限制酶识别序列
酶切位点识别序列
上一段碱基的特定序列，DNAcutting site）：Restriction 酶切位点（Enzyme 序列切成两段。
限制性内切酶能够识别出这个序列并在此将DNA可能存在同尾酶，不同酶的识别序列不同，
WW 有的可能能识别多个酶切位点比如STY1识别序列有
PCR引物设计时酶切位点的保护碱基表不同内切酶对识别位点以外最少保护碱
基数目的要求（在本表中没有列出的）酶，则通常需在识别位点两端至少加上
6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
简DNA的尾端时，限制性内切酶经常不能成功切断(保护碱基：当酶切位点在双链所以经常在引物设计=_=|||)单的想象为酶遇到识别位点之后从旁边掉下去了……
个碱基以确保成功酶切。
比32时，在末端的限制性内切酶识别位点之后
再加上、改3'
成可以的引物是5‘
GCTAGCNNNNN……如你5‘CAGGCTAGCNNNNN……3' 呃……CAG是我随便加的，你可以考虑一下CG/AT含量
注释
1.如果要加在序列的5'端，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的5'端加上相应的碱基（黑色），如果要在序列的3'端加上保护碱基，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的3'端加上相应的碱基（黑色）。
2.切割率：正确识别并切割的效率。
加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基。
3.。
限制性内切酶
限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（一般4-8bp），并在此处切割DNA双链的核酸内切酶。
主要存在于原核生物，是原核生物自我保护的一种机制。
它的作用包含两类,一种是对外的,限制作用,指一定类型的细菌可以通过限制性核酸内切酶的作用,破坏入侵的外源DNA,使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制。
另一种是对内的，修饰作用，指在特定位置发生甲基化，可免遭自身限制性酶的破坏。
限制性核酸内切酶的发现是在本世纪中期，Arber等人对λ噬菌体在大肠杆菌不同菌株上的平板培养效应的研究为基础，发现了原核生物体内存在着寄主控制的限制和修饰系统。
实验是：在K株或B株大肠杆菌上生长繁殖的噬菌体λ（K）或λ（B），再次感染原寄主菌体的成斑率为1，而感染新的寄主菌株的成斑率则分别为10-4和4*10-4所以说受到了限制。
在 20 世纪 60 年代，噬菌体学家阐明了宿主限制和修饰现象的生化机制。
该研究工作在 Me-selson 和 Yuan（1968）纯化得到了大肠杆菌 K12 的限制性内切酶时达到高峰。
因为这个内切酶可以把未修饰的 DNA 切割成大的分离片段，人们认为它一定识别一个靶序列。
从而提供了对 DNA 进行可控操作的前景。
但不幸的是，K12 内切酶不具备人们希望的性质。
虽然它确实是结合到一定的区域序列上，切割却在几千个碱基对以外“随机”发生的（Yuan 等，1980）。
经过大量努力后，终于在1970 年取得了突破，人们发现了在流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）中存在一种酶，其作用更加简单（Kelly & Smith，1970；Smith & W ilcox，1970），即这个酶可以识别双链 DNA 分子中的一个特定靶序列，并在该序列之内切断多聚核苷酸链，从而产生长度和序列一定的分离片段。
突破性的进展始于 Hamilton Smith 的发现，他从嗜血流感细菌（Haemophilus influenzae）菌株 Rd中找到了一种限制性内切酶（Smith & Wilcox，1970），并阐明了它在噬菌体 T7 DNA 中切割的核苷酸序列（Kelly & Smith，1970）。
限制性内切酶
限制性内切酶限制性内切酶（又称限制酶）首先是在细菌体内发现的，但后来在部分古细菌中也发现了这种成分。
通常，限制性内切酶会切割双链DNA，每个限制性内切酶会识别特定的DNA序列，根据不同的内切酶类型，可在识别序列内或距识别序列不远的位置处切割DNA，识别序列长度通常为4-8bp，酶切之后会形成粘性末端和平末端。
上世纪50年代初期，许多研究团队观测到了噬菌体对于同一物种的不同细菌宿主菌株存在感染效率差异[1,2]，即：使用在一种细菌菌株（例如，大肠杆菌C）内繁殖的噬菌体λ感染同一种类的灵异菌株（例如大肠杆菌K），结果发现，相比于重新感染宿主菌株（大肠杆菌C），大肠杆菌K的感染率出现明显下降。
新的宿主（大肠杆菌K）似乎可以选择性抵御或“耐受”侵入的噬菌体。
研究人员还发现，这一现象并没有遗传性，因为经过一轮感染后，在新菌株中生长的噬菌体还可以以正常的感染率感染该菌株。
这种现象被称为“宿主控制变异”，有关其背后的机制也成为了频繁研究的领域[3]。
直到上世纪60年代，人们才发现宿主变异的机制，其与噬菌体DNA的酶切有关，进而发现并分理出了限制性内切酶。
上世纪60年代初Werner Arber观测发现，宿主范围内的决定性遗传物质都存在于噬菌体DNA中，而后续实验证明甲硫氨酸参与宿主的自我保护[4]。
这些发现最终催生了限制性修饰（R-M）体系的概念，通过该体系，来自于宿主的限制性内切酶和甲基化酶共同作用，切割外来病毒（非甲基化）DNA，同时保护宿主的DNA不受甲基化[5]。
随着DNA连接酶的发现以及位点特异性限制性内切酶的家族不断壮大，重组DNA 技术应运而生。
