河北和山东鸭梨果实上链格孢菌鉴定
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(1. Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100029, China; 2. Hebei Exit and Entry Inspection and Quarantine Bureau, Shijiazhuang 050071, Hebei Province, China)
孢 A. ya liinficiens R. G. Roberts[2 ]和 A. ven tricosa R. G. Roberts[ 3] 。其中 A. ga isen 既能侵染梨叶片也能 侵染梨果实 ,并产生寄主专化性毒素 ———AK毒素 ,是 真正的梨黑斑病病原 [1 ] ; A. a lterna ta 和 A. tenu issim a 为对基质广适性链格孢种 ,多生于植物的枯死部分或 衰弱组织上 [1 ] ; A. ya liinficiens和 A. ven tricosa 是美国 学者 R. G. Roberts分别于 2003年和 2007年从中国 出口的鸭梨果实上分离并命名的两个新种 [ 2 - 3 ] 。 近几年 ,对 A lterna ria 的鉴定 ,除采用传统的形 态学鉴定外 ,不少学者尝试用分子生物学的方法 ,如
定 。供试菌株在 PDA 平板上培养 3 ～5 天后 ,从菌 落边缘取菌丝块并进一步切成极细的小块 ,移到 50 mL马铃薯 - 葡萄糖培养液中 , 25 ±0. 5 ℃条件下摇 床 150 r/m in震荡培养 2天 ,经滤纸抽滤菌丝 ,无菌 水 冲洗 3次后 ,用灭菌吸水纸吸去多余的水份 ,置
- 20 ℃冰箱中保存备用 。另从 GenB ank上下载 22 个 A lterna ria 不同菌种的序列进行系统发育关系分 析 (表 1) 。 1. 3. 2 总 DNA提取 :总 DNA 提取采用 CTAB ( cetyl2 triethylammonium brom ide)法 [ 2 ] 。 1. 3. 3 PCR 扩增 : PCR 反应体系 : 10 ×PCR 缓冲液 5μL、2. 5 mmol/L dNTP 1μL、10 mmol/L 引物 1μL、 Taq酶 1 U、模板 DNA 0. 1 mg,加双蒸馏水至 50μL。 空白对照不加任何 DNA 模板 。选用王洪凯等 [ 5 ]报 道的一对引物 ITS1 和 ITS4 扩增核糖体基因 ITS12 5. 8S rDNA 2ITS2区 ,正向引物 ITS1序列为 5′2TCCG2 TAGGTGAACCTGCGG23′;反向引物 ITS4序列为 5′2 TCCTCCGCTTATTGATATGC23′。扩增程序 : 94 ℃变 性 5 m in; 94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 35个循环 ; 72 ℃延伸 7 m in。选用 B erbee等 [ 8 ]报道的一对引物 gpd1和 gpd2扩增 gpd 基因片段 ,正向引物 gpd1 序 列为 5′2CAACGGCTTGGGTCGCATTG23′; 反 向 引 物 gpd2 序 列 为 5′2GCCAAGCAGTTGGTTGTGC23′。扩 增程序 : 96 ℃变性 2 m in; 96 ℃ 1 m in, 48 ℃ 1 m in, 72 ℃ 1 m in, 30个循环 ; 72 ℃延伸 10 m in。 1. 3. 4 序列分析 : PCR产物由上海博亚生物技术有 限公司测序 。将测得的序列与 GenBank 下载的部 分链格孢菌的基因序列 (表 1)一起 ,用 C lustal X1. 8 软件进行比对 ,采用最大简约法 (M P)构建系统发 育树 。在最大简约树 (树集 )搜索中 ,采用启发式方 法搜索最佳系统树 ,所有特征被认为是等权和无序 的 ,同 时 , 在 分 析 前 排 除 非 简 约 信 息 位 点 。Boot2 strapp ing用于评价各节点的支持率 ,测试中重复 1 000次 。 1. 3. 5 寄主专化性毒素 (AK毒素 )基因检测 :根据 GenBank中发表的 AK毒素合成酶基因序列 (Acces2
38
植 物 保 护 学 报
36卷
王洪凯等 [ 5 ]用 5. 8S rDNA 及 ITS区序列分析了链格 孢的种级分类 ;孙霞等 [ 6 ]用 RAPD 方法分析了鸭梨 上的 A lterna ria各种间的亲缘关系 ;薛峰等 [ 7 ]对 U lo2 clad ium、S tem phy lium 和 A lterna ria 的典型菌种进行 了分子系统发育分析 ,构建了 ITS和 gpd 基因序列 分子系统发育树 。
