks
在本文，我们阐述了一种通过微透析技术在体检 测MDA的方法。在动物实验的过程中，微透析取 样的使用使得局部特定样本的获得成为可能。利 用微透析取样检测MDA提供了细胞脂质体过氧化 的实时过程，而组织采取或者血液样本不能提供。 MDA 在酸性条件下用TBA衍生化20分钟，然后无 需任何预处理直接注射进毛细管。这种方法提供 的检出限为25 nM(S/N=3) ，线性范围 25–2400 nM (1.8–174 ng/mL)。该方法已经被用于小鼠心脏、 肌肉、肝脏和大脑透析液中MDA 的定量检测。
3. 实验方法
小鼠→用混合麻醉剂麻醉→以1 μL/min的流速灌流纯林格 氏液溶液，搜集样本一小时→10mM 3-MPA通过探针注入 小鼠脊椎50min(诱导小鼠癫痫发作）→以1 μL/min的流速 每隔10min搜集样本（微透析取样）→将8 μL搜集的样本 加入离心管→ 再加入3 μLTBA 和硫酸 2:1 混合的混合液→ 离心5s→ 95摄氏度加热20min→急速冷冻保存在-20摄氏度 （MDA衍生化）→取出样本，恢复至室温→用纯水稀释 一半→以 0.5 psi 注射5 s→分离电压设置为10 kV→CE分离 检测→采集数据(样本分离检测） 空白的 TBA 和加入MDA标准物溶液 →用丁醇进行液液萃 取（除去盐和硫酸）→转移丁醇层至另一离心管→丁醇层 用氩气吹干→用500 mL含有0.1% 乙酸的50% 甲醇和水重 新配置溶液→以2 μL/min的流速注射进入MS→图谱数据记 录处理（质谱鉴定）
微透析装置示意图
组成部件
微透析探针
注射泵
实时自动采样进样器
自动样本收集器
微透析实际装置
微透析取样可以与许多检测技术联用。包 括以分离为基础的检测技术如高效液相色 谱和毛细管电泳，以非分离为基础的技术， 如生物传感器、免疫学检测和质谱。因为 高效液相色谱有高选择性、易自动化等特 点,微透析技术与高效液相色谱联用较多, 但是液相色谱存在需要的样品量多，分析 时间长，得到的时间分辨率不高，成本较 高等缺点，使其应用受到一定的限制。
1、研究背景介绍
• 丙二醛（Malomdialdehvde，MDA）是机体内 的氧自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，形 成的脂质过氧化物，它的浓度可以反映脂质过氧 化程度。 • MDA从膜上产生的位置释放出后，可以与蛋白质、 核酸反应，从而丧失功能，还可使纤维素分子间 的桥键松驰，或抑制蛋白质的合成，对机体造成 损害甚至死亡。因此，MDA的积累可能对膜和细 胞造成一定的伤害。 • 对MDA的准确测定可指导人们对机体的受损程度 或耐受程度进行正确的评价，有助于医学、生物 学、药理及工农业生产的发展。
文献缺点
在本实验的分离和鉴定步骤中，电泳图谱 上出现了一个污染物的峰。虽然本文对其 到底是什么物质进行了一部分探索，但最 终还是没有说明它是什么物质的，只知道 是来源于TBA。这对本文的实验结果的可 信度造成了一定影响。
Thank you！
仪器系统
• 毛细管电泳系统的基 本结构包括进样系统、 两个缓冲液槽、高压 电源、检测器、控制 系统和数据处理系统。 • 1－高压电源；2－检 测器；3－毛细管；4 －温度控制系统；5－ 记录/数据处理； 6－ 高压电极槽；7－低压 电极槽。
Detection of malondialdehyde in vivo using microdialysis sampling with CE-fluorescence
毛细管电泳-荧光结合微透析取样技术对 丙二醛（MDA）含量进行实时、在体检 测
主要内容
一、研究背景介绍 二、仪器试剂 三、实验方法 四、实验结果讨论 五、文献优点缺点
探针
局部图
微透析系统组成
微透析系统一般由微透析探针、连接管、收 集器、灌流液和微量注射泵组成。微透析 探针是核心部件，由透析膜（管）与入液 管和出液管连接而成，探针前端是多碳聚 合物半透膜（聚丙烯腈，PAN），透析分 子极限为6－100kda，多为20kda。灌流液多 为生理盐水、林格氏液和人造脑脊液。
2、仪器设备
1.Beckman-Coulter P/ACE MDQ型毛细管电泳仪 2.未处理石英毛细管柱：55cm×75μm（i.d.） 3.微透析探针(MicroLumen, Tampa, FL, USA) 4.KH-1微透析注射泵及控制装置 5.离子阱质谱仪(Thermo Scientific) 6.超声波清洗仪 7.pHS-4C型精密酸度计 8.电子天平
试剂
1.MDA （丙二醛四丁铵盐） 2.boric acid（硼酸） and 3-mercaptopropionic acid (3-MPA) （3-巯基丙酸）and TBA（Sigma-Aldrich ）. 3. TBA（硫代巴比妥酸）（Cayman Chemical） . 4.Brij 35 （布里杰35去污剂，[聚氧乙烯月桂醚]一种非离子 型去污剂）（ MP Biom-edicals）. 5.Sulfuric acid（硫酸） 6. salts for Ringer’s solution（林格氏液（一种生理盐溶液）） (Fisher). 7. nanopure water Ringer’s solution composition was: 147mM NaCl, 3mM KCl, 1mM MgCl2, and 1.2mM CaCl2.
