第五章常见色谱分离技术
色谱5--HPCE
－ － － － － － －
－ － － －
石英表面 负电荷
＋＋ ＋－ ＋－ ＋－ ＋－ ＋－
＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － － － － － － － － － － EOF
－ － － － －
水合阳 离子在 表面积 聚
电场作用下 向负极运动
＋
－ －
电渗流的一个独特性质是其具有平面
流型，推动液体流动的力在毛细管内 均匀分布，平面流型的优点是对谱带 的扩散没有直接作用。
热称为焦耳热。受毛细管尺寸、溶液电导、 外加电压等影响。 不均匀的温度梯度和局部的黏度变化会引 起区带展宽。温度变化1℃→黏度变化 2%～3% →淌度变化2%～3% 。 进样塞长度——在进样过程中减少样品塞 长度非常重要。对进样长度的限制是低于 毛细管总长度的（1～2）%。例 70cm长 的毛细管，进样量应小于7mm。
溶质与管壁相互作用——可能导致峰拖
尾 或发生对溶质的完全吸附。对多肽和 蛋白质来说，这种吸附特别严重。可采 用多种方法来减少相互作用： 增加缓冲液浓度以降低有效表面电荷； 在极端pH值下进行分离，使石英表面 硅羟基以不带电的形式存在； 对毛细管壁进行涂层处理。 电分散作用——样品区带与操作缓冲液 的电导差异可产生峰型畸变。
表面活性剂
在毛细管电泳中常添加表面活性剂， 作为疏水性溶质的增溶剂、与溶质形 成离子对，或作为毛细管内壁的改性 剂等，以改善分离效率。常用表面活 性剂有 ： 阴离子—十二烷基硫酸钠（SDS） 阳离子---十六烷基三甲基溴化铵 （CTAB） 两性离子---N,N’二甲基胺-3-丙烷-1磺酸
化合物 HCl NaCl 甘氨酸 柠檬酸 细胞色素C 人血红蛋白 烟草花叶病毒
扩散系数D 3.05 1.48 1.06 0.66 0.11 0.069 0.0046
课件：第五章 色谱与离子交换树脂分离法
Jorgenson等
发明毛细管柱气相色谱。 发表凝胶过滤色谱的报告。 发明凝胶渗透色谱。 发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。 发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，
采用抑制型电导检测的新型离子色谱法。 创立了毛细管电泳法。
第五章 色谱与离子交换分离法
• 色谱的分类
– 按流动相、固定相性质进行分类
• 1944年出现纸色谱以后，色谱 法不断发展，相继出现薄层色 谱、亲和色谱、凝胶色谱、气 相色谱、高压液相色谱（HPLC） 等。
M.Tswett
第五章 色谱与离子交换分离法
M.Tswett 实验
第五章 色谱与离子交换分离法
用色彩（chroma）和图谱（graphs）组成色谱一词（Chromatography) 。
慢 中等 快
淋洗液
Temporal course
第五章 色谱与离子交换分离法
第二节 色谱分离的基本理论
发明者
发明的色谱方法或重要应用
Tswett
用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱 概念。
Kuhn, Lederer
用氧化铝和碳酸钙分离a-、b-和g-胡萝卜素。使色 谱法开始为人们所重视。
Izmailov, Shraiber
Taylor, Uray
最先使用薄层色谱法。 用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。
离子交换色谱：以离子交换剂作固定相，利用各种离子的亲和力差
异进行分离，主要应用于分离简单离子、无机盐类等。
凝胶色谱：利用凝胶对不同尺寸的组分阻滞作用差异进行分离， 主要应用于有机物、生物大分子的分离；根据凝胶制备原料的
不同，又可分为有机凝胶和无机凝胶二类。 亲和色谱：利用固定相上的亲和基对特定大分子的亲和力差异进行
有机化学中的色谱技术
有机化学中的色谱技术色谱技术是有机化学中一种重要的分离和纯化手段，它通过将混合物中的化合物在固体或液体的固定相和流动相之间进行扩散、吸附或分配，以实现对化合物的分离的方法。
本文将介绍色谱的基本原理、常见的分离技术以及其在有机化学中的应用。
一、色谱的基本原理色谱的基本原理是根据化合物在固态或液态固定相和流动相之间的相互作用力不同而实现分离。
在进行色谱分离时，混合物按照一定方式进入色谱柱中，其中一些成分会与固定相或液相发生相互作用，并因此在柱中停留时间较长；而其他成分则会较快地流动经过柱子。
这样，不同化合物就可以被有效地分离。
二、常见的色谱分离技术1. 气相色谱（GC）气相色谱是利用气体作为流动相的色谱分离技术。
在此技术中，化合物首先通过气相色谱柱中的载气（通常为惰性气体）进行携带，然后在柱中定置的液态或固态固定相上分离。
由于化合物在固定相上的相互作用力不同，它们会以不同的速率通过柱子，从而实现分离。
2. 液相色谱（LC）液相色谱是利用液体作为流动相的色谱分离技术。
这种分离方法最常用的是高效液相色谱（HPLC），其基本原理与气相色谱类似，只是使用的流动相不同。
在液相色谱中，液-固（或液-液）相之间的相互作用力决定了化合物的分离效果。
三、色谱技术在有机化学中的应用色谱技术在有机化学中广泛应用于分离、纯化和鉴定化合物。