Iden tif ica tion of A lterna ria isola tes from Ya 2pear fru its in Hebe i and Shandong prov inces
Yan J in1 Shi Zongwei13 Song Fu2 Huang W ensheng1 Chen Yan1 Zhao W ensheng2
作者于 2005年收集了河北和山东两省部分冷 库中储存的具 A lterna ria 侵染症状的鸭梨进行了病 原菌分离和鉴定 。
1 材料与方法
1. 1 病菌分离 从河北和山东两省部分果园的冷库中Βιβλιοθήκη Baidu集到表
面有黑斑症状的鸭梨 100余个 ,用 70%酒精擦洗病 健交界处及果柄表面 ,去除表皮 ,取果肉腐烂部分平 铺在带三层湿滤纸的培养皿内 ,并取果柄靠近基部 的一段纵向剖开 ,在滤纸上均匀摆好 。置于培养箱 中 ,光照和黑暗各 12 h交替 , 25 ℃下培养 3 ～5 天 。 将出现链格孢菌的培养皿置于实体显微镜 50 ×下 观察 ,用解剖针挑取具有典型产孢结构的单根孢子 链上的孢子转接于马铃薯 - 胡萝卜培养基 ( PCA ) (马铃薯 20 g、胡萝卜 20 g、琼脂 15 g、蒸馏水 1 000 mL )平板上 。将平板置于上述光照和温度条件下培 养 5～7天 。 1. 2 形态鉴定
第 36卷 第 1期 2009年 2 月
植 物 保 护 学 报
ACTA PHYTOPHYLAC ICA SIN ICA
Vol. 36 No. 1 Feb. 2009
河北和山东鸭梨果实上链格孢菌鉴定
严 进 1 施宗伟 13 宋 福 2 黄文胜 1 陈 岩 1 赵文胜 2
由链格孢 A lterna ria 引起的梨果实上的黑斑病 是重要的储藏期病害 ,在果实表面造成近圆形或不 规则黑褐色病斑 ,中间凹陷 ,潮湿时病斑表面生黑色 霉层 ,影响水果的质量和商品价值 。2004 年我国鸭 梨曾因黑斑病而被停止出口美国和加拿大 。
目前 ,世界上已报道的从梨果实上分离到的链 格孢共有 9个组 ,已命名的有 9 个种 [ 1 - 4 ] 。在中国 已报道的有 5 个种 ,分别是梨黑斑链格孢 A. ga isen K. Nagano、链格孢 A. a lterna ta ( Fr. ) Keissler、细极 链格孢 A. tenu issim a ( Fr. ) W iltshire、鸭梨侵染链格
(1. 中国检验检疫科学研究院 , 北京 100029; 2. 河北出入境检验检疫局 , 石家庄 050071)
摘要 : 为了查清造成鸭梨果实储藏期黑斑病的链格孢 A lterna ria 的种类 ,从其产孢表型 、分生孢子 特征和分子生物学等方面对分离的链格孢菌进行了研究 。经对分离到的 188支 A lterna ria菌株的 形态学鉴定 ,共确定了 3个种 ,即链格孢 A lterna ria a lterna ta、细极链格孢 A. tenu issim a和侵染链格孢 A. infectoria,比例分别为 41. 0%、54. 8%和 1. 6%。分子生物学研究结果表明 , A lterna ria 大孢子种 彼此间及大孢子种与小孢子种之间可以根据 ITS和 gpd 序列差异明确区分 ;而供试的多数小孢子 种在 ITS和 gpd序列上差异很小 ,无法区分 。 关键词 : 链格孢 ; 形态学 ; 内部转录间隔区 ; 三磷酸甘油醛脱氢酶
分别挑取上述菌落的单个孢子 ,转入马铃薯胡 萝卜培养基 ( PCA ) 、1 /2 马铃薯胡萝卜培养基 ( 1 /2 PCA ) 、干草培养基 ( HAY)和 V8 培养基上培养 ,在 22 ℃下 ,两支 40W 灯管 (色温 4 200 K) 8 h照射和 16 h黑暗交替进行培养 ,灯管距离培养物约 40 cm ,培 养物面向上 ,于 1周后观察 。
链格孢的培养特性和鉴定在上述 4种培养基上 进行 。将上述培养物在实体解剖镜 50 ×下观察产 孢表型组 。根据 Simmons等 [ 4 ] 和 Roberts[ 2 ] 的分组 方法对分离到的 A lterna ria菌株进行分组 。分组后 , 取特征典型的菌株在显微镜下测量分生孢子大小 , 包括长 、宽 、喙长 、横纵 (斜 )隔膜数 ,孢子颜色 ,孢子 表面有无突起等 。每菌株测量 30个孢子 ,根据形态 将菌株鉴定到种 。 1. 3 分子生物学研究 1. 3. 1 菌体培养 :从每组产孢表型中分别选取 3 ～ 13个菌株 ,进行 5. 8S rDNA 及 ITS区序列分析和三 磷酸甘油醛脱氢酶 ( gpd )基因片段核苷酸序列测