限制性内切酶的命名规则，考虑到内切酶来源的三种特性——属名、种名和菌株或血清型——组成了一个简短的名称，后面加上罗马数字，代表来自同一菌株的多个限制性内切酶[6]。
例如，以HindⅢ酶为代表：“H”代表Haemophilus“in”代表influenzae“d”代表血清型d“Ⅲ”用于区分来自于Haemophilusinfluenza血清型d的其它限制性内切酶限制性内切酶的分类，根据结构的复杂程度、识别序列、切割位点位置以及辅助因子要求，限制性内切酶分为四类：TypeⅠ：同时具有限制性和甲基化活性的多亚基蛋白需要ATP切割位点与识别位点间的间距不定TypeⅡ：特异性的识别序列切割位点位于识别序列内或邻近识别序列在切割位点生成5＇磷酸基和3＇羟基末端需要M2+TypeⅢ：由两个相反的识别序列组成切割位点与其中一个识别序列的间距恒定需要ATPTypeⅣ：仅切割甲基化的DNA切割位点大约距离识别位点30bp由于自身特殊的特点，TypeⅡ限制性内切酶已经成为分子克隆、法医学DNA分析等许多研究应用最常用的限制性内切酶。
高中生物基因工程如何选取限制酶专题练 (含答案)
2024届高三生物提分攻略：如何选取限制酶选择限制酶时需要考虑哪些因素？①为了防止目的基因、载体自身环化和及2者的反向连接，尽量选择双酶切法，选择2种限制酶。
②酶切位点位于目的基因两侧，不能破坏目的基因；③不能破坏启动子、终止子、复制起原点。
④通常选择含有目的基因的DNA片段和载体上共有的酶切位点，或者能产生相同黏性末端的限制酶；⑤若载体上有2个及以上的标记基因，为了便于筛选，通常需要破坏一个标记基因；若载体上只有1个标记基因，不破坏这个标记基因。
⑥考虑转录的方向，需要将目的基因插入载体的启动子和终止子之间，且考虑到目的基因插入后能正常转录出正确的RNA。
1、构建重组质粒时可选用四种限制酶，其识别序列如下图。
为防止酶切片段的自身环接，不可选用的限制酶组合是（）A.①③B.②③C.①④D.③④2、若要利用某目的基因（见图甲）和P1噬菌体载体（见图乙）构建重组DNA（见图丙），限制性内切核酸酶的酶切位点分别是BglⅡ（－A↓GATCT－），EcoRⅠ（－G↓AATTC－）和Sau3AⅠ（－↓GATC－）。
下列分析合理的是（）A．用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体B．用BglⅡ和EcoRI切割目的基因和P1噬菌体载体C．用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体D．用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体3、获得相关基因后，利用PCR技术进行融合得到目的基因，可选择与乳腺细胞表达载体pBC1构建重组DNA 分子。
目的基因、表达载体pBCl如图乙所示。
①PCR扩增图示目的基因时需加入种引物和酶。
②本实验应选择限制酶切割目的基因与pBCl载体，将酶切产物正确连接后形成重组DNA分子，以便后续通过荧光检测筛选。
4、人胰岛素基因表达的最初产物是一条肽链构成的前胰岛素原，经加工后形成具有两条肽链（A链和B链）的有生物活性的胰岛素。
此后科学家又提出了利用基因工程改造大肠杆菌生产人胰岛素的两种方法：“AB”法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素；“BCA”法是利用人体某细胞中的mRNA得到胰岛素基因，表达出胰岛素原后再用特定酶切掉C肽段。
基因工程中常用的三种工具酶
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）1．定义：凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶，也称为限制酶（restriction enzyme，RE）。
2．类型：来自原核生物，有三种类型。
Ⅰ型：兼具甲基化修饰和ATP参与的核酸内切酶活性，随机切割。
Ⅱ型：大多能特异识别4～6个核苷酸序列（回文结构），最大识别序列为8个核苷酸，如SfiI、NotI；但有近10种Ⅱ型限制酶的识别序列为非回文结构，如SfaNI、MnlI等，Ⅱ型限制酶均可作为基因工程的工具酶。
另有一些来源不同的限制酶的识别位点是相同的核苷酸序列，将这类酶特称为同工异源酶（isoschizomers）或同裂酶。
同工异源酶切割产生相同的末端；有一些同工异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，故可用来研究DNA 甲基化作用，如SmaI和XmaI；HpaII和MspI；MboI和Sau3AI是成对的同工异源酶；其中HpaII和MspI是一对同工异源酶，其识别位点是CCGG。
与同工异源酶对应的一类限制酶，它们虽然来源各异，识别序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称为同尾酶（isocaudamers）。
常用的限制酶BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。
显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。
但必须指出，由两种同尾酶消化产生的粘性末端，重组之后所形成的序列结构再不能被原来的任何一种同尾酶所识别。
Ⅲ型：功能基本同Ⅰ型，但为特定位点切割。