以下是一些常见的应用领域：1. 分离和纯化化合物色谱技术可以分离混合物中的各种化合物，并实现纯化。
通过调节色谱条件，如流动相的性质和固定相的种类，可以实现对特定化合物的选择性分离。
这对于有机化学研究中得到纯净的化合物样品非常重要。
2. 鉴定和定量分析色谱联用技术，如气相色谱-质谱联用（GC-MS）和液相色谱-质谱联用（LC-MS），在有机化学中得到广泛应用。
它们可以通过测定化合物的质量谱图谱和保留时间，帮助鉴定不同化合物。
此外，色谱技术还可以结合其他检测方法，如紫外光谱和荧光检测，进行定量分析。
色谱分离技术
亲和色谱亲和色谱是专门用于纯化生物大分子的色谱分离技术，它是基于固定相的配基与生物分子间的特殊生物亲和能力的不同来进行相互分离的。
亲和色谱的显著特点：具有其他分离技术所不能比拟的高选择性，且色谱过程操作条件温和，能有效地保持生物大分子高级结构的稳定性，活性样品的回收率也比较高。
所以亲和色谱被广泛用于酶、治疗蛋白、抗体、核酸、辅助因子等生物大分子以及细胞、细胞器、病毒等超分子物质的分离与纯化。
特别是对分离含量极少而又不稳定的活性物质最有效，经一步亲和色谱即可提纯几百至几千倍。
亲和色谱的基本过程：把具有特异亲和力的一对分子的任何一方作为配基，在不伤害其生物功能情况下，与不溶性载体结合，使之固定化，装入色谱柱，然后把含有目的物质的混合液作为流动相，在有利于固定相配基和目的物质形成络合物的条件下进入色谱柱。
目的物质被吸附，杂质直接流出。
变换过柱溶液，使配基与其亲和物分离，获纯化的目的产物。
亲和色谱分离中经常采用的生物亲和关系①酶：底物、底物类似物、抑制剂、辅酶、金属离子；②抗体：抗原、病毒、细胞；③激素、维生素：受体蛋白、载体蛋白；④外源凝集素：多糖、糖蛋白、细胞表面受体蛋白、细胞；⑤核酸：互补碱基链段、组蛋白、核酸聚合酶、核酸结合蛋白；⑥细胞：细胞表面特异蛋白、外源凝集素。
亲和色谱操作中的洗脱方法在亲和色谱洗脱操作中，洗脱方法有两类，即普通洗脱法和专一性洗脱法。
普通洗脱法：与其他色谱分离方法一样，可以通过改变溶剂或缓冲液的类型，改变缓冲液的pH和离子强度，改变洗脱温度，以及添加促溶剂等措施进行洗脱。
专一性洗脱法：是指溶液中的配基、抑制剂或半抗原等物质与亲和层析剂上的配基，同时对生物活性物质产生竞争性的结合，从而达到洗脱的目的。
一般说来，专一性洗脱可以获得很高的分辨能力。
但是，专一性洗脱剂的价格都比较昂贵，所以常与普通洗脱条件配合作用。
离子交换色谱离子交换色谱利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。
第五章 色谱理论
第五章色谱原理5.1色谱的原理和分类5.1.1色谱色基本原理色谱技术是一种重要的分离和分析技术，其用于物质的分离始于二十世纪初。
1903年，俄国植物学家Tswett向填充碳酸钙的柱中注入植物色素的石油醚冲洗，发现柱中出现数条相互分离的色带，色谱法的命名就是由此发现开始的。
随后色谱技术得到不断发展。
Martin于1952年因创立气－液色谱分离方法而荣获诺贝尔奖。
气相色谱的出现极大地鼓舞了世界各地的科学工作者，激发了人们对分析色谱技术进行放大，使之用于制备目的和工业生产的研究兴趣。
资料表明，在50和60年代，分析和生产规模的气相色谱分离技术的研究十分活跃。
到了70年代，尤其是在美国制糖工业采用酶法转化技术生产高果葡糖浆以后，液相色谱技术就变成了一个热门的研究领域。
色谱在英文中只有一个名词Chromatography），但在中文中却有色谱和层析的名称。
色谱的主要装置如图所示;图色谱的主要装置图色谱实际是色谱分离精度高，设备简单，操作方便，根据各种原理进行分离的色谱法不仅普遍应用于物质成分的定量分析与检测，而且应用于生物物质的制备分离和纯化，成为生物下游加工过程最重要的纯化技术之一。
5.1．2色谱的分类1)流动相与固定相色谱法根据流动相的相状态分气相色谱法、液相色谱法和超临界流体色谱法，而固定相有固体、液体和以固体为载体的液体薄层。
2)固定相的形状根据固定相或色谱装置形状的不同，液相色谱法又分为纸色谱法（Paper chromatography）、薄层色谱法（Thin－layer chromatography）和柱色谱法（Column chromatography）。
纸色谱法和薄层色谱法多用于分析目的，而柱色谱易于放大，适用于分离大量制备分离，是主要的色谱分离手段。
3)分离操作方式色谱法根据分离操作方式的不同可分为间隙色谱和连续色谱两大类。
间隙色谱技术通过合理选择固定相介质和冲洗剂可以得到广泛应用。
但是，在工业应用中更希望采用连续分离操作，尤其是分离过程必须与其他连续单元操作（如连续生化反应器）同时进行时更是如此。
中药化学第五章 色谱法---吸附色谱
按流动相状态分类 液相色谱、气相色谱和超临界流体色谱
1.吸附色谱
（1）原理 利用吸附剂对被分离成分吸附能力的不同进 行分离的。
（2）分类 硅胶色谱、氧化铝色谱、聚酰胺色谱和活性 炭色谱等
（3）吸附色谱三要素 ①吸附剂 吸附机理属于物理吸附，即吸附剂通过
范德华力（固体表面的作用力、氢键络合、静电引力） 吸附成分。
5.碱性氧化铝能否用于酸性成分的分离?为什么?
