63抗体药表达系统(来源：药渡)

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61抗体药统计(来源：药渡)

Orthoclon eOKT3J&J Lilly 3Rituxan/M abThera CD20Rituximab 利妥昔单抗淋巴瘤Roche 19974Zenapax IL-2R Daclizumab 达利珠单抗肾移植排免Roche19975Simulect IL-2R Basilixima 巴利昔单抗肾移植排免Novarti1998AbbvieAZ J&JMSD8Herceptin HER-2Trastuzumab 曲妥珠单抗乳腺癌Roche 1998Amgen Pfizer Gemtuzumabozogamicin11Campath/a bCampath/Lemtrada CD52Alemtuzumab阿仑单抗白血病、MS Sanofi 200112Zevalin CD20Ibritumoma btiuxetan 替伊莫单抗非霍奇金淋巴瘤Spectrum200213Humira TNF-a Adalimumab 阿达木单抗RAAbbvie200214Amevive CD2Alefacept阿法赛特斑块型银屑病Astellas20032003200316Bexxar CD20Tosilumomah 托莫西单抗非霍奇金淋巴瘤GSK2003RocheMerck Lilly BMSMerck19Avastin VEGFKBcvacizumab贝伐珠单抗癌症Roche200420Tysabri a5Integrin Natalizumab 那他珠单抗MS、克罗恩病Biogen 200421Actemra/R o AclemraIL-6RTocilizumab 脱利珠单抗卡斯尔曼病、RARoche 2005115Xolair IgE Omalizumab 奥马珠单抗过敏性哮喘、荨麻疹吉妥单抗粒细胞白血病Pfizer2000上市时间RA19989EnbrelTNFa Etanercept依那西普RA19987RemicadeTNF-a Infliximab英夫利昔单抗2ReoPro 血小板糖蛋Ib/IIIaAbciximab阿昔单抗预防缺血性心肌病1993序号商品名靶点通用名中文通用名6Synagis 10Mylotarg CD33RSV F Palivizumab帕利珠单抗RSV感染1998CD3Muromomab 莫罗单抗移植急性排斥J&J 1992适应症企业斑块型银屑病200318Erbitux EGFR Cetuximab 西妥昔单抗结直肠癌、头颈瘤200417Raptiva CD11a Efalizumab 伊法珠单抗22Orencia CD 80/CD60Abatacept 阿西巴普RA BMS 200523泰欣生EGFR Nimotuzumab 尼妥珠单抗头颈癌百泰生物2005RocheNovartisAmgenTakeda26Soliris 补体C5Eculizumab 艾库组单抗PNH, aHUS Alexion200727Arcalyst IL-I Rilonacept 利洛纳赛CAPS R egeneron200828Cimzia TNF-aCertolizum ab Pegol赛妥珠单抗RA UCB 200829StelaraIL-12,IL-23Ustekinumab 优特克单抗RAJ&J200930Removab EpCAM/CD3/Fe receptorsCatumaxomab 卡妥索单抗恶性腹水Frencius2009J&J MSD 32Haris IL-l βCanakunumab 康纳单抗CAPS、SJLA Novartis2009慢淋GSK2009MS Novartis三期Prolia RANK Denosumab 狄诺塞麦骨质疏松Amgen Xgeva RANK Denosumab 狄诺塞麦癌症AmgenPralia RANK Denosumab 狄诺塞麦骨质疏松第一三共Ranmark RANK Denosumab 狄诺塞麦癌症第一三共35Yervoy CTLA-4Ipilimumab 伊匹单抗癌症BMS201136Benlysta BLyS Belimumab 贝利取单抗系统性红斑狼疮GSK201137Nulojix