实验三 革兰氏染色法

四、实验步骤
1.涂片
2.干燥
3.固定
水洗、吸干
5.镜检
Байду номын сангаас
4.染色
四、实验步骤
1、涂片
取洁净载玻片 1 片，将 1滴纯水置于玻片上，接 种环灭菌后取菌少许，与水滴混匀并涂成直径约 1cm 的薄膜。如用液体培养物涂片，可直接取培养 物涂于玻片上，不加纯水（注意滴纯水和取菌时不 宜过多且涂抹要均匀，不宜过厚）。有菌的接种环 应立即在火焰上烧灼灭菌。
二、实验原理
涂片固定 结晶紫初染 碘液媒染 乙醇脱色 番红复染
二、实验原理
二、实验原理
革兰氏阳性菌
革兰氏阴性菌
二、实验原理
革兰氏染色的机理
机理：与细胞壁厚薄、肽聚糖和类脂含量有关
G+ 菌：细胞壁厚，肽聚糖含量高，交联度大， 当乙醇脱色时，肽聚糖因脱水而孔径缩小，导致 结晶紫-碘复合物被阻留在细胞内，细胞不能被酒 精脱色，番红复染后仍呈紫色。
五、注意事项
7、选用适龄培养物，以 18～24小时为宜，否则影 响染色效果。 8、细菌染色标本观察后应放入规定的消毒缸中消毒 处理。
六、思考题
1、哪些环节会影响革兰染色结果的正确性？ 2、革兰染色有何实际意义？
Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能 使其结构收缩，而且含脂量高,乙醇将脂溶解，缝 隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，酒精将细 胞脱色，番红复染后呈红色。
三、实验器材及试剂
• 枯草芽孢杆菌、大肠杆菌 18～24h 培养 物 • 革兰染色液一套（草酸铵结晶紫染液、卢 戈碘液、95%乙醇、番红染液） • 酒精灯，玻片，接种环，吸水纸，香柏油， 二甲苯，显微镜。
四、实验步骤
2、干燥 将涂片放空气中自然干燥，或在离火焰较远处
烘干，切勿高温烘烤，因温度太高会破坏菌体形态。
3、固定 手持载玻片一端，将涂片在火焰外焰上连续通
过 3 个来回，每个来回约1s， 就可固定标本，直 到手背试触涂片反面热而不烫为宜。
四、实验步骤
4、染色
①初染：滴加结晶紫染液1～2滴于标本面上，染色 1min，轻轻水洗，甩干； ②媒染：滴加卢戈碘液1～2滴于标本面上，染色 1min，轻轻水洗，甩干； ③脱色：滴加95％酒精1～2滴于标本面上， 频频倾 动玻片， 直到不再溶下染料为止， 约30s， 视标本 片材料厚薄而增减时间，然后水洗，甩干；
实验三 革兰氏染色法
一、实验目的
1. 学会细菌制片方法； 2. 掌握革兰氏染色方法及结果判断。
二、实验原理
革兰染色法是由丹麦医生Christian Gram 于1884年创立的一种细菌鉴别染色法， 根据 染色结果将细菌分成两大类， 即革兰阳性菌 （G+）和革兰阴性菌（G-），此有助于细菌 鉴别、分析细菌的结构特点、致病性和选用抗 菌药物提供依据。
五、注意事项
5、染色时注意看清染料名称，按序进行、滴加染料 以能覆盖涂片为度不宜过多，要掌握好染色时间， 尤其是酒精脱色时间，不宜过长或过短。染色中除 脱色时摇动玻片外均要端平玻片或将其静放台面上。 染色过程中，不可使染液干枯。
6、水洗切勿先倒去染料，而是用较小水流冲洗在玻 片一端，用水流将它们缓缓带走，避免直接冲洗菌 膜处，要切忌将未经火焰固定的标本染色水洗。
④复染：加番红染液1～2滴于标本面上，染1min， 水洗后吸干。
四、实验步骤
5、镜检 用毛边纸或滤纸轻轻吸干(珍贵标本应自然干燥)，
待标本充分干燥后加油，用油镜观察并判断细菌的 染色结果。
6、实验后处理 用二甲苯擦油镜镜头后用擦镜纸擦干，整理、
清洁显微镜，把显微镜放回原处，把标本片放入消 毒缸中消毒5min后清洗。
四、实验步骤
结晶紫
碘液
1
2
酒精
番红
3
4
五、注意事项
1、玻片要洁净无油，否则菌液不易涂开。不宜选用 厚玻片，以免标本观察时视野难调清。
2、涂片时注意大小、位置、厚薄等问题。 3、干燥一般用自然干燥法，必要时可在酒精灯火焰 上方热空气中烘干，切勿紧靠火焰。
4、固定的目的是杀死细菌，使其蛋白凝固粘附在玻 片上，改变细菌对染料的通透性便于着色，要注意 固定的方法是标本向上在酒精灯的外焰上来回3次， 约1s一个来回，3s后以手背试贴玻片热而不烫为宜。