6.在吸附层析(氧化铝,硅胶)中怎样选择吸附剂、洗脱剂?
7.在硅胶薄层析分离生物碱时,展开剂中常含有二乙胺,是何原因?
8.为什么要求薄层层析中原点小而圆?
②点样 将样品溶于少量溶剂中，用毛细管点样（定性分析）； 用微量注射器点样（定量分析）。 操作要点： 溶解样品的溶剂最好与展开剂极性相近，易挥发； 吸取样液的毛细管管口要平整； 点样点距离薄层板底1～1.5cm处，斑点直径不超过2～3mm； 点样量要适度。
吸附薄层色谱（Thin Layer Chromatography TLC）
该法在药品检验中得到广泛的应用。 （2）操作步骤 制板→点样→展开→显色→ 计算比移值
①制板 软板（干法铺板）：不加黏合剂、简便、快速、不牢固、
不易保存 硬板（湿法铺板）：加黏合剂、牢固、易保存、操作复杂。
硅胶G板，耐腐蚀性好，机械强度差；硅胶CMC-Na板，机械强度 好，耐腐蚀性差。
吸附薄层色谱（Thin Layer Chromatography TLC）
的分离； 碱性氧化铝（pH9.0） 适用于碱性和中性成分的分离。 （3）聚酰胺 是由酰胺聚合而成的一类高分子物质。不溶于水
及常用的有机溶剂，对酸稳定性差，对碱较稳定。吸附机理是与化 合物形成氢键。
中药化学第五章-1.
吸附剂对被分离成分的吸附能力越强，被分 离成分吸附得越牢固，在色谱中移动的速度 就越慢，反之移动的就快。
如果被分离物质的极性较大，可选用活度较 低的吸附剂和极性较大的移动相；如果被分 离物质的极性较小，可选用活度较高的吸附 剂和极性较小的移动相。
吸附能力来源于酰胺基与酚羟基形成的氢 键。
（二）展开剂
1、要求 纯化处理，除去杂质干扰。 展开剂常是由两种或者两种以上的溶剂按一定
的比例组成的溶剂系统。功能是解吸附。
2、种类 水、亲水性溶剂、亲脂性溶剂。
（二）展开剂
3、解吸附能力 展开剂的解吸附能力与展开剂及被分离成
分的极性大小有关。
对极性吸附剂，展开剂极性越大解吸附能 力越强，
二、吸附色谱基本构成要素
三要素：吸附剂 展开剂 被分离成分
（一）吸附剂
1、基本要求 颗粒细致、大小均匀（亦即有较大的表面积
和适当的吸附活性）；
不能与样品组分、样品溶剂、展开剂发生化 学反应；
更不能与溶剂及展开剂发生溶解。
（一）吸附剂
2、种类 最常用的吸附剂是氧化铝、硅胶和聚酰胺。
另外，市场上还有氧化镁、硅酸镁、碳酸镁、 硅藻土、活性炭等。
组分 吸附剂 流动相 极性 活性小 极性 非(弱)极性 活性大 非极性或弱极性
色谱法的发展
仪器化 仪表化 自动化 高速化 联用技术
第二节 吸附色谱
一、原理
利用吸附剂对样品中各成分吸附能力不同， 及洗脱剂或展开剂对它们的解吸附能力的不同， 使各成分达到分离。
吸附作用主要由于物体表面作用力、氢键、 络合、静电引力、范德华力等产生。
对非极性吸附剂，展开剂极性小则解吸附 能力强。
色谱分离
高效液相色谱仪
高效液相色谱(HPLC)流程示意图
离子交换色谱
• 离子交换色谱中的固定相是一些带电荷的基团， 这些带 电基团通过静电相互作用与带相反电荷的离子结合。如果 流动相中存在其他带相反电荷的离子，按照质量作用定律， 这些离子将与结合在固定相上的反离子进行交换。固定相 基团带正电荷的时候，其可交换离子为阴离子，这种离子 交换剂为阴离子交换剂；固定相的带电基团带负电荷，可 用来与流动相交换的离子就是阳离子，这种离子交换剂叫 做阳离子交换剂。阴离子交换柱的功能团主要是－NH2， 及－MH3+ ：阳离子交换剂的功能团主要是－SO3H及－ COOH。其中-NH3+离子交换柱及-SO3H离子交换剂属于 强离子交换剂，它们在很广泛的pH范围内都有离子交换 能力；-NH2及-COOH 离子交换柱属于弱离子交换剂，只 有在一定的pH值范围内，才能有离子交换能力。离子交 换色谱主要用于可电离化合物的分离，例如，氨基酸自动 分析仪中的色谱柱，多肽的分离、蛋白质的分离，核苷酸、 核苷和各种碱基的分离等。
色谱法的发展历程
◆ 1903年 Tswett创立色谱法（在碳酸钙上分离了叶绿素）。 由Tswett创立的色谱法分离效率低，分离时间长，根据样品的不同， 一般分离需要几小时至几天。 ◆20世纪40年代至50年代初，先后出现了纸色谱（paper chromatography,PC）和薄膜色谱法(thin-layer chromatography,TLC)。 特点：较经典色谱法简单、分离时间短，样品量要求小。 ◆1952年，James和Martin提出了气相色谱法（gas chromatography,GC) 特点： 以气体作为流动相。应用范围广泛受到人们重视。但对不 易气化和热不稳定性差的化合物难以分离。 ◆ 20世纪60年代后期由于新型色谱柱填料的，高压输液泵和高灵 敏度的监测器的出现，发展出了高效液相色谱（High performance liquid chromatograghy,HPLC）。
色谱分离技术的研究与应用
色谱分离技术的研究与应用第一章：绪论色谱分离技术是一种重要的分析和检测方法，广泛应用于化学、生物、医药等领域。
其原理是利用样品中的化学物质在移动相和固定相之间的相互作用力的不同，使其在一定条件下在固定相上被分离。
本文将详细介绍色谱分离技术的研究和应用，并着重讨论其在医药领域的应用现状和未来发展方向。
第二章：色谱分离技术概述色谱分离技术包括气相色谱、液相色谱、超临界流体色谱、离子色谱等多种分离方法。
其中，气相色谱主要应用于气态和揮发性样品的分离和分析，液相色谱适用于液态或溶解性样品的分离和分析，超临界流体色谱适用于高分子、生物、环境和天然产物等的分离与分析，离子色谱适用于阴、阳离子分离和有机物离子的分离和检测。