CD80、CD86Belatacept 贝拉西普肾移植排免BMS2011Seattle Takeda RegeneronBayer 40Potcligco CCR4Mogamulizumab淋巴瘤Kyowa Kirin201241Perjeta HER2Pertuzumab 帕妥珠单抗乳腺癌Roche201242Abthrax PA Raxibacumab 炭疽热GSK201243ZaltrapVEGF、PIGF Ziv-Aflibercep t 阿柏西普转移性结肠癌Sanofi 201244KadcylaHER2Ado-trastuzumabemtansine珠单抗-美登素乳腺癌Roche 2013AMD、DME200625Vectibix EGFR Panitumumab 帕尼单抗结直肠癌200624Lucentis VEGKRRanibizumab 雷珠单抗RA200933Arzerra CD20Ofatumuniab 奥法木单抗31Simponi/Si mponiTNF-a Golimumab 戈利木单抗34201038Adcetris CD30Brentuximabvedotin淋巴瘤2011VHGFA,IMGF Aflibercept Eylea 39阿柏西普AMD. DME201145Gazyva/CazyvavroCD20Obinutuzumab慢性淋巴痛Roche201346郎沐VEGF、PIGFConhercept康柏西普AMD、DMH成都康弘201347Cyramza VEGFR2Ramucirumab雷莫芦单抗NSCLC Lilly2014 48Sylvant IL-6R Siltuximab西妥昔单抗卡斯尔曼病J&J2014 49Entyvioα4β7Vedolizumab维多珠单抗肠癌、克罗恩病Takeda2014 50Opdivo PD-1Nivolumab纳武单抗癌症BMS201451Keytruda PD-1Pembrolizumab帕母单抗癌症MSD201452Blincyto CD3、CD19Blinatumomab白血病Amgen201453Cosentyx IL-I7Secukiinnnah苏金单抗RANovartis201554Unituxin GD2Dinutuximab神经母细胞瘤United Therapeti cs201555Darzalex CD38Daratumumab多发性骨髓瘤J&J2015 56Praluent PCSK9Alirocumab调血脂Sanofi2015 57Repatha PCSK9Evolocumab调血脂Amgen2015 58Portrazza EGFR Necitumumab NSCLX Lilly2015BMS2015Abbvic2015 60Nucala IL-5Mcpolizumah美泊利申抗GSK201561Praxbind DabigatranIdarucizumab达比加群酯抑制剂BI2015多发性骨髓瘤合汁59Empliciti SLAMF7Elotuzumab销售额／亿美元201420151.110.986970.458.357.49 6.62 68.6865.38 23.7217.94 62.7565.38 64.1766.8438.533.320.45 2.730.220.18 125.43140.12退市3.734.857.23 5.01 12.0110.10 64.1766.8419.618.86 12 2414 3216.5218.850.80O.8O 17.0115.2 24.4120.605.05 5.491.56 1.58 21.4625.900.140.14 10.5912.1720.7224.740.000.0011.8713.286.89 6.901.992.360.7210.3013.12 12.2114.050.560 930.840.98 13.0811.262.06 2.591.782.261.922.42 17.3626.76 10.0913.80.120.169.1814.45 0.920.87 5.367.690.490150.450.76 3.841.80 6.52 0.059.42 0.55 5.660.03上市 2.610.20O.110.030 837.239O5.95。

