光度法细菌内毒素检测实验方案设1

光度法细菌内毒素检测实验方案设计

一、样品限值的确定

1．药典规定品种：查阅2005版药典，找出其细菌内毒素限值。

2．非药典规定品种：通过计算得出限值，计算公式参照2005版药典L=K/M，式中L 为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示；

K为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/(kg〃h)表示，注射剂K=5E U/(kg〃h)，放射性药品注射剂K=2.5 EU/(kg〃h)，鞘内用注射剂K=0.2 EU/(kg〃h)；

M为人用每公斤体重每小时最大剂量，以ml(kg〃h)、mg (kg〃h)或U/ (kg〃h)表示，人均体重按60kg计算，注射时间若不足1小时，按1小时计算。

按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况做必要调整，但需说明理由。

注射剂安全性检查法应用指导原则（修订稿）（国药典化发〔2007 〕82 号）对热原检查或细菌内毒素检查设定限值有以下说明：热原检查或细菌内毒素检查的限值根据临床人每公斤体重每小时最大用药剂量计算（临床最大用药剂量应采用国内外权威资料作为依据，如药典临床用药须知。计算公式见细菌内毒素检查法），由于药品生产和临床适应症的不同（如抗感染、抗肿瘤、心血管药等重症用药、儿童和老人用药、联合用药），可适当调整限值（提高至计算限值的2～3倍），以保证安全用药。

细菌内毒素限值一般以EU/mg、EU/U表示，复方制剂以EU/ml表示。

大输液热原检查剂量为10ml/kg、细菌内毒素限值一般为0.5EU/ml。

二、最大有效稀释倍数（MVD）的确定：最大有效稀释倍数是指在实验中供试品溶液被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。用以下公式来确定MVD：

MVD=CL/λ

式中L为供试品的细菌内毒素限值；

C为供试品溶液的浓度，当L以EU/ml表示时，则C等于1.0ml/ml，当L 以EU/mg或EU/U表示时，C的单位需为mg/ml或U/ml；如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，可计算供试品的最小稀释浓度C=λ/L。λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml），或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。

例：注射用头孢噻肟钠(1.0g/支)，L=0.05EU/mg,加5ml细菌内毒素检查用水溶解,C=200mg/ml, λ=0.03125EU/ml ,MVD=CL/λ=200ⅹ0.05/0.03125=320(倍)。

三、干扰实验供试品稀释倍数的确定：在最大有效稀释倍数（MVD）范围内选择两到三个稀释倍数，如上，MVD=CL/λ=200ⅹ0.05/0.03125=320(倍)，可选择20倍、40倍、80倍。

四、标准品和供试品稀释：

1．标准品稀释：取国家标准品或工作标准品1支，加入1ml细菌内毒素检查用水溶解，旋涡混合器上混合15分钟后，将该标准品溶液稀释成所需浓度。

例：工作标准品2006-5，120EU/支，标准曲线所需浓度为2.0EU/ml、0.5 EU/ml、0.125 EU/ml、0.03125 EU/ml，稀释如下：

0.2ml 0.3ml 0.4ml 0.4ml

120EU/ml 12EU/ml 2 EU/ml 0.5 EU/ml

1.8ml 1.5ml 1.2ml 1.2ml

0.4ml

0.125EU/ml 0.03125 EU/ml

1.2ml

如果不重新制作标准曲线，只是用于阳性对照和样品阳性对照，只需将标准品溶液稀释成所需浓度。

2．供试品稀释：将供试品稀释成所需浓度，如上稀释注射用头孢噻肟钠，稀释步骤如下：

0.2ml 1.0 ml

原液（200mg/ml）10倍（20mg/ml）20倍（10mg/ml）

1.8ml 1.0ml

1.0ml 1.0ml

40倍（5mg/ml）80倍（2.5mg/ml）

1.0ml 1.0ml

3．供试品阳性对照稀释：外加细菌内毒素标准品溶液浓度为0.5 EU/ml。

20倍：0.3ml细菌内毒素标准品溶液(1EU/ml)+0.3ml供试品溶液(10倍)得到0.6ml含有细菌内毒素标准品0.5EU/ml、20倍样品溶液

40倍：0.3 ml细菌内毒素标准品溶液(1EU/ml)+0.3ml供试品溶液(20倍) 得到0.6ml含有细菌内毒素标准品0.5EU/ml、40倍样品溶液

80倍：0.3ml细菌内毒素标准品溶液(1EU/ml)+0.3ml供试品溶液(40倍) 得到0.6ml含有细菌内毒素标准品0.5EU/ml、80倍样品溶液

如果已知供试品的不干扰浓度，无需进行干扰实验，只需将供试品稀释至不干扰浓度，同时制备该浓度的供试品阳性溶液

五、仪器检测软件设置：按照仪器软件设置程序，将实验检测程序设置好。

六、溶解鲎试剂：用细菌内毒素检查用水溶解实际用量的鲎试剂。

注：1.鲎试剂不要提前溶解，否则会增加试剂污染和活性减低的机率。每次溶解鲎试剂的量不能太多，应该控制操作时间，从溶解鲎试剂开始到实验加样完成，检测管放入仪器，时间不能超过30分钟（越短越好）。

2.如果待检供试品较多，应该利用BET系列仪器可以多组实验同时检测的特点，分几批完成供试品检测。

七、分装鲎试剂：将溶解后的鲎试剂分装到定量检测专用检测管内，每管0.1ml。注意加入时不能有气泡，否则会对实验结果造成较大影响。

八、加样：按照实验设置的样品检测顺序，每管加入0.1ml待检样品，每个浓度加样完成后，应立即放入仪器内，不可等到所有样品加样完成后，才一起放入仪器内。

九、实验结果分析：实验完成后，利用软件对数据进行分析，打印实验报告。若供试品溶液所有平行管的平均内毒素浓度乘以稀释倍数后，小于规定的内毒素限值，判供试品符合规定。若大于或等于规定的内毒素限值，判供试品不符合规定。

试验必须符合以下三个条件方为有效：

（1）标准曲线合格。

（2）计算出的内毒素的回收率要在50%-200%的范围内。

（3）阴性对照的反应时间应大于标准曲线最低浓度的反应时间。

十、天大天发BET系列细菌内毒素分析仪操作规程收录在2005版《药品检验仪器操作规范》中，使用时敬请参看。