这些不同类型的色谱在分离物质的特性、原理和分析特点上各有不同。
第三章：色谱分离技术在医药领域的应用色谱分离技术在医药领域中得到了广泛的应用。
其中，液相色谱在药物分析、研究和质量控制方面应用最广泛。
利用液相色谱技术，可对药物的含量、杂质及某些药代动力学参数进行分析。
同时，液相色谱技术还可用于对传统药用资源中含有的多种化合物的化学成分进行深入分析和研究。
液相色谱技术在植物药物中的应用已成为当前植物药学研究的主要方法之一。
第四章：色谱分离技术在生物领域的应用色谱分离技术在生物领域中的应用越来越广泛，包括对多肽、多糖、蛋白质和核酸的分离和分析。
其中，高效液相色谱在生物大分子的纯化和鉴定中有着非常显著的优势。
同时，气相色谱-质谱联用技术在精确鉴定各种不同的小分子有机物和生物大分子结构中的小分子有机物残留方面也有着非常重要的应用。
第五章：色谱分离技术在环境领域的应用色谱分离技术在环境领域中也有非常广泛的应用。
其中，超临界流体色谱技术在环境样品的功效评价中已经被应用。
同时，离子色谱技术在环境中对含有异硫氰酸盐、硝酸盐、氯化物等阴离子物质样品的分析和检测有着非常显著的优势。
第六章：未来发展趋势随着对样品中化合物性质分析的需求越来越高，色谱分离技术也在不断创新和发展。
色谱分离技术
色谱分离技术色谱分离技术是一种非常有用的分离技术，它可以用来分离和测定各种化学物质和生物物质的构成成分。
这种技术的应用非常广泛，在分析科学、医药、食品和环境科学等多个领域都有重要的应用价值。
色谱是一种将一种物质分离成一个或几个组份的分离技术。
它是一种以溶剂混合物为分析对象的分离技术，分析动力学模型中，将一个复杂混合物分开成单一成分，或者将从同一样品收集到的多个成份分离开来，以便进行更详细的分析。
一般来说，色谱技术分为液相色谱、气相色谱和固相色谱三大类。
液相色谱（LC）是一种将混合物分离成单个部分的分离技术，它的分离原理是将混合物在某一特定流动相系统中进行分离，使混合化合物进入不同的体积比空间，从而实现分离。
一般情况下，使用液相色谱来分离复合物，并在高效液相色谱系统中加以鉴定。
它主要应用于复杂混合物的分离和分析，以得到单价结构或复杂组成物质。
气相色谱技术（GC）是一种利用混合物中不同物质之间比较大的分子质量来分离分析它们的技术。
分析时，气相混合物的各组分被溶解在柱的吸附剂中，在充满气体的情况下，根据其分子质量的大小，其分子在柱内移动的速度也不同，从而实现分离。
一般而言，气相色谱技术是极具灵敏性的，而且可以在较短的时间内获得较高的精度，因此，它在可控性和灵敏性等方面都明显优于其它技术。
最后是固相色谱技术（SPE），它也是一种分离技术，该技术主要用于纯化复杂混合物，它的操作步骤是将混合化合物放置在一种特殊的吸附剂上，利用温度的变化和物理因素，从而使其分离出单一的化合物。
与液相和气相色谱相比，固相色谱技术具有较高的纯度和较低的成本，而且该技术可以用于分离、测定、调节和表征诸如碳水化合物、蛋白质、核酸、有机酸和其他有机物等复杂物质。
色谱分离技术是当今分析科学领域中一种重要的技术，其应用非常广泛，可用于各种化学和生物物质的分离和测定。
液相、气相和固相色谱技术在很多领域都发挥了重要作用，为医药、食品、环境等领域的研究提供了强大的技术支持。
第五章 色谱分析法分析化学
• VM 为色谱柱中流动相的体积，即柱内固定相间的空隙体积 • Vs为色谱柱中固定相的体积。在气液色谱中它为固定液体积；在 气固色谱中则为吸附剂表面容量 • VM 与 Vs之比称为相比以 β 表示
2018/11/22
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色谱分析法
§11-2 固定相
气固色谱固定相 气液色谱固定相
2018/11/22
2018/11/22
固定液
固定液分类方法
如按化学结构、极性、应用等的分类方法。在各种色谱手册中，一
般将固定液按有机化合物的分类方法分为：脂肪烃、芳烃、醇、 酯、聚酯、胺、聚硅氧烷等， 最高最低使用温度 高于最高使用温度易分解，温度低呈固体；
混合固定相
对于复杂的难分离组分通常采用特殊固定液或将两种甚至两种以 上配合使用；
SQ APL OV-101 OV-3 OV-7 OV-17 OV-22 DNP OV-210 OV-225
150 300 350 350 350 300 350 130 250 250
乙醚 苯 丙酮 甲苯 甲苯 甲苯 甲苯 乙醚 氯仿
0 — +1 +1 +2 +2 +2 +2 +2 +3
非极性和弱极 性各类 高 沸点有机化合物 各类高沸点弱 极性有 机 化合物，如芳烃
2018/11/22
气固色谱固定相
2018/11/22
固定相 / 气液色谱固定相
气液色谱固定相 [ 固定液 + 担体（支持体）]
•
•
固定液在常温下不一定为液体，但在使用温度下一定呈液体状态。 固定液的种类繁多，选择余地大，应用范围不断扩大。
担体：化学惰性的多孔性固体颗粒，具有较大的比表面积。
5 离子交换色谱法
三、提高离子交换分离效果的途径
1）树脂的选择与填充技术 参照文献方法，结合被分离对象（阴离子？阳离子？）选择合适类型
交联度为8%的强酸性聚苯乙烯型树脂，约50um， 柱温50℃。
以150×0.9cm的交换柱，0.2M柠檬酸钠，pH 3.244.25为淋洗剂可以先分离出酸性氨基酸如谷氨酸，后分离 出中性氨基酸，如苯丙氨酸
以15 ×0.9cm的短交换柱，0.4M 0.2M柠檬酸钠， pH5.26为淋洗剂可以分离出碱性氨基酸，如精氨酸等。