第六章抗体的表达

12
常用的原核表达载体分类及特征
转录载体：用以表达本身带有原核核糖体结合位点和AUG起始密码子的目的基因T-24（+）和pET-23（+）
体
翻译载体：包括来自T7噬菌体主要衣壳蛋白的高效
核糖体结合位点，用于表达一些不带有核糖体结合
位点的目的基因
pET载体系统为满足不同的需求，生产了带有His·Tag、 T7·Tag、S·Tag、GST·Tag、ompT、CBD S·Tag、 Thioredoxin、DsbA·Tag 、Trx·Tag等标签的融合蛋白，其中带有S·Tag、His·Tag、T7·Tag的蛋白易于通过蛋白质杂交检测。
11
一种表达体系的核心是表达载体及宿主菌，而表达方法的进步也主要体现在载体元件的优化和宿主菌基因型的改造上。理想的原核表达载体应具有以下特征：
（1）稳定的遗传复制和传代能力；
（2）具有显性的转化筛选标记；（3）启动子的转录是可调控的，抑制时本底转录水平较低；（4）启动子转录的mRNA能够在适当的位置终止，转录过程中不影响表达载体的复制；（5）具备适用于外源基因插入的酶切位点，以确保目的基因按一定方向与载体正确衔接表达产物的分离、纯化。
第六章抗体的表达
第一节概述
目前抗体的主要类型： 1、多克隆抗体：通过免疫手段制备。 2、单克隆抗体：通过杂交瘤技术制备。 3、基因工程抗体：包括嵌合抗体、改型抗体等，通过基因工程手段制备，涉及设计、构建与表达等。
2
3
要想获得全长的抗体分子，就必须选择恰当的抗体表达系统，而要使所表达的蛋白质结构不具有免疫原性或避免半衰期过短，就需要使用一个标准的抗体工程技术生产全人抗体。
大肠杆菌表达系统昆虫细胞表达系统哺乳动物表达系统酵母表达系统存在一些蛋白不能有效地折叠发酵周期较长容易污染需要考虑表达产物的卫生安全性筛选产物价格昂贵有时表达产物没有生物活性等问题都为临床生产和应用带来了不便也存在产物低表达或不表达的问题产物纯化问题依然存外源基因不能持久稳定地表达而且表达成本很高技术背景复杂存在不正确的糖基化修饰且表达量低原核表达系统具有吸引力的原因在于它的成本低生产率高和能够大规模快速的生产等优点第二节原核表达系统原核表达是指通过基因克隆技术将外源目的基因通过构建表达载体并导入表达菌株的方法使其在特定原核生物或细胞内表达