三种限制酶的区别如下表所示：Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型DNA底物dsDNA dsDNA dsDNA辅助因子Mg2+,A TP,SAM Mg2+ Mg2+,A TP识别序列特异特异特异切割位点非特定（于识别序列前后100~1000bp范围之内）特定（切割于识别序列之中或近处，固定位点）特定（切割点在识别序列后25~75bp处）与甲基化作用的关系内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用酶蛋白不具有甲基化作用内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用3．命名：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株。
限制性内切酶
4 的存活率是由宿主修饰系统作用的结果，此时限制系统还未起作用。而
在 C 菌株不能限制来自 K 和 B 菌株的 DNA 。限制作用实际就是限制酶
降解外源 DNA ，维护宿主遗传稳定的保护机制。甲基化是常见的修饰作
用，可使腺嘌呤 A 成为 N6 甲基-腺膘呤，胞嘧啶 C 成为 5' 甲基胞嘧啶
。通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。
用 20 单位（Units）限制酶切割 1g 标记的寡核苷酸做测试时，发现 不同的酶对识别序列两端的长度有不同的要求（表 2-3）。相对来说， EcoRⅠ 对两端的序列长度要求较小，在识别序列外侧有一个碱基对时在 2 小时的切割活性可达 90% 。而 AccⅠ 和 HindⅢ 对两端的序列长度要 求较大。
2020/4/27
2020/4/27
定义和命名
• DNA限制性内切酶： 生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列 的一种内切核酸酶。它可以将外来的DNA切 断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之 失去活力，但对自己的DNA却无损害作用， 这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种 切割作用是在DNA分子内部进行的，故有专一性，是随机的。如 EcoK 和 EcoB
。其限制酶和甲基化酶 （即 R 亚基和 M 亚基） 各作为一个亚基存在于
酶分子中，另外还有负责识别 DNA 序列的 S 亚基，分别由 hsdR、
hsdM 和 hsdS 基因编码，属于同一操纵子（转录单位）。EcoK 编码基
因的结构为 R2M2S。 EcoB 编码基因的结构为 R2M4S2 。
SfiⅠ GGCCNNNN↓NGGCC
以上序列中部 分字母代表的碱基如下。
R=A 或 G
Y=C 或 T
限制酶bamhi识别序列
限制酶bamhi识别序列全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：BamHI酶是最常用的限制酶之一，在分子生物学领域被广泛应用于DNA分子的切割和连接。
BamHI酶的识别序列为5'-GGATCC-3'，具有非常高的识别特异性和切割效率。
在实验室中，研究人员常常需要使用BamHI酶来对DNA分子进行特定的切割，以便进行进一步的实验操作。
BamHI酶的识别序列非常短，只有6个碱基对，但却能够在DNA 分子中非常准确地识别并切割特定的DNA序列。
这种高度特异性的作用是由于BamHI酶的结构和活性机制所决定的。
BamHI酶是一种双链DNA切割酶，它可以同时切割DNA分子的两条链，形成具有“突出末端”的DNA断裂。
这种特殊的切割方式使得BamHI酶可以在切割后方便地用于DNA连接实验。
BamHI酶的识别序列为5'-GGATCC-3'，其中GGATCC是酶的具体识别部位。
在DNA序列中，只有当该识别序列被BamHI酶完全识别时，酶才能够进行切割作用。
由于BamHI酶对识别序列的要求非常严格，即使是一个碱基对的差错也会导致酶无法进行切割。
在实验操作中，研究人员需要非常小心地设计和检查DNA序列，确保BamHI 酶能够准确识别和切割目标序列。
除了识别序列的准确性外，BamHI酶的切割效率也是研究人员需要考虑的重要因素之一。
在实验操作中，一般情况下会根据需要调节BamHI酶的酶活性和反应条件，以确保DNA分子能够被完全切割。
由于BamHI酶的酶活性受到许多因素的影响，如酶的来源、纯度和保存状态等，研究人员在实验操作中需要仔细控制这些因素，以确保实验结果的准确性和可靠性。
第二篇示例：限制酶（Restriction Enzyme）是一种能够识别和切割DNA特定序列的酶类，广泛应用于分子生物学和基因工程领域。
BamHI是一种常用的限制酶，它具有识别并切割GGATCC序列的能力。
本文将主要讨论BamHI限制酶的特点及其在科研实验中的应用。
专题9 现代生物科技专题 精研重难点(2) 基因工程中限制酶的选取与基因表达载体的构建
(4)启动子是一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别 和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得需要的蛋白质。 答案：(1)EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ、Sma Ⅰ和EcoR Ⅴ (2)磷酸二酯键 (3)自我复制 一个至多个限制酶切割位点 用含有该抗生素的 培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞 (4)位于基因首端的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱 动转录过程
精研重难点(二) 基因工程中限制酶的选取与基因表达载体的构建
从“高度”上研究高考