带”——即色谱 Chromatography
该方法现在仍然广泛使用，如有机合成中的“过柱子”。常见的 是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。又称为柱层析/柱色谱，或经 典液相色谱法（相对于HPLC）。
一、离子交换色谱法的分类
1）淋洗色谱：通常先将少量样品通过交换柱，达到吸附 平衡，然后用亲和力比组分A、B、C都弱的离子作淋洗剂， 得到相互分离开的淋洗曲线。主要用于分析分离。
后进行测定。
置换色谱：
锂和钠的硫酸盐混合溶液通过一根氢型DOWE×50，300目树脂的交 换柱，用1.0mol/L(NH4)2SO4淋洗得到的淋洗曲线。
有时，在淋洗液中加入一定的络合剂，降低金属离子与树脂的亲和力， 从而使得NH4 +, Na+能对二、三价的金属离子起到置换作用。 Li+＜H+＜Na+＜NH4+＜K+＜Rb+＜Cs+＜Ag+＜Tl+
在用溶剂平衡时，先使材料沉淀， 用倾泻法除去悬浮的细颗粒，否则由 于细颗粒的堵塞，溶剂的流速将显著 降低。
中药化学 第五章 色谱分离技术-吸附色谱、聚酰胺
（二）吸附柱色谱操作技术
操作步骤
色谱柱的选择 内径与柱长比：1：10～1：20
装柱 上样 洗脱检查
1、装柱
干法装柱：直接用小漏斗将吸附剂均匀装入柱内的方法。 湿法装柱：将吸附剂装入盛有洗脱液的柱内，或将吸附剂 与洗脱液混合成混悬液再装入柱中，吸附剂慢慢沉降。
二、吸附色谱基本构成要素
吸附剂（固定相） 展开剂（流动相、移动相） 被分离的成分
（一）吸附剂
1、基本要求 一般来说，吸附剂要有较大的表面积和适宜
的活性，与移动相溶剂及被分离各成分不起化学 反应、颗粒均匀，并且在所用各种溶剂中不溶解。
2、种类 极性吸附剂：氧化铝、硅胶、聚酰胺、氧化镁、 硅酸镁、碳酸钙和硅藻土等。 非极性吸附剂：活性炭
2、种类 亲脂性有机溶剂：石油醚、环己烷、四氯化碳、苯、 甲苯、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等。 亲水性有机溶剂：丙酮、乙醇、甲醇等。 极性吸附能力的大小与选择展开剂的极性 和被分离成分的极性大小有关。
一般来说，当选用常用的硅胶或氧化铝这类极性 吸附剂时，展开剂的极性越大，解吸附能力越强， 否则越弱。
色谱分离技术按色谱原理分吸附色谱分配色谱离子交换色谱凝胶色谱色谱分离技术按操作形式分平面色谱tlcpc柱色谱毛细管电泳色谱色谱分离技术按流动相分液相色谱hplc气相色谱gc超临界流体色谱sfc二分类由于色谱法具有强大的分离能力众多的分离模式和灵活的检测手段因而被广泛用于化工医药生化和环境保护等领域尤其对中药化学成分的分离精制定性和定量检测等方面行之有效
影响聚酰胺吸附能力的主要因素如下：
1. 形成氢键的能力与溶剂有关。一般聚酰胺在水中 与化合物形成氢键的能力最强，在有机溶剂中较弱， 在碱性溶剂中最弱。因此溶剂对聚酰胺的洗脱能力 的次序为： 水〈甲醇或乙醇〈丙酮〈稀氢氧化钠溶液或稀氨水 〈甲酰胺或二甲基甲酰胺。
色谱分离技术
五、色谱图及基本概念
色谱图： 色谱图：混合液中各种 组分经色谱柱随流动相 依次流出，在检测器上 依次流出， 检测到的信号随时间的 变化曲线或随流动相的 体积的变化曲线为色谱 图。
1. 基线 色谱柱出口没有组分流出， 色谱柱出口没有组分流出，仅有纯流动相流 过监测器，即无试样通过检测器时， 过监测器，即无试样通过检测器时，检 测到的信号即为基线。 测到的信号即为基线。稳定的基线应是 一条平行于横坐标的直线。 一条平行于横坐标的直线。
分离度R的物理意义 分离度 的物理意义 分离度R综合考虑了保留值的差值与峰宽 分离度 综合考虑了保留值的差值与峰宽 两方面的因素对柱效率的影响， 两方面的因素对柱效率的影响，可衡量色 谱柱的总分离效能，R值越大 值越大， 谱柱的总分离效能，R值越大，两色谱峰 的距离越远，分离效果越好。 的距离越远，分离效果越好。
噪声：使基线发生细小波动的现象称为～， 噪声：使基线发生细小波动的现象称为～， 如空气峰。 如空气峰。
2、色谱峰 当样品中的组分随流动相流入检测器时，检 当样品中的组分随流动相流入检测器时， 测器的相应信号大小随时间变化所形成的 峰形曲线称为色谱峰， 峰形曲线称为色谱峰，峰的起点和终点的 连接直线称为峰底。 连接直线称为峰底。
色谱技术(分配色谱)--概念 色谱技术(分配色谱)--概念： 概念：
色谱技术是一组相关分离方法的总称， 色谱技术是一组相关分离方法的总称，色 谱柱的一般结构含有固定相（多孔介质） 谱柱的一般结构含有固定相（多孔介质） 和流动相，根据物质在两相间的分配行为 和流动相， 不同（由于亲和力差异），经过多次分配 不同（由于亲和力差异），经过多次分配 ）， 吸附-解吸-吸附-解吸…），达到分离 （吸附-解吸-吸附-解吸…），达到分离 的目的。 的目的。
第五章 层析分离技术
Resolution: depends on efficiency and selectivity
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层析分离的基本概念
色谱柱的理论塔板数N与高度H
tR 2 N 5.54( ) W1/ 2
N---理论塔板数 tR---保留时间 W1/2---半峰宽
AU280
理论塔板高度：L---柱长
Wh = Peak width at half peak height Vr