丙二醛(MDA)传统的测定方法是在酸性和高温条 件下，与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色的 三甲川(3，5，5-三甲基恶唑2，4-二酮)。而三甲 川于532nm处有最大吸收峰来进行测定的。这种 方式常常受到多种物质不同程度的干扰。其中最 主要的干扰因素是组织内的可溶性糖。
O HN 2 S N H O O H O H HS N H O HO N H S 100 C
O
O
OH N
+
HN
硫代巴比妥酸
丙二醛
3,5,5´-三甲基恶唑2,4-二酮 （三甲川）
现有测定MDA 的方法
用于MDA 测定已有几种方法： 〔1〕分光光度法。分光光度法灵敏度较低； 〔2〕荧光法。已报道的荧光法由于萃取溶剂不同或 按照原文献方法无混匀器使萃取不完全而造成结 果不准确； 〔3〕高效液相色谱法。高效液相色谱法需昂贵仪器。 〔4〕比色法。检测方法常受到多种因素的干扰，尤 其是当试样处于特殊的情况下，机体内可能会积 累很多的干扰物质。 基于以上方法的不足，本文提出了利用毛细管电 泳-荧光方法结合微透析技术对丙二醛（MDA）含 量进行实时、在体检测的方法。
微透析取样的特点
（1）时间分辨性（2）空间分辨性（3）样品可不 经预处理直接用于测定（4）不需处死动物和制备 组织匀浆（5）可从同一动物收集大量样本而不损 失体液量，避免了传统方法中因采血后血容量减 少所造成对药物分布及消除的影响（6）样品体积 恒定，样品中各成分浓度基本不变，膜对药物的 非特异性吸附较少（7）不会因在室温取样而酶解， 提高样品稳定性（8） 损伤小，使取样可在多个 器官以及同一器官多个位点连续取样，且动物本 身自成空白对照，能准确及时掌握到药物代谢的 中间动态信息。
5. 本方法的优点
微透析与传统的灌流方法相比具有的 优点： 微透析技术是一种在体取样技术， 其最大优点是可在基本不干扰体内正 常生命过程的情况下进行在体（in vivo），实时（real time）和在线（on line）取样。
本方法的缺点
微透析技术的缺点就是需对取出的样品 进行准确可靠的校正，主要涉及到对探针 的回收率的测定。

a respective fluorescence scan of the obtained product.
TheMDA–TBA adduct has a strong absorption at 530 nm with an emission at 560 nm. A fluorescence scan obtained from an MDA standard after derivatization had an excitation maximum at 532 nm with emission maximum at 560 nm signifying a successful production of the fluoro-phore (Fig. 1).
A:KH-1微量泵控制器（Model KH-1 micropump controller）; MP:微量泵（micropump）; R:缓冲液 容器（buffer reservoir）; M:微透析探针（microdialysis probe）; HV:高压电源（highvoltage power supply）.
毛细管电泳原理示意图
4. 实验结果讨论
1.衍生化（Derivatization） 2.分离与鉴定（Separation and identification） 3.反应优化（Reaction optimization） 4.微透析确认（Microdialysis validation）
4.1 Derivatization
微透析取样的原理
基本原理： 在体微透析技术是在组织中植入半透膜探头 (probe)装置,体外微量泵使灌流液(perfusate)流 经探头,组织中被测物质沿浓度梯度差逆向扩散进 入灌流液,并达到一种动态平衡,通过测定流出液, 即透析液(dialysate)中待测物的浓度(Ces),研究 组织细胞外液(extracelluar fluid, ECF)中待测 物的水平(Cos)及其变化过程。
毛细管电泳（capillary electrophoresis， CE）又称高效毛细管电泳（high performance capillary electrophoresis， HPCE），是一类以毛细管为分离通道、以 高压直流电场为驱动力的新型液相分离技 术。 CE具有不同于传统色谱的分离机制，它 具有分辨率高、分离速度快、所需样品量 少、样品处理相对简便的优点，为与微透 析技术联用提供了理想的条件。