[典例] (2021·福建高考)微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫 蛋白(MT)是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。 科研人员将枣树的MT基因导入大肠杆菌构建工程菌。回答下列问题：
(1)根据枣树的MT cDNA的核苷酸序列设计了相应的引物(图1甲)，通过 PCR扩增MT基因。已知A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的 基因位置。选用的引物组合应为__________。
B．NdeⅠ和XbaⅠ D．EcoRⅠ和KpnⅠ
解析：构建重组质粒时，要将目的基因插入到启动子和终止子之间，而且不能 破坏启动子、终止子、复制原点、抗生素抗性基因等部位。故只能选用Nde Ⅰ 和BamH Ⅰ切割质粒，因此在PCR扩增的该基因的两端需分别引入Nde Ⅰ和 BamH Ⅰ两种限制酶的识别序列。 答案：A
[解析] (1)密码子位于 mRNA 上，是决定氨基酸的三个相邻碱基，起始密 码子和终止密码子分别控制翻译的开始和结束，故为保证基因的正常表达，一对 引物应分别位于 A 位点和 B 位点的外侧。
(2)①为得到平末端，可用EcoRⅤ或SmaⅠ切割载体P，但后续需进一步将重组 载体P′中的MT基因接入载体E，此时需将MT基因插入XhoⅠ和PstⅠ两个酶切 位点之间，故选EcoRⅤ将载入体P切开；由于E.coli DNA连接酶只能连接黏性 末端，而T4 DNA连接酶既可以连接黏性末端又可以连接平末端，结合题意可知， MT基因的末端为平末端，故需要用T4 DNA连接酶将MT基因与载体P相连，构 成重组载体P′。②由图1可知，载体P′不含有表达MT基因的启动子和终止子； 为避免自身环化和反向连接，可选用两种酶切割两种载体，据图1可知，载体 P′和载体E均含有Xho Ⅰ和Pst Ⅰ酶切位点，故可选用Xho Ⅰ和Pst Ⅰ酶进行酶 切；将目的基因导入大肠杆菌的方法是感受态细胞法，需用钙离子处理大肠杆 菌。(3)由于尚未在个体生物学水平上对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定， 故即使MT工程菌的MT蛋白相对表达量较高，也无法说明已经成功构建能较强 吸附废水中重金属的MT工程菌。
限制性内切酶小知识
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简介
限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease):识别并切割 特异的双链DNA序列的一种内 切核酸酶。 [别名] Endodeoxyribonuclease [酶反应] 限制性内切酶能分 裂DNA分子在一限定数目的专 一部位上。它能识别外源DNA 并将其降解。 [单位定义] 在指明pH与37℃，在0.05mL反应混合物中， 1小时消化1μg的λDNA的酶量为1单位。
特征和种类
1．限制与修饰现象 早在 50 年代初，有许多学者发现了限制与修饰现象，当时称作寄主 控制的专一性（host controlled specificity）。 l 噬菌体表现的现 象便具有代表性和普遍性，其在不同宿主中的转染频率可说明这一问题 （表 2-1）。 l 在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时会受到限制。 E.coli 菌株 λ噬菌体感染率 lK lB lC E.coli K 1 10-4 10-4 E.coli B 10-4 1 10-4 E.coli C 1 1 1 说明 K 和 B 菌株中存在一种限制系统，可排除外来的 DNA 。 104 的存活率是由宿主修饰系统作用的结果，此时限制系统还未起作用。 而在 C 菌株不能限制来自 K 和 B 菌株的 DNA 。限制作用实际就是限 制酶降解外源 DNA ，维护宿主遗传稳定的保护机制。甲基化是常见的 修饰作用，可使腺嘌呤 A 成为 N6 甲基-腺膘呤，胞嘧啶 C 成为 5' 甲 基胞嘧啶。通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目 的。
3．限制酶切割的位置 限制酶对 DNA 的切割位置大多数在内部，但也有在外部的。在外部的， 又有两端、两侧和单侧之别。切点在两端的有 Sau3AⅠ（↓GATC）、 NlaⅢ（CATG↓）和 EcoRⅡ（↓CCWGG） 等；在两侧的有 BcgⅠ[（10/12）CGA（N）6TGC（12/10）]和 TspRⅠ （CASTGNN↓）， BcgⅠ 酶的切割特性与其它酶不同，它们在识别位点 的两端各切开一个断点，而不是只产生一个断点。切点在识别位点外侧的还 有 BbvⅠ[GCAGC（8/12）] 和 BspMⅠ[ACCTGC（4/8）] 等。 BcgⅠ ↓10（N）CGA（N）6TGC（N）12↓； ↑12（N）CGA（N）6ACG（N）10↑ TspRⅠ NNCAC（G）TGNN↓ ↑NNGTG（C）ACNN
常见限制性内切酶识别序列
常见限制性内切酶识别序列(酶切位点)（BamHI、EcoRI、HindIII、NdeI、XhoI等）Time：2009-10-22 PM 15:38Author:bioer Hits: 7681 times在分子克隆实验中，限制性内切酶是必不可少的工具酶。
无论是构建克隆载体还是表达载体，要根据载体选择合适的内切酶（当然，使用T 载就不必考虑了）。
先将引物设计好，然后添加酶切识别序列到引物5' 端。
常用的内切酶比如BamHI、EcoRI、HindIII、NdeI、XhoI等可能你都已经记住了它们的识别序列，不过为了保险起见，还是得查证一下。