sion No. AB015351 A lterna ria a lterna ta gene for AKT1, comp lete cds) ,合成了两条引物 AKT21和 AKT22,对 产孢表型属 A. ga isen组的 5个菌株 (表 2)进行 PCR 检 测 。引 物 序 列 AK1: 5′2AGCAGGAACAGCCG2 TATC23′, AK2: 5′2ACAGGGGCAACTTGAAAC23′。反 应条件 : 95 ℃ 5m in; 95 ℃ 15 s, 50 ℃ 45 s, 72 ℃ 45 s, 35个循环 ; 72 ℃延伸 5 m in。
基金项目 :国家质量监督检验检疫总局科研项目 ( 2003 IK068) 作者简介 :严进 ,男 , 1962年生 ,研究员 ,研究方向为检疫性真菌病害 , email: yanjin@ caiq. org. cn 3 通讯作者 (Author for correspondence) , email: shizongwei@ vip. sina. com , Tel: 010 - 82262289; 收稿日期 : 2008 - 08 - 06
Abstract: To identify the species of A lterna ria, the pathogen that causes black spot on Ya2pears during storage, the isolated A lterna ria from the sporulation pattern, conidia characters and molecular biology were exam ined. W ith morpho logical and molecular bio logical study on 188 isolated strains of A lterna ria, three species are identified, namely A lterna ria a lterna ta, A. tenu issim a, and A. infectoria, accounting for 41. 0% , 54. 8% , and 1. 6% of the total strains respectively. B ased on ITS and gpd data, it is evidently distinguished between the large2spored A lterna ria spp. and between the large2 and the sm all2spored A lter2 na ria spp. ; it is not distinguished among the sam all2spored A lterna ria spp. Key words: A lterna ria; morphology; ITS; gpd
孢 A. ya liinficiens R. G. Roberts[2 ]和 A. ven tricosa R. G. Roberts[ 3] 。其中 A. ga isen 既能侵染梨叶片也能 侵染梨果实 ,并产生寄主专化性毒素 ———AK毒素 ,是 真正的梨黑斑病病原 [1 ] ; A. a lterna ta 和 A. tenu issim a 为对基质广适性链格孢种 ,多生于植物的枯死部分或 衰弱组织上 [1 ] ; A. ya liinficiens和 A. ven tricosa 是美国 学者 R. G. Roberts分别于 2003年和 2007年从中国 出口的鸭梨果实上分离并命名的两个新种 [ 2 - 3 ] 。 近几年 ,对 A lterna ria 的鉴定 ,除采用传统的形 态学鉴定外 ,不少学者尝试用分子生物学的方法 ,如
定 。供试菌株在 PDA 平板上培养 3 ～5 天后 ,从菌 落边缘取菌丝块并进一步切成极细的小块 ,移到 50 mL马铃薯 - 葡萄糖培养液中 , 25 ±0. 5 ℃条件下摇 床 150 r/m in震荡培养 2天 ,经滤纸抽滤菌丝 ,无菌 水 冲洗 3次后 ,用灭菌吸水纸吸去多余的水份 ,置
- 20 ℃冰箱中保存备用 。另从 GenB ank上下载 22 个 A lterna ria 不同菌种的序列进行系统发育关系分 析 (表 1) 。 1. 3. 2 总 DNA提取 :总 DNA 提取采用 CTAB ( cetyl2 triethylammonium brom ide)法 [ 2 ] 。 1. 3. 3 PCR 扩增 : PCR 反应体系 : 10 ×PCR 缓冲液 5μL、2. 5 mmol/L dNTP 1μL、10 mmol/L 引物 1μL、 Taq酶 1 U、模板 DNA 0. 1 mg,加双蒸馏水至 50μL。 空白对照不加任何 DNA 模板 。选用王洪凯等 [ 5 ]报 道的一对引物 ITS1 和 ITS4 扩增核糖体基因 ITS12 5. 8S rDNA 2ITS2区 ,正向引物 ITS1序列为 5′2TCCG2 TAGGTGAACCTGCGG23′;反向引物 ITS4序列为 5′2 TCCTCCGCTTATTGATATGC23′。