制备生物技术药物的几种表达系统

制备生物技术药物的几种表达系统(一)细菌：优点是基因了解清楚；本身价格便宜且易于培养；培养基便宜；表达水平高；生长快及易于鉴别。

缺点是不能分泌蛋白质；含有内毒素；无转译后修饰；可能有非正规的蛋白质交迭。

产品有利用大肠杆菌表达的胰岛素，重组人生长激素，白介素-2、干扰素、淋巴生长因子、白介素及细胞活素。

(二)酵母：优点是使用安全；使用的期限较长；基因了解清楚；无内毒素；高表达水平；分泌出蛋白质且易收获；生长快；培养基便宜；蛋白质一般正规交迭；转译后修饰。

缺点是产糖量过多因而损坏蛋白质的生物活性、安全性、活性及活力等；可能含有免疫物质或抗原。

产品有重组蛋白质、疫苗如乙肝疫苗、胰岛素、较大的重组蛋白如链激酶、人血清蛋白、组织坏死因子及干扰素。

(三)昆虫细胞：优点是具有转移后修饰；正规的交迭蛋白质；能分泌出产物；较好的表达率；棒状病毒对人无损害。

缺点是使用期限较短；生长慢；培养基昂贵；含有免疫宿主蛋白；有些非正规的糖化反应；哺乳类病毒可以感染此类细胞。

产品有疫苗、治疗药物、临床检验试剂以及做病毒治疗药物释放系统。

(四)哺乳动物细胞：优点是一般交迭蛋白质正规；正规的转移后修饰；能分泌蛋白质；良好的正规使用纪录；对大的、复杂的蛋白质的生产是唯一的选择。

缺点是培养基昂贵、生长缓慢；含有过敏物质；需要深入的鉴别；精制手续复杂；产品昂贵。

或品有组织血纤维溶酶原活化剂(TPA)，因子Ⅷ及单克隆抗体的生产。

(五)转基因动物：优点是可表达复杂、巨大的蛋白质；高表达水平；蛋白质交迭正规；后转移修饰正规；易于放大；费用低廉。

缺点是正规使用的经验很少；是否易于被病毒感染尚为未知数；表达水平不稳定；周转期限长；精制方法尚需研究；生产周期不能确定；有关农场的eGMP生长尚存在问题。

产品有利用羊及兔子生产α-1抗胰蛋白酶，胆盐刺激生产的脂肪酶，超氧化物岐化酶、胶原、因子Ⅷ及Ⅸ及一些小肽。

(六)转基因植物：优点是开发周期较动物短；种子易于保存；易于放大；表达量高；基因结构清楚；无植物病毒影响人类；生产费用低。

CHO细胞表达抗体

表达载体结构组成 ◆ 骨架序列 ◆ 选择性标志基因 ◆ 表达盒 ◆ 特殊的调控序列
7
选择标志基因
共扩增基因
（ DFHR和GS）
当环境中存在高浓度
（MTX 、MSX）时，标记
基因可自发在染色体上扩增拷贝数，连带其上下游的序列一起扩增，共扩增序列可达上千个bp ，拷贝数可增加几百到几千倍。
THE END
THANK YOU ！ 22
将右图质粒共转染CHO（DHFR- ）
◆ 宿主菌须在含有GHT（甘氨酸、次黄嘌呤、胸腺嘧啶）的培养基中生长
◆ 重组质粒Poptivec-target整合到宿主菌染色体组上后的阳性菌可在不含 GHT的培养基中生长。
◆ 进一步用G418和MTX筛选 , 在MTX浓度选择压力下 , dhfr基因与其共转染的目的基因一起扩增 , 提高目的蛋白表达。 11
3
CHOClassificat ion
补充: 1980年CHO-K1经化学突变得到CHO- DXB11 （一个等位基因缺失） 1983年的电离辐射经诱变株CHO-DG44 （两个等位基因缺失）由于CHO-DXB11 DHFR缺陷不彻底，很快被完全无DHFR活性的CHO-DG44取代注释: ATCC （American Type Culture Collection）美国菌种保藏中心 ECACC（European Collection of Authenticated Cell Cultures）欧洲细胞株/微生物保藏中心
4
DHFR缺陷型
宿主细胞
DG44 DUXB11
PcDNA3.3/Poptivec 载体系统 Life Technology公司
宿主细胞: DG44 质粒: 共转染PcDNA3.3（Neo抗性基因，￥2000）和Poptivec 筛选试剂: G418（遗传霉素）/MTX （氨甲喋呤）

抗体药物研究进展

抗体药物研究进展抗体药物，顾名思义，是指通过人体免疫系统产生的抗体分子为基础所研制的药物。

简单来说，抗体是一种能够识别与结合特定分子（抗原）的免疫蛋白质，因而称为免疫球蛋白（Ig），而抗体药物则是一种利用人体免疫系统自身能力来对抗多种疾病的新型药物。

近年来，随着生物技术的飞速发展，抗体药物也取得了长足进展，不仅取得了在包括癌症、自身免疫疾病、感染病等许多领域的重大临床突破，且已成为制药行业全球最快增长领域之一。

抗体药物的分类抗体药物可分为两大类：一类是由人免疫系统自然产生的抗体，如引入的针对抗原的抗体、单克隆抗体等；另一类是基于对人免疫系统反应进行精细设计的合成药物，如半重链抗体、载体融合蛋白、人源化抗体等。

