毛细管电泳法

放射
10-9－10-11
三、进样与检测
2 检测方法
紫外吸收 检测器
0.0030 AU
PDA - 233nm
9
1
3 5
6 7
8
2
4
0.0000 3.0 4.0 5.0 Minutes 6.0
四、CE的生物样本的预处理

CE生物样品预处理相对简单，因为它无需 考虑柱损坏的问题，几乎所有的生物样品 预处理方法都适用于CE。 一般都要对生物样品进行分离纯化、浓集， 有时还要进行衍生化。 最常用的CE前处理是去除蛋白。

第一部分 基本原理
一、基本装置
毛细管 电极 试样 缓冲液 高压电源
（可高至30KV）
数据处理 检测器 电极 缓冲液
二、基本原理

在电解质溶液中，带电粒子在电场作用下 以不同的速度定向迁移的现象叫电泳。
二、基本原理
正离子的运动方向和电渗流一致，故 CE所用的石英毛细管柱，在pH＞3时，石 在高电压作用下，双电层中的水合阳 最先流出；中性粒子的电泳速度为 英毛细管壁上的硅羟基在水溶液中发生电 粒子在电解质溶液中的迁移速 离子引起流体整体地朝负极方向移动， 离，产生的SiO-负离子使毛细管壁内表面 “零”，故其迁移速度相当于电渗流 度等于电泳和电渗流(EOF)两 带负电，和溶液接触时相应的缓冲液带正 该现象称为电渗流。 速度；负离子的运动方向和电渗流方 电，形成了双电层。 种速度的矢量和。 向相反，但因电渗流速度一般都大于 电泳流速度，故它将在中性粒子之后 流出，各种粒子因迁移速度不同而实 现分离。
5 3
1:APTS-glucose 2:APTS-glucopyranosyl-a-1,6-glucose 3:APTS- glucopyranosyl-a-1,6- glucopyranosyl-a-1,6- glucose
10 14 10 20
Rel. Unit (RU, x1E+01)
2.0
A: Dextran-1,000 (average Mwt: 1000)
二、基本原理

电渗是CE中推动流体前进的驱动力，它使 但在HPLC中，采用的压力驱动方式 整个流体像一个塞子一样以均匀的速度向 使柱中流体呈抛物线型，其中心处速 前运动，使整个流型呈近似扁平型的“塞 式流” ，它使溶质区带在毛细管内原则上 度是平均速度的两倍，导致溶质区带 不会扩张。 本身扩张，引起柱效使其分离效率不 如CE。


20世纪30－40年代 蒂塞利乌 斯 (A.W.K.Tiselius）建立了移动 界面电泳，将电泳发展成分离技 术 获得1948年诺贝尔化学奖
1981年 J.W.Jorgenson,K.D.Lukacs实验上和理论上为毛 细管电泳的发展奠定了基础。 上一世纪后二十多年分析化学领域中发展最迅速的分离分 析方法。
0.006
0.006
0.004
0.004
3
4 5 HbA
F
AU
0.002
0.002
0.000
0.000
AC
-0.002
C
-0.002
-0.004
-0.004
AS
AA 0
3.6 3.7 3.8 3.9 4.0 4.1 4.2 4.3 Minutes
S
-0.006
6
J
-0.006
7
N
-0.008
A2 1
也称为虹吸进样、重力进样、压差进样
方法:毛细管进样端插入试样溶液容器，通过 进样端加压，或检测端出口减压，或调节 进样端试样溶液液面大于出口端缓冲液液 面高度，利用虹吸现象，使进样口端与出 口端形成正压差，并维持一定时间，试样 在压差作用下进入毛细管进样端，再把进 样端放回缓冲液液槽中，进行电泳。
三、进样与检测
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.
蛋白质/多肽/氨基酸 糖类/糖蛋白 核酸/核苷酸 天然产物 合成药物 手性物质 无机/有机离子 病毒/细菌 水溶液中的分子间相互作 用
1. 不同分子量蛋白的分离
2. 血红蛋白的检测
0
1 2
EOF
A2 C, E, O S, D, G
0.008 0.008
少样品的前处理步骤； D. 可自由选择被分离物质的类型，从而使图谱清晰； E. 前处理过程简单，甚至勿需前处理； F. CE所需样品用量小，可以分析一些难以取得而又 样品量有限的生物样品，如泪液等。
缺点： 但CE仅能实现微量制备，而HPLC可作常量 制备； CE的定量精密度稍低于HPLC，采用电动进 样和外标法定量时定量精密度较差。
2
30
B: Dextran-5,000 (average Mwt: 5000)
40
1.0
1 20
40
C: Dextran-12,000
50 60
10 2
10.00
20.00
30.00
Time (min)
7. 药材中的生物碱成分分析
1 苦参碱 2 槐定碱 3 槐果碱 4 lehmannine 5 sophoramine 6 氧化苦参碱
2 检测方法
检测器
UV－可见吸收 荧光 非相干光诱导 激光诱导 电化学 电导 安培 质谱
检出限（mol/L）
10-5－10-6 10-7－10-8 10-10－10-12 10-5－10-7 10-8－10-9 10-7－10-9
特
点
近似通用，常规应用 灵敏，但试样通常要衍生 高灵敏度，价格昂贵，要衍生化 通用性 选择性，灵敏度高，微量 仪器复杂，可获结构信息， 质量灵敏度高 灵敏度高，操作有特殊要求
第二部分 分离模式
1 毛细管区带电泳 2 胶束电动色谱 3 毛细管凝胶电泳 4 毛细管等速电泳 5 毛细管等电聚焦 6 毛细管电色谱
1 . 毛细管区带电泳
CZE 也称为毛细管自由溶液区带电泳 毛细管电泳中最基本的操作模式，应用最广泛，是其 它各种操作模式的母体
2. 胶束电动色谱（MECC）
MECC的原理：在电动色谱中引入了表面活 性剂胶束，在电场作用下，毛细管水相可 看作流动相，胶束相可看作“准固定相”， 溶质由其在胶束相和水相中的分配系数不 同，而在不同的时间流出，从而达到了分 离。
MECC的分离原理
加入高于胶束临界浓度的 表面活性剂
胶束电动色谱的应用特点:



