酶学分析技术第二讲

（2）连续监测法：又称为动力学法或速率法、连续反应法。

在酶反应过程中，用仪器监测某一反应产物或底物 浓度随时间的变化所发生的改变，通过计算求出酶 反应初速度。 连续监测法根据连续测得的数据，可选择线性 期的底物或产物变化速率用于计算酶活力。 因此连续监测法测定酶活性比定时法更准确。 实际工作中，采用工具酶的酶耦联法已经成为 应用最广、最频繁测酶活性浓度的方法。

1.使单一的色素原显色： 色素原是一种无色的色素前身，在过氧 化物酶（POD）存在下被H202氧化后可生成 有色的色素。 如临床测碱磷酶：

2.使成对的色素原显色： 必须有两个色素原共同存在，再在过氧 化物酶（POD）的催化下生成色素。如酚和 4-氨基安替比林作用，生成红色色素。 最常用的是Trinder反应
（二）耦联H202的工具酶及其指示反 应

有些酶作用于底物时，可使其氧化产生H2O2, 后者在POD的作用下使色素原氧化显色进行测定。 葡萄糖氧化酶、尿酸酶、甘油氧化酶、胆固醇 氧化酶等工具酶分别用于葡萄糖、尿酸、甘油、胆 固醇的测定，（代谢物浓度测定）可使相应底物被 氧化，生成H202，H202可通过下列指示反应来检测。
（3）平衡法：

通过测定酶反应开始至反应达到平衡时产物或底 物浓度总变化量来求出酶活力的方法，又叫终点法。
2.按检测方法分类法： ①分光光度法；②旋光法；③荧光法；④电化 学方法；⑤化学反应法；⑥核素测定法；⑦量热法。
工具酶及其指示反应
（一）工具酶的概念：
作为试剂用于测定酶活力或化 合物浓度的酶称为工具酶。对于底 物或产物不能直接测定或难于准确 测定的酶促反应，采用酶耦联法测 定。 最简单的酶耦联反应：
第二节 酶活性测 定方法 第三节代谢酶学 分析技术
（一）酶活性测定方法

1.按反应时间分类法： 20世纪50年代以前大都使用固定时间法。这种方法是以酶 催化反应的平均速度来计算酶的活性，现多已不用。50年代 中期开始采用连续监测法。这种方法用自动生化分析仪上完 成，可以测酶反应的初速度，其结果远比固定时间法准确， 在高浓度标本尤为明显，但本法也受到反应时间，反应温度， 试剂等的影响，应加以注意。

酶耦联反应与一般酶反应的一个重要区别处是有一 个明显的延滞期。酶耦联反应一开始存在着底物 A， 不存在指示酶的反应，随着产物B的出现和增加， 指示酶反应随之加快，Ex和Ei反应速度相等，也就 是达到稳态。从酶反应开始至稳态期间，指示酶反 应较慢且不稳定，称为延滞期。显然这期间指示酶 反应速度不能代表测定酶量多少。设计或选择酶测 定方法时，如果用酶耦联法，延滞期越短越好，测 定时间一定要避开此期。

例如要测定ALT活性


检测340nm吸光度的改变测得ALT活性。 在这里ALT为待测酶，LDH为工具酶，它的作用相当于试剂。
（二）指示反应

1.耦联的脱氢酶及其指示反应 —— NADH （NADPH）+或NAD（NADP） NAD（P）+是由维生素PP（烟酰胺）参与构 成的辅酶，是体内最常见的脱氢酶的辅酶。 常用的酶：乳酸脱氢酶（LD）、苹果酸脱氢酶 （MD）、谷氨酸脱氢酶（GLD）和6-磷酸葡萄糖 脱氢酶（C-6-PD）。

习题6.以NAD+还原成NADH反应为基础的生 化分析，采用的波长及吸光度变化为 A.340nm从小到大 B.340nm从大到小 C.405nm从小到大 D.405nm从大到小 E.280nm从小到大


（1）定时法：（两点法）
通过测定酶反应开始后某一时间段内（t1到t2）产物 或底物浓度的总变化量来求取酶反应初速度的方法。其 中t1往往取反应开始的时间。 酶与底物在一定温度下作用一段固定的时间，通过加入 强酸、强碱、蛋白沉淀剂等，使反应完全停止（也叫中 止反应法）。加入试剂进入化学反应呈色测出底物和产 物的变化。 该法最基本的一点是停止反应后才测定底物或产物的变 化。 优点：简单易行，对试剂要求不高。 缺点：难保证测定结果的真实性。 难以确定反应时间段酶促反应是否处于线性期。随 着保温时间的延续，酶变性失活加速。

由于工具酶所催化的反应必须在中间产物浓 度很低的条件下进行，并且将很快转变为最 终产物，反应体系中不应有中间产物堆积， 否则将导致误差。

如果一些酶反应找不到合适的指示酶与其 直接耦联，此时往往可以加入另一种酶，将 两者连接起来，模式如下：

将这种联接的酶称为辅助酶（Ea）。个别 情况可能使用两种乃至两种以上的辅助产物（不能直接测定） C：代表指示酶产物（可以 直接测定） Ex：待测酶 Ei：代表指示酶 Ex是所要测定的酶，A、B二物质分别为其底物和产物，对此二物质变 化，无法直接监测，此时可加入其他酶，其底物为Ex的产物B，其反应 产物C可直接监测，这样通过第二个酶反应有可能推测出第一个酶的活 性浓度，外加的第二酶称为指示酶Ei。