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层析分离的基本概念
分配系数 可由Langmuir方程得出
q Kd c K ---分配系数
d
q、c---溶质在固相和液相中的浓度
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层析分离的基本概念
滞留时间（tR）和滞留体积（VR） 反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱 过程的基本热力学参数之一
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层析分离的基本概念
洗脱体积 色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，为洗脱 体积
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3、有机溶剂沉淀
降低水溶液的介电常数，增加蛋白质不同电荷之间 的静电引力，使蛋白质产生沉淀； 有机溶剂与水作用使蛋白质的表面水化层厚度压缩， 导致蛋白质脱水，蛋白质间的疏水作用增强，从而产生 沉淀。
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五、层析系统的基本概念及要求
Resolution Efficiency Selectivity Symmetry
3
第一节 层析概述
一、层析的原理
层析技术是一组相关分离方法的总称，当待分离的 混合物随流动相通过固定相时，由于各组份的理化 性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、 结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比） 不同，而且随流动相向前移动，各组份不断地在两 相中进行再分配，从而达到将各组份分离的目的。
常见色谱分离法的类型和基本原理
常见色谱分离法的类型和基本原理
常见的色谱分离法包括气相色谱（GC）、液相色谱（LC）、超高效液相色谱（UHPLC）和离子交换色谱（IC）等。
1. 气相色谱（GC）：该方法将待分离的混合物溶解在气相载气中，然后通过柱中的固态填充物，利用物质在固相填充物和气相载气之间的分配不平衡来进行分离。
分离是根据样品中化合物在固相填充物上的相对亲/疏水性的不同实现的。
2. 液相色谱（LC）：该方法将待分离的混合物通过溶解在液相中，然后通过液相柱中的固相填充物进行分离。
液相色谱可以根据不同的机理分为几种类型，包括反相色谱、离子交换色谱、凝胶过滤色谱等。
3. 超高效液相色谱（UHPLC）：UHPLC是液相色谱的一种变种，使用更细小的颗粒填充物和较高的操作压力，以提供更高分辨率和更快的分离速度。
4. 离子交换色谱（IC）：IC主要用于分离和分析带有正负离子的化合物。
通过固相柱中的离子交换剂，将待分离的样品中的离子与固相交换剂之间的电荷相互作用进行分离。
这些色谱分离法的基本原理都是根据待分离样品中组分之间在不同相（固相和液相、气相和液相）中的分配行为或相互作用来进行分离。
第五章 液相色谱质谱
第五章液相色谱-质谱分析技术理论与应用第一节液相色谱—串联质谱分析技术的原理一、质谱法质谱法(Mass Spectrometry，MS)，即用电场和磁场将运动的离子（带电荷的原子、分子或分子碎片）按它们的质荷比分离后进行检测的方法。
质谱法测量的对象是必须是带电离子。
质谱法的特点：质谱不属波谱范围；谱图与电磁波的波长和分子内某种物理量的改变无关；谱是分子离子及碎片离子的质量与其相对强度的谱，谱图与分子结构有关；质谱法进样量少，灵敏度高，分析速度快；谱是唯一可以给出分子量，确定分子式的方法，而分子式的确定对化合物的结构鉴定是至关重要的。
利用质谱仪可进行同位素分析，化合物分析，气体成分分析以及金属和非金属固体样品的超纯痕量分析。
在有机混合物的分析研究中证明了质谱分析法比化学分析法和光学分析法具有更加卓越的优越性，其中有机化合物质谱分析在质谱学中占最大的比重，全世界几乎有3/4仪器从事有机分析，现在的有机质谱法，不仅可以进行小分子的分析，而且可以直接分析糖，核酸，蛋白质等生物大分子，在生物化学和生物医学上的研究成为当前的热点，生物质谱学的时代已经到来，当代研究有机化合物已经离不开质谱仪。
1、质谱法用于结构分析的流程质谱法是有机分子通过电子轰击，得到分子离子和碎片离子，通过分离、收集和记录得到样品的结构信息。
由分子结构与裂解方式的经验规律，根据分子离子和各种碎片离子的质荷比及其相对丰度，就可以进行结构分析。
具体流程如下：有机分子通过电子轰击，试样中各组分电离生成不同荷质比的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器，利用电场和磁场使发生相反的速度色散——离子束中速度较慢的离子通过电场后偏转大，速度快的偏转小；在磁场中离子发生角速度矢量相反的偏转，即速度慢的离子依然偏转大，速度快的偏转小；当两个场的偏转作用彼此补偿时，它们的轨道便相交于一点。
与此同时，在磁场中还能发生质量的分离，这样就使具有同一质荷比而速度不同的离子聚焦在同一点上，不同质荷比的离子聚焦在不同的点上，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。
第五章-色谱分析法概论
Fc:流动相平均体积流速,（单位:cm3·min-1）.