下面是一些常用的II型内切酶的识别序列，仅供参考。
先介绍一下什么是II型内切酶吧。
The Type II restriction systems typically contain individual restriction enzymes and modification enzymes encoded by separate genes. The Type II restriction enzymes typically recognize specific DNA sequences and cleave at constant positions at or close to that sequence to produce 5-phosphates and 3-hydroxyls. Usually they require Mg 2+ ions as a cofactor, although some have more exotic requirements. The methyltransferases usually recognize the same sequence although some are more promiscuous. Three types of DNA methyltransferases have been found as part of Type II R-M systems forming either C5-methylcytosine, N4-methylcytosine or N6-methyladenine.酶类型识别序列ApaIType II restrictionenzyme5'GGGCC^C 3'BamHIType II restrictionenzyme5' G^GATCC 3'BglIIType II restrictionenzyme5' A^GATCT 3'EcoRIType II restrictionenzyme5' G^AATTC 3'HindIIIType II restrictionenzyme5' A^AGCTT 3'KpnIType II restrictionenzyme5' GGTAC^C 3'NcoIType II restrictionenzyme5' C^CATGG 3'NdeIType II restrictionenzyme5' CA^TATG 3'NheIType II restrictionenzyme5' G^CTAGC 3'NotIType II restrictionenzyme5' GC^GGCCGC 3'SacIType II restrictionenzyme5' GAGCT^C 3'SalIType II restrictionenzyme5' G^TCGAC 3'SphIType II restrictionenzyme5' GCATG^C 3'XbaIType II restrictionenzyme5' T^CTAGA 3'XhoIType II restrictionenzyme5' C^TCGAG 3'要查找更多内切酶的识别序列，你还可以选择下面几种方法：1. 查你所使用的内切酶的公司的目录或者网站；2. 用软件如：Primer Premier5.0或Bioedit等，这些软件均提供了内切酶识别序列的信息；3. 推荐到NEB的REBASE数据库去查（网址：/rebase/rebase.html）当你设计好引物，添加上了内切酶识别序列，下一步或许是添加保护碱基了，可以参考：NEB公司网站提供的关于设计PCR引物保护碱基参考表下载（也可见图片）双酶切buffer的选择（MBI、罗氏、NEB、Promega、Takara）再给大家推荐一种新的不需要连接反应的分子克隆方法，优点包括：①设计引物不必考虑选择什么酶切位点；②不必考虑保护碱基的问题；③不必每次都选择合适的酶来酶切质粒制备载体；④而且不需要DNA连接酶；⑤假阳性几率低（因为没有连接反应这一步，载体自连的问题没有了）。
把dna切成片段所用的酶
把dna切成片段所用的酶DNA切割是分子生物学领域中最基础且关键的技术之一。
而用于切割DNA的酶主要有限制酶（restriction enzymes）和内切酶（endonucleases）。
本文将对这两种酶进行介绍，以生动、全面、有指导意义的方式。
限制酶是一类存在于细菌和古细菌中的酶，可以识别DNA分子中特定的核酸序列，并在该序列附近切割DNA，产生切割的片段。
这些限制酶的命名通常以菌株名称和酶名的第一、第二个字母组合而成。
限制酶可识别的DNA序列通常为4至8个碱基对长，形式多样，如DNA的两链可以对称切割，并产生平端的片段，也可以非对称切割，生成具有粘性末端的片段。
例如，最常用的限制酶之一是EcoRI，它可以识别并切割DNA序列为5'-GAATTC-3'的部分。
内切酶与限制酶有些相似，但是内切酶可以识别并切割DNA链内的特定核酸序列，而无需关心特定的内外侧链。
这使得内切酶使用更加灵活，并且可以在不同的DNA序列中进行切割。
内切酶也可以生成平端或粘性末端的DNA片段。
例如，最常用的内切酶是AluI（AGCT）、HaeIII（GGCC）和MspI（CCGG）。
DNA切割过程一般在限制酶或内切酶的作用下进行。
首先，这些酶会识别并结合到DNA分子中的特定序列。
然后，它们通过水解作用切断DNA链，并在特定的核酸残基上形成磷酸二酯键。
这个过程不会改变DNA序列的基本结构，只会切割成两段或以上的DNA片段。
切割后的DNA片段可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离和检测。
DNA切割技术在现代分子生物学研究中应用广泛。
