中山大学-植物生理学学实验-植物组织培养综述

植物组织培养

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（中山大学生命科学学院生物技术与应用基地班广州 510275）

摘要植物组织培养是细胞生物学研究中的常用技术。主要内容是在人工模拟的植物体内生理环境中，对外植体进行培养，使其生存、生长、繁殖或传代，并加以观察和研究。植物组织培养以细胞全能性为理论基础，实际操作包含培养基的配制、外植体的处理与消毒灭菌、接种、培养等主要步骤。植物组织培养的成功与否受培养基成分、外植体的选择、实际操作等因素的影响。

关键词植物；外植体；组织培养；

1 引言

植物组织培养技术，是一种将植物体的部分细胞或组织与母体分离，在适当的条件下加以培养，使它们能够生长、发育、分化与增殖的技术。原理是来自植物细胞的全能性分化能力，即植物体内的某一类细胞，能够独立发育并且分化成为完整的植物成体的能力。植物组织培养能够以少量的母体培养出大量的植物，这使植物组织培养具有广泛用途。

植物组织培养技术的诞生发与展可溯已久。1902年，德国植物学家G. Haberlanclt基于细胞全能性理论，提出了植物体细胞在适当的条件下, 可不断分裂分化, 最终发育成完整植株的潜力的观点。 1943 年, 美国学者White 在使用烟草愈伤组织作为实验材料的实验中,偶然培养得到了芽组织，首次证明了G. Haberlanclt观点具有正确性。 1958年，美国植物学家Stiefvater等人，利用胡萝卜韧皮部的细胞进行培养，最终得到完整且可以开花结果的植株，确切证实了G. Haberlanclt的观点。进入20世纪60年代以后，组织培养技术在基础理论、实际操作方面不断取得进展，相继在植物体细胞杂交、单倍体育种、种质资源保存、快速育苗、人工种子制造、次生代谢物生产等方面有了可喜的成果，已经成为基础坚实、易于掌握、应用面广的一种技术手段，广泛应用于研究、生产的众多领域，创造了巨大价值。[1][2]

2 植物组织培养基本原理

植物细胞的全能性是植物组织培养的理论基础。外植体是离体的植物组织或细胞。在适宜条件下在培养了一段时间后，外植体中高度分化的植物细胞会发生去分化作用变为薄壁细胞，薄壁细胞继续分裂会形成愈伤组织。愈伤组织经过继续的培养，重新分裂分化形成根与芽（胚状体），而根和芽接下来可发育为含有叶、茎等器官的完全植物体。

植物组织培养的一个关键步骤就是诱导愈伤组织的形成，培养基在这里扮演了重要角色。组织培养的基础培养基有MT、MS、SH、White、N等，目前普遍使用的是MS培养基。MS培养基含有各种植物所需的大量元素、微量元素、有机物和植物激素。其中植物激素作用关键,可以诱导产生愈伤组织、胚状体、不定芽、根等器官,其含量与种类还决定了植物组织的分化与发育方向。[1][3]

3 植物组织培养过程

植物组培的大致过程是：在无菌条件下，将植物器官或组织（如芽、茎尖、根尖或花药）的一部分切下来，用纤维素酶与果胶酶处理用以去掉细胞壁，使之露出原生质体，然后放在适当的人工培养基上进行培养，这些器官或组织就会进行细胞分裂，形成新的组织。不过这种组织没有发生分化，只是一团薄壁细胞，叫做愈伤组织。在适合的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下，愈伤组织便开始分化，产生出植物的各种器官和组织，进而发育成一棵完整的植株。

下面以我们的课程内容——菊花花瓣分化培养的基本操作为例介绍一下具体的步骤：

培养基的配制

实验所用MS培养基分为分化培养基和生根培养基：

分化培养基成分为MS+3mg/L6-BA+0.1mg/L NAA+糖3%+琼脂0.7%，pH 5.8。

生根培养基成分为MS+0.5mg/L NAA+糖3%+琼脂0.7%，pH 5.8。

②外植体的处理与消毒灭菌

取新鲜的菊花花瓣，用清洁剂或洗衣粉洗净，之后自来水冲洗30min，干燥水分。移入超净工作台，用70%的乙醇溶液消毒0.5min，后用0.1% HgCl2溶液消毒10min。最后用无菌水洗5~7次，干燥水分。

③接种

在超净台中把菊花花瓣头尾剪去，余下部分剪成0.8-1cm的小段，接种在承有培养基的150ml 锥形瓶中，每瓶1-2段。

④培养

接种后，在26~28℃，光照度1000~2000lx，每天照光12h的实验室条件下培养14d左右，就可诱导出愈伤组织。愈伤组织在原条件下培养10~15d便可分化出不定芽。当芽长到1~2cm时，分割芽转入生根培养基中，继续培养10d上下，就可长出白根，形成完整的植株。[2][4]

4. 影响植物组织培养成功的因素

植物组织培养成功与否，除了规范的操作作为保障，还与其它一些因素密切相关。

4.1 培养基成分

4.1.1 基本培养基与pH 值

不同植物、不同外植体进行植物组织培养培养要求的基本培养基均有差异。不同基本培养基的成分（盐浓度、有机物含量等）会有不同。例如，某一植物的外植体在培养过程中要求较高的盐浓度，而这样的浓度用于另一外植体则会造成褐化现象。因此，二者要选择不同的基本培养基。

培养基的pH 值因培养材料不同而异, 大多数植物种类要求pH 值在5. 0~ 6. 0。培养基的pH值可以通过影响培养物的营养元素的吸收过程来影响呼吸代谢、多胺代谢与脱氧核糖核酸合成、植物激素进出细胞等作用, 进而直接或间接地影响愈伤组织形成及形态建成；适当降低PH值还可有助于抑制褐化现象。

4.1.2 外源激素的种类和浓度

植物组织培养中，只有使用适当的外源激素才能绣导细胞分裂的启动、愈伤组织生长以及根、芽的分化等合乎理想的变化。不同的植物、不同的外植体对于不同种类、浓度的外源激素反应不同。

①生长素类

生长素类的主要作用是使已停止分裂的植物细胞恢复分裂能力。常用生长素有2, 4- D( 2, 4- 二氯苯氧乙酸) 、NAA( 萘乙酸) 、IAA( 吲哚乙酸)、IBA( 吲哚丙酸) 等。不同植物种类对生长素的浓度反应不同, 一般而言, 2, 4- D 是生长素中诱导愈伤组织和实现细胞悬浮培养最有效的物质，常用浓度为0. 2~ 2. 0 mg / L。实际效果视具体情况而定，例如较高浓度的2, 4- D 对 Chinese Leymus 组织培养再生芽的诱导和再生非常有效。

②细胞分裂素

细胞分裂素通过促进细胞的分裂和扩大, 使茎增粗, 抑制茎伸长, 诱导芽的分化, 进而促进侧芽萌发生长。常用的细胞分裂素有激动素( KT) 、6 - 苄基腺嘌呤( 6- BA) 等。细胞分裂素在诱导愈伤组织的时候, 一般要和生长素配合使用, 增强生长素的诱导作用和效果。在愈伤组织的诱导、器官发生和增殖过程中, 细胞分裂素和生长素的比例是非常重要的，当细胞分裂素含量高时产生不定芽, 反之, 产生不定根或维持愈伤组织。而两者的具体比例因内、外源激素的含量不同而不同, 并且内、外源激素对植物离体培养形态发生起着相互的连续性作用。细胞分裂素对某些植物胚性细胞的诱导有抑制作用。因此, 要根据需要选用适当的细胞分裂素种类。

4.1.3 碳源