抗体药物的优点相较于传统药物，抗体药物具有以下优势：1、高选择性：由于抗体可以特异性识别和结合特定分子，所以相较于传统药物会更具有选择性。

2、高亲和力：抗体与抗原结合产生复杂的分子互作用，使得抗体对于靶分子的亲和力比传统小分子药物更高，因而有效性更佳。

3、安全性高：抗体药物是由人体天然免疫系统产生和使用的蛋白质，且与人体的主要组织和器官具有较高的相似度，因此毒副作用少。

4、可调节性：抗体药物可以在分子结构上进行调节，改变抗体的组成部分和位置，从而获得更佳的性质和效果。

抗体药物在肿瘤治疗中的应用肿瘤是目前困扰全球人们健康的重大疾病之一。

抗体药物在肿瘤治疗中的应用占到了抗体药物总量的75%左右。

其中最主要的应用就是肿瘤靶向治疗，使得治疗中的有害结果得到明显的消减。

靶向抗体药物对于癌细胞的治疗作用是通过结合其表面抗原，识别破坏癌细胞。

在癌症治疗中，经常使用的靶向抗体药物有美罗华（Herceptin）、基因吉莲（Erbitux）、帕博西刚（Avastin）等。

这些靶向抗体药物大多数适用于局部或晚期癌症的治疗。

与化疗相比较，抗体药物治疗更为精确，而且它能够带来更好的生存质量。

抗体药物也可用于抑制与肿瘤有关联的细胞增殖因子，在治疗中的效果显著。

ADC药物发展史看核心四要素的变迁

ADC药物发展史看核心四要素的变迁肿瘤药物的开发可追溯至二十世纪中期，人们发现氮芥通过靶向快速分裂的癌细胞来破坏个体的骨髓和淋巴组织。

这类药物包括叶酸和嘌呤类似物（甲氨蝶呤和6-巯基嘌呤），微管聚合抑制剂/促进剂（长春花生物碱和紫杉烷类）和DNA破坏剂（蒽环类和氮芥类）[2]。

由于早期的肿瘤治疗药物不仅靶向癌细胞而且对体内所有的分裂细胞都具有杀伤作用，导致患者发生严重的副作用，这大大限制了给药剂量，药物的治疗指数（最大耐受剂量/最小有效剂量）很低，疗窗口狭窄。

ADC药物可能实现选择性地将有毒化合物递送至特异性的癌细胞。

2.1 第一代ADC药物在第一代ADC药物中，丝裂霉素C，伊达比星，蒽环类，N-乙酰马法兰，阿霉素，长春花生物碱和甲氨蝶呤等抗肿瘤药物主要通过不可裂解的连接物（酰胺或琥珀酰亚胺）与鼠单抗偶联。

2000年美国FDA批准首款抗体偶联药物Gemtuzumab Ozogamicin（商品名Mylotarg，惠氏，辉瑞子公司），靶点为CD33，Gemtuzumab Ozogamicin由三部分构成：1）重组人源化IgG4 kappa型单抗Gemtuzumab；2）具有细胞毒性的N-乙酰基γ卡奇霉素；3）由4-(4-acetylphenoxy)-butanoic acid (AcBut) 和3-methyl-3-mercaptobutane hydrazide(dimethylhydrazide) 组成的酸裂解型双功能Linker分子。

Linker分子将卡奇霉素共价连接到单抗，药物抗体比率ADR平均为2~3。

该药物被靶细胞内吞后，通过水解linker释放卡奇霉素，诱导双链DNA断裂，致使细胞周期停滞并凋亡。

该药用于治疗CD33阳性的急性骨髓性白血病。

图4 Gemtuzumab Ozogamicin结构式，来源：药渡数据库随后发现，与其它抗癌药物比较Gemtuzumab Ozogamicin没有显著的临床优势，而且具有严重的肝毒性。

4.抗体制药

围从150,000到950,000道尔顿。分五类：
• IgG在血清中含量最高，达75~80%,是抗感染
的主要抗体;
• IgM是五类免疫球蛋白中分子量最大的，为
五聚体,是对一个抗原作出反应时产生的
第一个抗体；
• IgA在黏膜表面、乳腺、泪腺形成，主要参
与局部的免疫反应;
免疫球蛋白
• IgD在血清中含量很低;
2、杂瘤细胞的选择性培养
常用的选择培养基为HAT培养基。次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A能阻断DNA合成)、
胸腺嘧啶(T)。脾细胞具有次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶
(HGPRT),因此脾-瘤融合的杂交瘤细胞可利用 HGPRT酶,用次黄嘌呤(H)和胸腺嘧啶(T)合成 DNA,使杂交瘤细胞得以生长。
抗体药物市场销售额
160 140 120 100
80 60 40 20
0
年份 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2011
全球有超过200家上市或未上市公司正在研发
用于临床诊断和治疗的单克隆抗体
正在进行临床试验的抗体公司（38家）：
Abgenix Alexion Pharm Altarex Applied Molecular Evolution BASF Biogen BioTransplant CAT(Cambridge Ab Tech) Celltech Centeon Centocor (Johnson & Johnson)
纯化单克隆抗体流程(大鼠)
三.单克隆抗体药物的现状
250多种抗体类药物在临床试验中
－1/3已进入三期临床－1/4已通过临床III期试验
美国市场上有13种治疗用的抗体药物抗体药物的销售额