通过识别和切割DNA序列，科学家可以定位和分离特定的基因或DNA片段，进行遗传工程和基因编辑等研究。
此外，DNA切割技术也能用于分析DNA序列的变异和基因重组等研究领域。
总结起来，DNA切割的关键酶主要包括限制酶和内切酶。
限制酶可以识别并切割DNA上特定的核酸序列，而内切酶则可以切割DNA链内的特定核酸序列。
限制性内切酶原理
限制酶消化DNA底物的反应效率，很大程度上取决于所使用的DNA的纯度。DNA制剂中的含有蛋白质、酚、氯仿、酒精、EDTA、SDS以及高浓度的盐离子等都有可能抑制限制酶的活性。
提高限制酶对低纯度DNA的反应效率，一般采用三种方法： ①增加限制酶的用量。 ②扩大酶催化反应的体积。（以使潜在的抑制因素被相应地稀释） ③延长酶催化反应的保温时间。
30多年前，当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限制性内切酶。细菌可以抵御新病毒的入侵，而这种“限制”病毒生存的办法则可归功于细胞内部可摧毁外源DNA的限制性内切酶。首批被发现的限制性内切酶包括来源于大肠杆菌的EcoR I和EcoR II，以及来源于流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）的Hind II和Hind III。这些酶可在特定位点切开DNA，产生可体外连接的基因片段。
限制酶的种类
I型限制酶 通常其切割位点与识别位点相距千个碱基, 不能准确定位切割位点。例如：EcoB、EcoK。 II型限制酶 所识别的序列多为短的回文序列，切割位点与识别位点一致。是基因工程上，实用性较高的限制酶种类。例如：EcoRI、HindIII。 III型限制酶 切割位点与识别位点相距24-26个碱基，不能准确定位切割位点。例如：EcoPI、HinfIII。
HaeⅠ的识别序列
NotⅠ 的识别序列
5’粘性末端和3’粘性末端
5’NNNGC-OH P-GGCCGC NNN3‘ 3’NNNCGCCGG-P HO-CGNNN5 ‘
5’粘性末端
3’粘性末端
5’NNGGTAC-OH P-CNN3‘ 些限制酶识别的序列不是回文序列。 AccⅠ 的识别切割位点分别是GTAGAC 和 GTCTAC BbvCⅠ 的识别切割位点分别为CCTCAGC和GGAGTCG
限制酶识别序列的特点
限制酶识别序列的特点限制酶识别序列的特点及其在基因工程中的应用一、引言限制酶识别序列是指一类特殊的DNA序列，它们可以被特定的酶识别并切割。
限制酶是一类能够识别、结合并切割DNA特定序列的酶，它在基因工程中具有重要的应用价值。
本文将从限制酶识别序列的特点出发，结合标题中心扩展下的描述，详细阐述限制酶识别序列的特点及其在基因工程中的应用。
1. 特异性：每种限制酶识别序列都具有特异性，即只能识别并切割特定的DNA序列。
不同的限制酶对应不同的识别序列，这也是限制酶在基因工程中被广泛应用的原因之一。
通过选择不同的限制酶，可以实现对DNA分子的特定切割和连接。
2. 对称性：限制酶识别序列通常是对称的，即其两端的序列相同或互补。
例如，EcoRI限制酶识别序列为5'-GAATTC-3'，其互补序列也为5'-GAATTC-3'，在DNA链的两侧都具有相同的序列。
这种对称性使得限制酶能够切割DNA分子的两条链，形成粘性或平滑的末端。
3. 长度差异：不同的限制酶识别序列长度不同，一般为4-8个碱基对。
限制酶识别序列的长度差异决定了其在DNA分子上的特异性和切割效果。
较短的限制酶识别序列通常具有较高的特异性，但切割效果可能不如较长的限制酶识别序列理想。
4. 识别位点：限制酶通过与DNA序列特定的识别位点结合，并在该位点上切割DNA分子。
识别位点可以是完全匹配的序列，也可以包含一定的碱基对变异。
限制酶的结合和切割活性都与识别位点密切相关。
5. 切割方式：限制酶切割DNA分子的方式分为两种，一种是粘性末端切割，即在识别位点的两侧切割，形成具有互补序列的粘性末端；另一种是平滑末端切割，即在识别位点的两侧切割，形成平滑的末端。
不同的限制酶具有不同的切割方式，这也是限制酶在DNA 重组和连接中的应用差异之一。
三、限制酶识别序列在基因工程中的应用1. DNA分子的切割：限制酶可以识别并切割DNA分子，形成特定的DNA片段。
1978诺贝尔——限制酶
1978年诺贝尔生理学或医学奖得主
阿尔伯(Werner Arber 1929～)瑞士生物 学家，史密斯(Hamilton O．Smith 1931～) 美国微生物学家，内森斯(Daniel Nathans 1928～1999)美国微生物学家，由于限制性 核酸内切酶的发现及其在分子遗传学中的 应用，为遗传工程的产生拉开了序幕而获 得1978年诺贝尔生理学或医学奖。
• Arber discovered restriction enzymes. He postulated that these enzymes bind to DNA at specific sites containing recurring structural elements made up of specific basepair sequences. • Smith verified Arber's hypothesis with a purified bacterial restriction enzyme and showed that this enzyme cuts DNA in the middle of a specific symmetrical sequence. Other restriction enzymes have similar properties, but different enzymes recognize different sequences.
