三代测序原理

三代测序原理

三代测序技术（Third Generation Sequencing，TGS）现在主要有美国的 Pacific Biosciences（PacBio）的 SMRT 和英国的Oxford Nanopore Technology的nanopore 技术。

首先对测序来说，最好是对原模板进行直接测序，并且不受读长的限制，但是显然二代测序无法达到这两点，而三代测序弥补了这两点不足。可以对单分子进行测序，nanopore 还能避免在扩

增的过程中造成的偏好性，对单分子进行测序读长超过了 2 Mb，还能检测碱基修饰等信息。

1、 SMRT 技术

这个技术关键的是有一个称为零级波导（zero-mode waveguides， ZMW）的纳米结构。ZMW是一个孔状的光电结构，底部有一个激发光，并且固定着 DNA 聚合酶。这个激发光在进

入 ZMW 后会呈指数级衰减。当进行合成反应的时候模板和引物

与酶结合，互补配对的 dNTP 因为在底部停留的时间较长，所以能够被激发光激发荧光信号，而其他的游离 dNTP 则信号弱，这样子就有力区分了背景噪音和荧光信号。在进行一次反应后，由于荧光基团是被固定在 dNTP 的 5’磷酸位上，脱水缩合时能

够将荧光基团去除，便于进行下一次的反应。SMRT 测序最大限

度地保持了聚合酶的活性，是最接近天然状态的聚合酶反应体系，它的损伤主要是由于激光造成的。

另外通过检测间隔碱基之间的时长可以判断是否存在修饰，因为修饰碱基会影响聚合酶反应的速度，光谱也会发生变化。

这个方法的缺点也很显而易见，因为在进入 ZMW 之前并没有形成DNA 簇，检测的是单分子的荧光信号，因此错误率比较高。但是由于这种错误是随机误差产生的，可以通过多重测序进行纠正。

为了提高测序的准确性，PacBio 公司在 2019 年推出了高精度的 HiFi 测序。通过 CCS（Circular Consensus Sequencing）技术，能够将测序准确度达到 99% 以上。

这种技术主要运用了滚环复制的优势。这边所用到的DNA 聚合酶的活性很强，酶读长远远大于插入片段的读长，因此通过adapter 将 DNA 双链形成环状，使酶围绕着一个模板链进行多次测序，以此来提高测序的准确性。

2、纳米孔测序技术

该测序技术的主要原理是：在小孔的两端加上恒定的电压。当单链的 DNA / RNA 通过纳米孔时，因为不同碱基的形状不同，产生不同大小的电阻，通过检测电压的变化情况，可以判断碱基的类型。

根据测序的方式不同，可以分为两种：外切酶测序和链测序。（1）外切酶测序：

在膜的两侧放上不同浓度的 KCl 溶液，DNA 单链在核酸外切

酶 I 的作用下，被依次剪切为单核苷酸，检测单核苷酸通过纳米孔时引起的电流变化可以读取 DNA 的序列。

（2）链测序：

先用解旋酶将双链解旋为单链，马达蛋白控制核酸通过纳米孔的速度。能够解决因为核酸移位速度过快以及电流变化幅度较小造成的差异。

理论上来说，纳米孔测序能够检测 DNA 和 RNA 的序列。

芯片可以重复使用直到纳米孔损耗低于质检标准。能够达到很长的读长，平均在几十到几百 kb，是目前测序量最高的平台之一。

二代测序和三代测序的区分

（1）首先是在测序的读长方面，二代测序读长普遍在几十到几百 kb 之间，而三代测序读长甚至能够达到 Mb 的水平；（2）其实是使用的单分子测序还是扩增后测序的差异。三代测序均采用单分子测序，而二代测序均为克隆后测序；

（3）Ion Torrent，Illumina，PacBio 采用边合成边测序，而华大的采用探针技术，nanopore 采用了纳米孔测序；

（4）在检测方法上，Illumina，华大和 PacBio 采用光信号，

Ion Torrent 采用了pH,是第一台没有用到光学感应的高通量测序平台。nanopore 采用了电信号。