扩增程序 : 94 ℃变 性 5 m in; 94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 35个循环 ; 72 ℃延伸 7 m in。选用 B erbee等 [ 8 ]报道的一对引物 gpd1和 gpd2扩增 gpd 基因片段 ,正向引物 gpd1 序 列为 5′2CAACGGCTTGGGTCGCATTG23′; 反 向 引 物 gpd2 序 列 为 5′2GCCAAGCAGTTGGTTGTGC23′。扩 增程序 : 96 ℃变性 2 m in; 96 ℃ 1 m in, 48 ℃ 1 m in, 72 ℃ 1 m in, 30个循环 ; 72 ℃延伸 10 m in。 1. 3. 4 序列分析 : PCR产物由上海博亚生物技术有 限公司测序 。将测得的序列与 GenBank 下载的部 分链格孢菌的基因序列 (表 1)一起 ,用 C lustal X1. 8 软件进行比对 ,采用最大简约法 (M P)构建系统发 育树 。在最大简约树 (树集 )搜索中 ,采用启发式方 法搜索最佳系统树 ,所有特征被认为是等权和无序 的 ,同 时 , 在 分 析 前 排 除 非 简 约 信 息 位 点 。Boot2 strapp ing用于评价各节点的支持率 ,测试中重复 1 000次 。 1. 3. 5 寄主专化性毒素 (AK毒素 )基因检测 :根据 GenBank中发表的 AK毒素合成酶基因序列 (Acces2
38
植 物 保 护 学 报
36卷
王洪凯等 [ 5 ]用 5. 8S rDNA 及 ITS区序列分析了链格 孢的种级分类 ;孙霞等 [ 6 ]用 RAPD 方法分析了鸭梨 上的 A lterna ria各种间的亲缘关系 ;薛峰等 [ 7 ]对 U lo2 clad ium、S tem phy lium 和 A lterna ria 的典型菌种进行 了分子系统发育分析 ,构建了 ITS和 gpd 基因序列 分子系统发育树 。
Iden tif ica tion of A lterna ria isola tes from Ya 2pear fru its in Hebe i and Shandong prov inces
Yan J in1 Shi Zongwei13 Song Fu2 Huang W ensheng1 Chen Yan1 Zhao W ensheng2
作者于 2005年收集了河北和山东两省部分冷 库中储存的具 A lterna ria 侵染症状的鸭梨进行了病 原菌分离和鉴定 。
1 材料与方法
1. 1 病菌分离 从河北和山东两省部分果园的冷库中Βιβλιοθήκη Baidu集到表
面有黑斑症状的鸭梨 100余个 ,用 70%酒精擦洗病 健交界处及果柄表面 ,去除表皮 ,取果肉腐烂部分平 铺在带三层湿滤纸的培养皿内 ,并取果柄靠近基部 的一段纵向剖开 ,在滤纸上均匀摆好 。置于培养箱 中 ,光照和黑暗各 12 h交替 , 25 ℃下培养 3 ～5 天 。 将出现链格孢菌的培养皿置于实体显微镜 50 ×下 观察 ,用解剖针挑取具有典型产孢结构的单根孢子 链上的孢子转接于马铃薯 - 胡萝卜培养基 ( PCA ) (马铃薯 20 g、胡萝卜 20 g、琼脂 15 g、蒸馏水 1 000 mL )平板上 。将平板置于上述光照和温度条件下培 养 5～7天 。 1. 2 形态鉴定
第 36卷 第 1期 2009年 2 月
植 物 保 护 学 报
ACTA PHYTOPHYLAC ICA SIN ICA
Vol. 36 No. 1 Feb. 2009
河北和山东鸭梨果实上链格孢菌鉴定
严 进 1 施宗伟 13 宋 福 2 黄文胜 1 陈 岩 1 赵文胜 2
由链格孢 A lterna ria 引起的梨果实上的黑斑病 是重要的储藏期病害 ,在果实表面造成近圆形或不 规则黑褐色病斑 ,中间凹陷 ,潮湿时病斑表面生黑色 霉层 ,影响水果的质量和商品价值 。2004 年我国鸭 梨曾因黑斑病而被停止出口美国和加拿大 。
目前 ,世界上已报道的从梨果实上分离到的链 格孢共有 9个组 ,已命名的有 9 个种 [ 1 - 4 ] 。在中国 已报道的有 5 个种 ,分别是梨黑斑链格孢 A. ga isen K. Nagano、链格孢 A. a lterna ta ( Fr. ) Keissler、细极 链格孢 A. tenu issim a ( Fr. ) W iltshire、鸭梨侵染链格
(1. 中国检验检疫科学研究院 , 北京 100029; 2. 河北出入境检验检疫局 , 石家庄 050071)