限制酶识别的序列
1．限制酶识别序列的长度 限制酶识别序列的长度一般为 4-8 个碱基，最常见的为 6 个碱基。当识别序列为 4 个和 6 个碱基时，它们可识别的序列在完全随机的情况下，平均每 256 个和 4096 个碱 基中会出现一个识别位点（44=256，46=4096）。以下是几个有代表性的种类，箭头指切 割位置。 4 个碱基识别位点：Sau3AⅠ ↓GATC 5 个碱基识别位点：EcoRⅡ ↓CCWGG NciⅠ CC↓SGG 6 个碱基识别位点：EcoRⅠ G↓AATTC HindⅢ A↓AGCTT 7 个碱基识别位点：BbvCⅠ CC↓TCAGC PpuMⅠ RG↓GWCCY 8 个碱基识别位点：NotⅠ GC↓GGCCGC SfiⅠ GGCCNNNN↓NGGCC 以上序列中部分字母代表的碱基如下： R=A 或 G Y=C 或 T M=A 或 C K=G 或 T S=C 或 G W=A 或 T H=A 或 C 或 T B=C 或 G 或 T V=A 或 C 或 G D=A 或 G 或 T N=A 或 C 或 G 或 T
限制性酶识别序列
限制性酶的识别序列Enzyme Name SequenceAatI AGGCCTAatII GACGTCAccI GTMKACAccII CGCGAccIII TCCGGAAcyI GRCGYCAflI GGWCCAflII CTTAAGAflIII ACRYGTAhaI CCSGGAhaII GRCGYCAhaIII TTTAAAAluI AGCTAlwI GGATCNNNNAlwI NNNNNGATCCAlwNI CAGNNNCTGAocI CCTNAGGAocII GDGCHCAosI TGCGCAAosII GRCGYCApaI GGGCCC ApaLI GTGCAC ApyI CCWGG AquI CYCGRG AseI ATTAATAspI GAANNNNTTC AspI GGTACCAspI GACNNNGTC AsuI GGNCC AsuII TTCGAA AvaI CYCGRG AvaII GGWCC AvaIII ATGCATAvrI CYCGRG AvrII CCTAGGAxyI CCTNAGG BalI TGGCCA BamHI GGATCC BanI GGYRCC BanII GRGCYC BanIII ATCGATBbeI GGCGCCBbiII/AcyI GRCGYCBbvI GCAGCNNNNNNNNBbvI NNNNNNNNNNNNGCTGC BbvII GAAGACNNBbvII NNNNNNGTCTTCBcefI ACGGCNNNNNNNNNNNN BcefI NNNNNNNNNNNNNGCCGT BclI TGATCABcnI CCSGGBglI GCCNNNNNGGCBglII AGATCTBinI NNNNNGATCCBinI GGATCNNNNBsePI GCGCGCBsmAI GTCTCBsmAI GAGACBsmI GAATGCNBsmI GCATTCBspI GDGCHCBspHI TCATGABspMI ACCTGCNNNNBspMI NNNNNNNNGCAGGTBspMII TCCGGABsrI ACTGGNBsrI CCAGTBssHII GCGCGCBstBI TTCGAABstEII GGTNACCBstI GGATCCBstNI CCWGGBstPI GGTNACCBstUI CGCGBstXI CCANNNNNNTGG BstYI RGATCYBsuI CCTNAGGCcrI CTCGAGCfoI GCGCCfrI RCCGGYCfrI GGNCCCfrI YGGCCRClaI ATCGATCviJI RGCYCvnI CCTNAGGDdeI CTNAGDpnI GATCDraI TTTAAADraII RGGNCCYDraIII CACNNNGTG DsaI CCRYGGEaeI YGGCCREagI CGGCCGEarI CTCTTCEarI GAAGAGEclXI CGGCCGEcoI TACGTAEcoI GGTCTCNEcoI NNNNNGAGACC EcoI GGWCCEcoIII AGCGCTEcoI CGGCCGEcoI CTGAAGEcoI CTTCAGEcoI CCTNAGGEcoNI CCTNNNNNAGG EcoOI RGGNCCYEcoRI GAATTCEcoRII CCWGGEcoRV GATATCEcoTI CCWWGGEcoTI ATGCATEcoTI GRGCYCEheI GGCGCCEspI GCTNAGCFinI GTCCCFinI GGGACFnuHI GCNGCFokI GGATGNNNNNNNNNFokI NNNNNNNNNNNNNCATCC FspI TGCGCAGdiII NNNNNYGGCCGGdiII CGGCCRNGsuI CTCCAGGsuI CTGGAGHaeI WGGCCWHaeII RGCGCYHaeIII GGCCHapII CCGGHgaI GACGCNNNNNHgaI NNNNNNNNNNGCGTC HgiAI GWGCWCHgiEII ACCNNNNNNGGT HhaI GCGCHinI GRCGYCHinPI GCGCHincII GTYRACHindIII AAGCTTHinfI GANTCHpaI GTTAACHpaII CCGGHphI GGTGANNNNNNNN HphI NNNNNNNTCACC KpnI GGTACCKspI CTCTTCNKspI NNNNGAAGAGMaeI CTAGMaeII ACGTMaeIII GTNACMboI GATCMboII GAAGANNNNNNNN MboII NNNNNNNTCTTCMfeI CAATTGMflI RGATCYMluI ACGCGTMmeI TCCRACMmeI GTYGGAMnlI CCTCNNNNNNN MnlI NNNNNNNGAGG MroI TCCGGAMseI TTAAMspI CCGGMstI TGCGCAMstII CCTNAGGMvaI CCWGGNaeI GCCGGCNarI GGCGCCNciI CCSGGNcoI CCATGGNdeI CATATGNdeII GATCNheI GCTAGCNlaIII CATGNlaIV GGNNCCNruI TCGCGANsiI ATGCATNsp()I RCATGYNsp()V