6.细菌内毒素检查剖析.

3.对照
PC－阳性对照
－－2λ内毒素溶液
PPC－供试品阳性对照 －－含2λ内毒素溶液的供试品
NC－阴性对照
－－BET水
4.检查
S PC PPC NC 各两支
将安瓿瓶中溶液轻轻 混匀后，封口膜封口，垂直 放入37±1℃水浴中，保温 60±2分钟。
细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种 脂多糖（Lipoply Saccharide）和微量蛋白 （Protein）的复合物其化学成份主要是由O特异性链、核心多糖、类脂A三部分组成。
COOH
(三)呈色反应
1）羟肟酸铁反应——β–内酰胺环
6-aminopenicillanic 简称6-APA
acid,
O
7
7
NN4
3 CHC3 H3
氢化4 噻唑环3 COCOOHOH
青霉素类
O
母母核（：66－-氨氨基基青青霉霉烷烷酸酸）
RRCCONOHNH＊7
＊6
7
6
1 S
S
1
22
7-aminocephalosporanic acid, 简称7-ACA
概述
1.抗生素（antibiotics）
在低微浓度下即可对某些生物（病原微生物）的 生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称
2.分类
β–内酰胺类(青霉素类、头孢菌素类) 氨基糖苷类(链霉素、庆大霉素、依替米星) 四环素类(四环素、金霉素、土霉素) 大环内酯类(红霉素、螺旋霉素、麦迪霉素) 多烯大环类(制霉菌素、两性霉素B) 多肽类(多黏菌素、放线菌素)
细菌内毒素检查
王文洁
一、试剂及仪器
注射用头孢他啶 鲎试剂（λ—标示灵敏度），细
菌内毒素标准品，细菌内毒素检 查用水（BET水），仪器（严格 消毒）
质量标准： 《中国药典》（2005年版）第二部
p135 细菌内毒素检查法：附录Ⅺ
二、实训内容
1.细菌内毒素标准溶液的制备
0.2
0.2
0.9
0.9
细菌内毒素检查 －－鲎试剂法
美国药典近800种药物要用细菌内毒素检查 法来做为质量控制手段。
我国药典至2005年版正式收载了需“细菌 内毒素检查法”品种达234种。
2005版《中国药典》二部收载的 细菌内毒素检查法部分品种表
药品名称 甘露醇注射液 右旋糖酐70氯化钠注
射液 甲硝唑注射液 注射用头孢他啶 注射用苄星青霉素
0.9
150
15
1.0
0.5
0.25
0.125
1.8BET 2.8BET
0.9BET
0.9BET
0.9BET
2λ
λ
0.5λ 0.25λ
2.供试品溶液的制备
供试品的最大有效稀释倍数（MVD） MVD＝C×L／λ
C -- 为供试品的浓度（当L以EU/ml表示时，C取1.0ml/ml） L -- 为供试品的细菌内毒素限值，EU／ml λ -- 鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml）
CH3 COOH
阿莫西林
CH COHN NH2
O
头孢氨苄
Sຫໍສະໝຸດ Baidu
N CH3
COOH
CH COHN NH2
O
S
N CH3
COOH
头孢拉定
HO
S
CH COHN NH2
O
CH2
CONH
S N
CH3 COOH
S
N
头孢羟氨苄
头孢噻吩钠
CH2COONa
COONa
RRCCOONHHN
＊6 6
＊
5
5
1
SS
1 2
2CH3CH3
鲎试剂法局限性
对革兰阴性杆菌以外的内毒素不够灵敏。
原理
LAL中的B因子
活化的B因子
（鲎变形细胞溶解物） 内毒素、Ca2+
凝固酶
凝固酶原
凝固原(可凝性蛋白)
凝固蛋白（凝固素)
凝胶
细菌内毒素检查有两种方法：
凝胶法
光度测定法:包括浊度法和显色基质法
• 细菌内毒素检查可使用其中任何一种方法 进行试验。当测定结果有争议时，除有专 门说明外，以凝胶法结果为准。
素
类某些氧酸 化、剂碱、 、 金属青 离霉子素 、温酶度 降 失
解 效
头
孢
菌
素
类酸 、碱 、胺 类
内酰胺酶
降 失
解 效
Identification
(一)色谱法 HPLC (tR)
TLC (Rf) IR
(二)光谱法 UV
S
CH3
HO
CH
COHN
CH3
NH2
N O
O8
O
N5
3
N 5
43 4
CCHH2R2R1 1
COOH
头孢菌素类
氢化噻嗪环 COOH
母核：（7-－氨氨基基头头孢孢菌菌烷烷酸酸）?
结构与性质
1.酸性（羧基） pKa 2.5-2.8，酸性较强。碱金属盐水
溶性好，有机碱盐难溶于水。
6
1 5S
2 CH3
CH2
COHN
CH3
7
N 4
O
3 COOK
CH2
药品名称
限值
乙型脑炎灭活疫苗
100EU/微克
人用狂犬病疫苗（地鼠 100EU/每1次人
肾细胞）
用剂量
重组乙型肝炎疫苗（酵 母）成品
10EU/ ml
注射用重组人干扰素γ 10EU/每1次人用
成品
剂量
注射用重组人白介素-2 10EU/每1次人用
成品
剂量
页码 34 95
115
225
227
鲎试剂法优点
快速、简便、经济、灵敏度高、重现性好、 一次可同时测几个样品。
6
1 5S
2 CH3
COHN
普鲁卡因
CH3
7
N 4
O
3 COOH
2.手性C （旋光性）
﹡﹡ 65 7N 4 O
S 1
2
3﹡
﹡﹡ 76
S 12
8
N 5
4
3
O
3.UV
青霉素类：苯环取代基 头孢菌素类：母核有共轭结构
260nm
4. β–内酰胺环(四元环张力+酰胺键 )
干燥条件较稳定，溶液不稳定
青
霉
谷氨酸钾注射液
维生素C注射液
限值 2.5 EU/g 0.5 EU/ml
0.35 EU/mg 0.1 EU/mg 0.25 EU/1000单位 0.012 EU/mg 2.5 EU/ml
页码 72 91
124 135 228 269 671
2005版《中国药典》三部收载的 细菌内毒素检查法部分品种表
3.来源
生物合成（发酵） 化学合成或半合成
4.特点
化学纯度较低 活性组分易发生变异 稳定性差
5.抗生素质量分析——生物学法、物理化学法
鉴别：理化方法、微生物法 检查：水分、pH值、异常毒性、热原、细菌内毒素、
降压物质等
含量/效价测定： 微生物法 ： 与临床疗效吻合,灵敏度高，结果直观，
适用范围广；但操作复杂费时，误差大
理化方法：准确度与专属性较高, 且操作简便；但与
临床疗效有偏差
β–内酰胺类
CH2
COHN
O
S N
CH3 CH3 COOH
青霉素（苄青霉素） （penicillins）
CH COHN
S CH3
NH2
N O
CH3 COOH
氨苄西林
HO
CH COHN
S CH3
NH2
N O