(5) 保留体积VR
指从进样开始到被测组分在柱后出现浓度极大点时所通过 的流动相的体积。保留时间与保留体积关系：
VR = Fc·tR (6)调整保留体积VR
某组分的保留体积扣除死体积后，称为该组分的调整保留体 积。
VR = VR VM = tR Fc
3. 保留值与容量因子的关系
k' K1KVs KVs
Vm VM
将色谱过程基本方程代入：
k' VR VM Vs
Vs VM
可得： k' VRVMVR ' tR ' tRtM
VM VM tM tM
将该式改为： VRVM(1k')
tRtM(1k')
tR
L u
(1
k
')
4.相对保留值 2 ,1
某组分2的调整保留值与组分1的调整保留值之比，称为相对
取决于组分在固定相上的热力学性质。
2、分离度的定义
分离度又叫分辨率或分辨度，既能反映柱效率又能反映选择
性的指标，是衡量分离效能的总指标。
定义：
Rs
1 2
{ 根据流动相的
气相色谱(GC) 气-液色谱(GLC)
物态可分为
液相色谱(LC) 液-固色谱(LSC)
液-液色谱(LLC)
按固定相的固 定方式分类
填充柱色谱 柱色谱 毛细管柱色谱
平板色谱 纸色谱 薄层色谱
平板色谱
根据分离机理 可分为
吸附色谱 分配色谱 离子交换色谱 排阻色谱
色谱法的特点和应用
1.分离效能高 2.灵敏度高 可检测10-11~10-13g,适于痕量分析.色
第五章 减压柱色谱分离技术解读
d． VLC处理量大．分离几十克的样品，仍能 以较快的速度完成。在 FCC中，由于玻璃分离 柱的限制，处理6g以上的样品时就常困难．常 压柱层析虽然没有样品量的限制，但是极其耗 时，所用的固定相的量亦很大，
三、上样
放掉真空后，常压下加入低极性 溶剂于吸附剂表面上，减压使溶 剂均匀流过吸附剂。如有空隙， 需要重装。使柱子抽干后，重复 1～2次，即可准备上样。
A．用低极性溶剂或洗脱剂（如石油醚、 正己烷）溶解样品。常压下小心加入 柱顶端，再加入洗脱剂或溶剂覆盖吸 附剂表面，慢慢减压，使样品在柱顶 端形成样品层。
VLC不同于常压柱层析和快速柱层析Fcc，因为后 两者洗脱剂是连续的，在操作中不会间断；而VLC 进行溶剂洗脱时，在加洗脱剂后，在柱后减压下全 部抽出，每一次洗脱收集一次，抽干后，再更换溶 剂，并再进行下一个流分的收集，所以在这一点上 VLC与PTLC多次展开极为相似。（展开一次后吹 干，再展）。
由于经典的柱层析费时费力，需要大量的固定 相和洗脱液，工作效率低，为此人们相继建立 了离心薄层、 VLC、 FCC等快速层析分离的 方法。其中VLC在天然产物分离中应用最多。
该法1969年由澳大利亚Coll J.C提出，1977年首 次应用于分离澳洲软珊瑚中2个新的二萜化合
物(Cembrenoids).