TTCGAANspBII CMGCKGNspII GDGCHCNspIII CYCGRGNspIV GGNCCNunII GGCGCCPaeR CTCGAGPalI GGCCPflMI CCANNNNNTGG PleI GAGTCNNNN PleI NNNNNGACTC PmaCI CACGTG PpuMI RGGWCCY PstI CTGCAGPvuI CGATCGPvuII CAGCTGRsaI GTACRsrI GAATTCSacI GAGCTCSacII CCGCGGSalI GTCGACSauAI GATCSauI GGNCCSauI CCTNAGGScaI AGTACTScrFI CCNGGSduI GDGCHCSecI CCNNGGSexI CTCGAGSfaNI GCATCNNNNN SfaNI NNNNNNNNNGATGC SfiI GGCCNNNNNGGCC SinI GGWCCSmaI CCCGGGSnaBI TACGTASnaI GTATACSpeI ACTAGTSphI GCATGCSplI CGTACGSspI AATATTSstI GAGCTCSstII CCGCGGSstIII ACGTStuI AGGCCTStyI CCWWGGStySJI GAGNNNNNNGTRC StySJI GYACNNNNNNCTCTaqI TCGATaqII GACCGANNNNNNNNNNN TaqII NNNNNNNNNTCGGTC TaqII CACCCANNNNNNNNNNN TaqII NNNNNNNNNTGGGTG ThaI CGCGTspI GTSACTspEI AATTTthI GACNNNGTCTthII CAARCANNNNNNNNNNN TthII NNNNNNNNNTGYTTG TthHBI TCGAVspI ATTAATXbaI TCTAGAXcyI CCCGGGXhoI CTCGAGXhoII RGATCYXmaI CCCGGG XmaIII CGGCCGXmnI GAANNNNTTC XorII CGATCG。
基因工程中常用的酶分类和性质
3’
3‘ A
5’
T4 DNA Ligase
5‘ G G A T C T 3‘ C C T A G A
3’ • 连 接 处 不 再 是 内 切 酶识别序列
5’
• BamH Ⅰ/ Bgl Ⅱ • Sal Ⅰ/ Xho Ⅰ • Spe Ⅰ/ Xba Ⅰ
三、限制酶的识别序列与DNA的切割
（P47） • 1、限制酶的识别序列与DNA的来源无关，不具有种的特
基因工程中常用的 酶分类和性质
• 一、限制性核酸内切酶 • 二、连接酶 • 三、聚合酶 • 四、修饰酶
第一节 限制性核酸内切酶 (Restriction enzyme)
基因的剪刀
----------------限制性内切酶
• 核酸酶（P41-42)：切割相邻的两个核苷酸残基间的磷
酸二酯键导致多核苷酸链共价键断裂的一类水解酶。可分 为核糖核酸酶与脱氧核糖核酸酶。
• 具3’突出未端的粘性未端
5‘ 3‘
5‘ 3‘
GAGCTC CT CGAG
Sac Ⅰ
G A G C T 3’
5’ C
C 5’
3’ T C G A G
3’ 5’
3’ 5’
• KpnⅠ (5’ ··· GGTAC^ C ··· 3’) • PstⅠ (5’ ··· CTGCA^ G ··· 3’) • SacⅠ (5’ ··· GAGCT^ C ··· 3’)
化酶亚基分开
能酶
识别位点 4～6bp 序列
5～7bp
两侧对称或不对称
常为回文
不对称序列
剪切位点 在限制位点
限制位点上游 离限制位点 >1000
24～26bp 处 bp 的非特异位点
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二轮小专题
限制酶识别序列
一．回文诗：
静思伊久阻归期，
久阻归期忆别离；
忆别离时闻漏转，
时闻漏转静思伊。
赏花归去马如飞，
去马如飞酒力微。
酒力微醒时已暮，
醒时已暮赏花归。
二．DNA回文序列
限制性内切酶Ⅱ类酶有EcoR I、BamH I、Hind Ⅱ、Hind Ⅲ等。
其分子量小于105道尔顿；反应只需Mg2+；最重要的是在所识别的特定碱基顺序上有特异性的切点，因而DNA分子经过Ⅱ类酶作用后，可产生特异性的酶解片断，这些片断可用凝胶电泳法进行分离、鉴别。
限制性内切酶识别DNA序列中的回文序列。
有些酶的切割位点在回文的一侧（如EcoR I、BamH I、Hind等），因而可形成粘性末端，另一些Ⅱ类酶如Alu I、BsuR I、Bal I、Hal Ⅲ、HPa I、Sma I等，切割位点在回文序列中间，形成平整末端。
Alu I的切割位点如下：5'-A G^C T-3'
3'-T C^G A-5'
酶类型识别序列
ApaI Type II restriction enzyme 5'GGGCC^C 3' BamHI Type II restriction enzyme 5' G^GATCC 3' BglII Type II restriction enzyme 5' A^GATCT 3' EcoRI Type II restriction enzyme 5' G^AATTC 3' HindIII Type II restriction enzyme 5' A^AGCTT 3' KpnI Type II restriction enzyme 5' GGTAC^C 3' NcoI Type II restriction enzyme 5' C^CATGG 3' NdeI Type II restriction enzyme 5' CA^TATG 3' NheI Type II restriction enzyme 5' G^CTAGC 3' NotI Type II restriction enzyme 5' GC^GGCCGC 3' SacI Type II restriction enzyme 5' GAGCT^C 3' SalI Type II restriction enzyme 5' G^TCGAC 3' SphI Type II restriction enzyme 5' GCATG^C 3' XbaI Type II restriction enzyme 5' T^CTAGA 3' XhoI Type II restriction enzyme 5' C^TCGAG 3'。