摘要 : 为了查清造成鸭梨果实储藏期黑斑病的链格孢 A lterna ria 的种类 ,从其产孢表型 、分生孢子 特征和分子生物学等方面对分离的链格孢菌进行了研究 。经对分离到的 188支 A lterna ria菌株的 形态学鉴定 ,共确定了 3个种 ,即链格孢 A lterna ria a lterna ta、细极链格孢 A. tenu issim a和侵染链格孢 A. infectoria,比例分别为 41. 0%、54. 8%和 1. 6%。分子生物学研究结果表明 , A lterna ria 大孢子种 彼此间及大孢子种与小孢子种之间可以根据 ITS和 gpd 序列差异明确区分 ;而供试的多数小孢子 种在 ITS和 gpd序列上差异很小 ,无法区分 。 关键词 : 链格孢 ; 形态学 ; 内部转录间隔区 ; 三磷酸甘油醛脱氢酶
分别挑取上述菌落的单个孢子 ,转入马铃薯胡 萝卜培养基 ( PCA ) 、1 /2 马铃薯胡萝卜培养基 ( 1 /2 PCA ) 、干草培养基 ( HAY)和 V8 培养基上培养 ,在 22 ℃下 ,两支 40W 灯管 (色温 4 200 K) 8 h照射和 16 h黑暗交替进行培养 ,灯管距离培养物约 40 cm ,培 养物面向上 ,于 1周后观察 。
链格孢的培养特性和鉴定在上述 4种培养基上 进行 。将上述培养物在实体解剖镜 50 ×下观察产 孢表型组 。根据 Simmons等 [ 4 ] 和 Roberts[ 2 ] 的分组 方法对分离到的 A lterna ria菌株进行分组 。分组后 , 取特征典型的菌株在显微镜下测量分生孢子大小 , 包括长 、宽 、喙长 、横纵 (斜 )隔膜数 ,孢子颜色 ,孢子 表面有无突起等 。每菌株测量 30个孢子 ,根据形态 将菌株鉴定到种 。 1. 3 分子生物学研究 1. 3. 1 菌体培养 :从每组产孢表型中分别选取 3 ～ 13个菌株 ,进行 5. 8S rDNA 及 ITS区序列分析和三 磷酸甘油醛脱氢酶 ( gpd )基因片段核苷酸序列测
sion No. AB015351 A lterna ria a lterna ta gene for AKT1, comp lete cds) ,合成了两条引物 AKT21和 AKT22,对 产孢表型属 A. ga isen组的 5个菌株 (表 2)进行 PCR 检 测 。引 物 序 列 AK1: 5′2AGCAGGAACAGCCG2 TATC23′, AK2: 5′2ACAGGGGCAACTTGAAAC23′。反 应条件 : 95 ℃ 5m in; 95 ℃ 15 s, 50 ℃ 45 s, 72 ℃ 45 s, 35个循环 ; 72 ℃延伸 5 m in。
基金项目 :国家质量监督检验检疫总局科研项目 ( 2003 IK068) 作者简介 :严进 ,男 , 1962年生 ,研究员 ,研究方向为检疫性真菌病害 , email: yanjin@ caiq. org. cn 3 通讯作者 (Author for correspondence) , email: shizongwei@ vip. sina. com , Tel: 010 - 82262289; 收稿日期 : 2008 - 08 - 06
Abstract: To identify the species of A lterna ria, the pathogen that causes black spot on Ya2pears during storage, the isolated A lterna ria from the sporulation pattern, conidia characters and molecular biology were exam ined. W ith morpho logical and molecular bio logical study on 188 isolated strains of A lterna ria, three species are identified, namely A lterna ria a lterna ta, A. tenu issim a, and A. infectoria, accounting for 41. 0% , 54. 8% , and 1. 6% of the total strains respectively. B ased on ITS and gpd data, it is evidently distinguished between the large2spored A lterna ria spp. and between the large2 and the sm all2spored A lter2 na ria spp. ; it is not distinguished among the sam all2spored A lterna ria spp. Key words: A lterna ria; morphology; ITS; gpd