1.固定相；
常10u采m用～4T0LuCm用硅硅胶胶6、0HA或l26O03G,（）粒聚度酰：胺 等
2. 装柱：干法装柱法。
将吸附剂装入漏斗或短柱中，轻轻拍 紧或减压拍打或从顶端挤压，直至吸 附剂紧密，最后变得坚硬。吸附剂的 高度一般不超过5cm。
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⑤亲合色谱：根据固定相上键合的特殊配体对某种生物大 分子有专一性吸附而除去其他杂质。使生物大分子得以 分离。
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（4）按使用领域不同对色谱的分类：
①分析型色谱：主要用于各种样品的分析，其特点 是色谱柱较细，分析的样品量少。
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1956年Van Deemter等在前人研究的基础上发展了描述色谱过程的 速率理论，1965年Giddings总结和发展了前人的色谱理论，为色谱的 发展奠定了理论基础。
1944年Consden等就发展了纸色谱。 1949年Macllean等在氧化铝中加入淀粉粘合计制作薄层板使薄 层色谱（TLC）得以实际应用，而在1956年Stahl开发出薄层色谱 板涂布器之后，才使TLC得到广泛地应用。 20世纪60年代末，把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱， 出现了高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography）。 20世纪80年代初毛细管超临界流体色谱得到发展，但在90年代 后未得到较广泛应用。 20世纪80年代初由Jorgenson等集前人经验而发展起来的毛细管 电泳，在90年代得到广泛的发展和应用。同时集高效液相色谱和 毛细管电泳优点的毛细管电色谱在90年代后期受到重视。 21世纪色谱科学将在生命科学等前沿科学领域发挥他不可替代 的重要作用。
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分离原理
• 在色谱分析中，当流动相携带样品通过色谱的固定 相时，样品分子与固定相分子之间发生相互作用， 使样品分子在流动相和固定相之间进行分配。与固 定相分子作用越大的组分向前移动速度越慢，与固 定相分子作用越小的组分向前移动速度越快，经过 一定的距离后，由于反复多次的分配，使原本性质 （沸点、极性等）差异很小的组分之间可得到很好 的分离。
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5.1.3 色谱法的分类（依据不同,分发不同）
（1）按两相的状态分类
气固色谱（GSC）— 固定相是固体吸附剂 气相色谱（GC）
气液色谱（GLC）— 固定相是固体载体上涂固定液 按移动相不同分 液相色谱（LC） 液固色谱（LSC）
液液色谱（LLC） 超临界流体色谱来自2021/3/59
1941年Martin和Synge提出用气体代替液体流动相的可能性。 1952年James和Martin发表了从理论到实践比较完整的气液色 谱方法（Gas-Liquid Chromatography），因而获得了1952年的 诺贝尔化学奖。 1957年Golay开创了开管柱气相色谱法（Open-Tubular Column Chromatography），习惯上称为毛细管气相色谱法 （Capillary Column Chromatography）。
油醚叫作“流动相”。
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2、色谱法的发展
在Tswett提出色谱概念后的20多年里没有人关注这一伟大的 发明。
1931年：德国的Kuhn和Lederer在Tswett实验的基础上用氧化 铝和碳酸钙分离了α-，β-，和γ-胡萝卜素，此后用这种方法分 离了60多种这类色素。
1940年：Martin和Synge提出液-液分配色谱法（Liquid-Liquid Partion Chromatography）,即固定相是吸附在硅胶上的水，流 动相是某中有机溶剂。
②制备型色谱：又可分为实验室用制备型色谱和工 业用大型制造纯物质的制备色谱。
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5.1.2 色谱体系
包括两相（即固定相、移动相）和样品。 • 固定相 在色谱过程中不发生移动。 材料：固体（相）、固体及其所支持的液体。 • 流动相 在色谱过程中不停地移动，并带动被分 离物质一起移动。 材料：气体、液体。 • 样 品 溶质
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色谱法的基本原理
• 色谱法是包括一大类操作方式不同、但分离原理相同的一 门技术，不论采用何种方法或设备、其色谱过程有着如下 共同点：（1）任何色谱过程，都必须有两相物质存在， 一为固定相，一为流动相。（2）物质的分离还必须借助 于流动相相对于固定相移动。（3）被分离的物质称为溶 质，由于各种溶质组分与两相物质有着不同作用力，从而 造成各组分产生差速运动而达到分离目的。
• 溶质与两相物质之间作用力可以为吸附力，也可以为溶解 力；由于此种力之不同，决定了各个组分在两相中有着不 同量或浓度的分布，随着流动相的前移，则此种分布不断 变更，最终与流动相作用力大的组分前移快，反之则慢， 下图为一二元组分分离示意图。
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下图为一二元组分分离示意图。
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第五章常见色谱分离技术
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5.1 绪论 5.1.1 色谱发展史及进展
1、色谱法的出现
1903年俄国植物学家Tswett(茨维特)把干燥的碳酸钙 粉末装到一根细长的玻璃管中，然后把植物叶子的石油醚 萃取物倒到管中的碳酸钙上，萃取液中的色素就吸附在管 内上部的碳酸钙里，再用纯净的石油醚洗脱被吸附的色素， 于是在管内的碳酸钙上形成了色带。当时Tswett把这种色 带叫作“色谱”（Chromatography）。在这一方法中把色 谱管叫作“色谱柱”，碳酸钙叫作“固定相”，纯净的石
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（3）按分离原理分类
① 吸附色谱：利用吸附剂表面对不同组分具有的不同吸附 能，达到分离目的。
②分配色谱：利用不同组分在给定的两相中具有不同的分 配系数而使混合物实现分离与测定的方法。
③离子交换色谱：以带固定电荷的离子交换剂作固定相， 用于分离带相反电荷的物质。由于不同物质带电情况不 同而对固定相有不同的静电力而进行分离 。
（2）按分离“床”的几何形状分 类
填充柱色谱
柱色谱 （固定相装在玻璃或金属管内）
毛细管柱色谱 （固定相附在管子内壁，中心是空的）
开床式色谱
纸色谱（利用滤纸作固定相的支持物，把试 样点在滤纸上，用溶剂将其展开而进行分 离）
薄层色谱（用粉末吸附剂，压成或涂成薄层， 然后用类似纸色谱的操作进行分离）
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