第二讲菌种保藏

2.诱变处理的基本方法 1）诱变剂的选择
（1）诱变剂选择的原则： ①根据实际操作方便； ②采用已成功的经验； ③考虑诱变剂的作用机制，选择不同的方法。 如紫外线作用于DNA分子的嘧啶上，而亚
硝酸作用于DNA分子的嘌呤上，二者混合使用 可使突变谱增宽，但需经过多次分离纯化才可获 得稳定的变异株。
（2）诱变剂剂量的选择： 能够提高正变异幅度的诱变剂量,称为诱变剂
青霉
桔青霉
3. 根霉属（Rhizopus ） 米根霉（R. oryzae） 华根霉（R. chinensis）
4. 红曲霉属（Monascus）
（四）酵母（yeast）
1. 酵母属（Saccharomyces） 2. 啤酒酵母（Saccharomyces
cຫໍສະໝຸດ Baidurevisiae） 2.假丝酵母属（Candida）
步骤二
轻触营养平板上无菌的琼脂处冷却
步骤三
以接种针轻触菌落，使接种针上沾有细菌。
步骤四
更换一个新的无菌营养平板
步骤五
将接种针上的细菌划于一个新的营养平板 上。此为第一菌区 。
步骤六
重复第一步骤，将接种针以火焰灭菌法 灭菌，然后轻触琼脂无菌处冷却。
步骤七
由第五步骤的第一区中划出第二 区，如右上图。
复筛的菌种应及时保存，避免过多传代而 造成新的退化。
a.通过目的代谢产物的考察 通过摇瓶培养进行复筛，以进一步考察
菌种的生产能力的稳定性。 b.传代的稳定性试验
随着菌种的逐级扩大，经过多次传代产 量仍保持稳定的菌种才能用于生产。
在传代过程中要保持试验条件的一致性， 以便能正确的反应各代间生产能力的差异。
产朊假丝酵母（Candida utilis） 3.毕赤酵母属（Pichia）
（五）其它微生物
1.担子菌（basidiomycetes）即菇 类（mushroom） 2. 藻类（alga）
几 种 菌 落
（六）噬菌体（phage）
危害以细菌和放线菌为 生产菌株的发酵工业。
二、微生物发酵工业对菌种的要求
（2）增殖培养 方法： ①控制培养基成分 ②控制培养条件 ③抑制不需要的菌类 一般情况下采来的样品可以直接进行分离培养，
但如果样品种所含菌类的含量不多，而有大量的 杂菌时，可以通过选择性配制培养基（营养成分、 添加抑制剂）、选择一定的培养条件（如培养温 度、培养基的酸碱度）来控制。
分离细菌时可加入制霉菌素或放线菌酮， 抑制真菌生长。G-菌时可加入结晶紫、煌绿、 胆汁。培养基呈微碱性。
吸取准备好欲稀释的菌液
吸取充分均匀后的菌液
取含有 9mL无菌水之试管，将试管口过火灭菌。 将菌液置入，此时试管须做记号为第一次稀释。
将 试 管 于 震 荡 机 上 ， 使 菌 液 混 合 均 匀
取出试管中的第一次十倍稀释菌液1mL， 加入另一个新的含9mL无菌水的试管中。 重复此步骤直至所需要的稀释浓度。
从最后稀释菌液中吸取 0.1mL菌液， 置入准备好的无菌琼脂内。
将三角玻璃棒浸于酒精中
将三角玻璃棒在火焰上燃烧 （须注意勿使燃烧中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃烧）
使用玻璃棒将菌液均匀涂布开来，将培养皿置于 恒温培养箱中隔天观察菌落数目，再依照稀释倍数 推算出菌液浓度。
（4） 生产性能的测定 一般采用两步法：
1.生长迅速，目的产物产量高。 2.易控制培养条件，发酵周期较短。 3.抗杂菌和噬菌体的能力强。 4.不易变异和退化，不产生任何有害物质和毒素。
三、工业微生物菌种的选育
（一）自然选育
1. 自然选育的目的： （1）保持菌种优良性状的稳定性 （2）减少变异或降低变异退化的速度 （3）获得优良菌种
2.自然选育的方法 采样、增殖培养、分离培养和筛选。 （1）采样 ①土样（野生性菌株） ②发酵液（生产性菌株）
分离放线菌时加入植物、岩石、有机混合腐 质等的浸出液作为促生因子，也可用营养贫瘠 或含几丁质的琼脂培养基。
分离霉菌用低碳/氮比的培养基，再加入一 定的抗生素；微酸性培养基。也可加入1： 3000的玫瑰红
（3） 纯种分离 ①划线法：简单、快捷。 ②稀释法：菌落单一均匀。
划线分离法：
步骤一
接种针先以火焰灭菌法灭菌
链霉菌（Streptomyces） 小单孢菌属（Micromonospora）
蜡样芽孢杆菌 乳酸杆菌
（三）霉菌（mould）
1.曲霉属（Aspergillus） 黑曲霉（A. niger） 米曲霉（A. oryzae） 黄曲霉（A. flavus）
2.青霉属（Penicillum） 桔青霉（P. citrinum）
初筛：以量为主 复筛：以质为主
①初筛： 通过表现形态来淘汰不良菌株
从菌落的大小、生长速度、颜色、孢子形 成等形态特征分析判断，去除可能低产的菌 落，而将高产性菌落分离、筛选出来。使琼 脂平板培养基上的主要菌落占90%以上。
②复筛 经过分离培养，在平板上出现
很多单个菌落，通过菌落形态观察，选出所需 菌落，然后取菌落的一半进行菌种鉴定，对于 符合目的菌特性的菌落，可将之转移到试管斜 面纯培养。
第一节 菌种选育
一、发酵工业常见微生物
（一）细菌（bacteria）
醋杆菌属（Acetobacter） 乳杆菌属（Lactobacillus） 芽孢杆菌属（Bacillus） 短杆菌属（Brevibacterium） 棒杆菌属（Corynebacterium）
（二）放线菌（actinomyces） 最大的经济价值在于产生多种抗生素
步骤八
重复第六以及第七步骤，由第七步骤的 第二区中划出第三区，如右上图。
步骤九
重复第六以及第七步骤，由第八步骤的第三 区中划出第四区，划满剩下的空间。完成后 的营养平板，如右上图。
步骤十
在营养平板上贴好标签，标示好接 种日期、操作者姓名、菌种学名以及培 养基名称。
固体培养基的稀释涂抹接种法
需要使用的仪器——震荡机
（二）诱变育种
用各种物理、化学的因素人工诱发基 因突变，从而获得高生产能力的菌种。 诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质。
{ 物理：紫外线，快中子
诱变剂的种类 化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍
1.诱变育种的主要环节 （1）以合适的诱变剂处理细胞悬浮液
——诱变 （2）用合适的方法淘汰负效应变异株，
选出性能优良的正变异株——筛选