使毛细管电泳不仅能分离离子化合物，而且还能分离 中性化合物. 比高效液相色谱更为高效. HPLC 分离柱效为5000－25000理论板数/m MEKC 可达到50000－500000理论板数/m 比高效液相色谱更为高速.MEKC分离时间通常小于 30min，但达到相仿效率的毛细管LC，需要更长的时 间。
2）特点: 等电聚焦实际上也是一个试样浓缩过程， 这一过程可用于浓缩试样组分。 具有极高的分辩率，可以分离等电点相差 0.01pH的两种蛋白质. 注意:电渗流的存在会破坏聚焦区带的稳定
5.毛细管电色谱（CEC）

CEC:以电渗流驱动流动相，开管和 填充两种。
比高效液相色谱具有更高的柱效
第三部分 毛细管电泳的应用
9
1
3
6
5
7
8
2
0.0000 3.0
4
4.0
5.0 Minutes
6.0

1: CL-, 2: NO3- ，3：SO42-， 4：C2O42-，5：苹果酸根，柠檬酸根，6： 醋酸根，乳酸根，7：磷酸根
THE END!
五、CE的预浓缩技术

样品浓缩技术是采用特殊的进样过程将大 体积的样品溶液中的痕量被测物浓缩后进 行分离，从而提高检测灵敏度的一种技术。
等速电泳 电堆积 场放大进样 色谱预浓缩 pH梯度

六、CE的优缺点
优点：
A. CE的分析时间通常不超过30min，比HPLC速度快； B. 柱效要比HPLC高得多； C. 毛细管电泳多采用空管毛细管，容易清洗，可减




有机溶剂乙腈在CE的生物样品预处理中， 既可除去蛋白又可释放蛋白结合的药物， 还可提高疏水性药物的溶解度，而且在CE 的电泳中还有在线富集的作用，所以常用 2～3倍体积的乙腈提取生物样品中的药物。 可以用液-液萃取和固相萃取小柱离线纯化、 富集样品，将生物样品中高浓度的无机盐 除去，浓集效率为10～30倍，
三、进样与检测
1

进样方法 电动进样
也称电迁移进样. 方法:将毛细管的进样端插入装有试样溶液的 试样管中，试样管中插入电极，与检测端的 缓冲液间施加进样电压，并维持一定时间， 试样溶液在电泳和电渗流作用下进入毛细管， 然后再将试样溶液换成载体缓冲液，电泳即 可进行。
三、进样与检测
1

进样方法 流体动力学进样
4.4来自百度文库
F 2
4.5
A 3 4
4.6 4.7
-0.008
5
4.8
6
4.9
7
5.0
AU
3. 四种碱性蛋白的分离
4种碱性蛋白的电泳分离图。A：涂层管；B：未涂层管。 1：细胞色素，2：溶菌酶，3：胰蛋白酶原，4：α-胰凝乳蛋白 酶原
4. DNA、核酸的分离
DNA片段电泳迁移时间图
5.单糖的分离
6. 寡糖图谱
7 氧化槐果碱 8 金雀花碱 9 苦豆碱 10 蝙蝠葛碱 11 东莨菪碱
8. 药材中黄酮化合物的分析
对照品 样品
OG：木蝴蝶素A －7－O-葡萄苷酸
B：黄芩素
WG：汉黄芩素－7－O-葡萄苷酸
W：汉黄芩素
BG：黄芩苷
O：木蝴蝶素A
9. 盐酸苯丙醇胺的异构体杂质检测
10. 啤酒中的阴离子分析
0.0030 AU PDA - 233nm
3 . 毛细管凝胶电泳（CGE）
CGE是毛细管自由溶液区带电泳派生出的一种 电泳方式,用多孔性的凝胶或其它筛分剂作介 质，网状结构，按分子的大小分离。
毛细管凝胶电泳综合了电泳技术和平板凝胶 电泳的优点 :
a. 电泳峰尖锐，柱效极高 b. 短柱上实现极好的分离 c. 试样容量为10－12g 主要缺点:制备柱较困难，寿命较短
已成为分离分析生物大分子如蛋白质、多肽、核 酸、DNA等强有力的工具。例应用CGE分离与 激光诱导荧光检测相结合，用于DNA序列快速 分析。
4.毛细管等电聚焦（CIEF）
1）CIEF的原理: 建立在不同蛋白质或多 肽之间等电点（pI值）差异基础上的分 离方法。 蛋白质的等电点(pI):指蛋白质分子的表 观电荷数为零时的pH值。
第九章 高效毛细管 电泳法
（Capillary Electrophoresis, CE）
沈富兵
教学要求

掌握毛细管电泳法的基本原理 熟悉主要分离模式和毛细管电泳法的优点 了解毛细管电泳法中的预浓缩技术
定义


高效毛细管电泳(High Performance Capillary Electrophoresis，HPCE)又叫毛细管电泳 (capillary electrophoresis，CE)，指以高压电 场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据 样品中各组分之间淌度（电渗流的大小单 位）和(或)分配行为上的差异而实现分离的 一种液相分离技术。 CE是经典电泳技术和现代微柱分离技术相 结合的产物。