生物技术制药复习题

生物技术制药复习题第一章绪论第一节生物技术的发展史1、生物技术：以生命科学为基础，利用生物体的特性和功能，设计构建具有与其性状的新物种或新品系，并与工程结合，利用这样的新物种进行加工生产，为社会提供商品服务的一个综合性技术体系。

它的范畴：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、生化工程。

基因工程是生物技术的核心。

P12、蛋白质工程----第二代基因工程；海洋生物技术-----第三代生物技术P13、生物技术发展史：传统、近代（抗生素、发酵罐）、现代（DNA重组）P31974年，Boyer和Cohen建立了DNA重组技术1975年，Koher 和Milstein 建立了单克隆抗体技术1982年，第一个基因工程药物重组人胰岛素被批准上市1989年，我国第一个基因工程药物干扰素批准上市2003年，中国的重组腺病毒-p53注射液成为石阶上第一个正式批准的基因治疗药物。

第二节生物技术药物1、生物技术制药：生物技术制药：采用现代生物技术人为地创造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医药品。

P42、生物技术药物：采用DNA重组技术活其他生物技术研制的蛋白质或核酸类药物。

它与天然生化药物、微生物药物、海洋药物和生物制品共同归为生物药物。

3、现代生物药物分为4类：重组DNA技术制造的基因重组多肽、蛋白质类治疗剂；基因药物；天然药物；合成与部分合成药物。

4、生物药物按用途分为：治疗药物；预防药物；诊断药物。

5、生物技术药物的特征：（1）分子结构复杂；（2）具有种属特异性；（3）治疗针对性强、疗效高；（4）稳定性差（5）基因稳定性；（6）免疫原性；（7）体内半衰期短；（8）受体效应；（9）多效性和网络性效应；（10）检验的特殊性。

第三节生物技术制药1、生物技术制药的特征：高技术、高投入、长周期、高风险、高收益。

P52、生物技术在制药中的应用有哪些？P7（1）基因工程制药：① 开发基因工程药物，如干扰素（IFN）、红细胞生成素（EPO）等②基因工程疫苗，如乙肝基因工程疫苗③基因工程抗体，它可以作为导向药物的载体④基因诊断与基因治疗⑤应用基因工程技术建立新药的筛选模型⑥应用极影工程激活素改良菌种，产生新的微生物药物⑦改进药物生产工艺⑧利用转基因动、植物生产蛋白质类药物。

重组抗体的表达

● 2、基因结构优化：基因序列中可能会存在一些不利于转录和翻译的元件，如隐蔽剪接位点、TATA 框、基因内部终止信号、阴性 CpG 岛、发夹结构、poly A 早期信号、潜在的 Chi 序列和核糖体结合位点等。使用生物信息学技术对抗体基因序列中负作用元件进行更换或剔除，并提高GC含量，从而增加
3 总结
重组抗体的高效表达
2.1 表达宿主的选择 2.2 表达载体的结构排列 2.3 高效表达载体的构建 2.4 抗体基因序列的优化 2.5 信号肽的选择 2.6 抗体表达系统及其筛选的策略 2.7 细胞培养工艺优化
谢谢大家
RNA 聚合酶识别、结合和开始转录的DNA 序列。与转录调节因子协同促进转录。
hCMV、 CHEF-1a、 hEF-1a 、UBC
增强启动子的活性和功能，能够使基因转录频率明显增加的DNA Human CMV
序列。
Immediate early enhancer
能阻止临近调控元件对其所界定的基因启动子起增强和抑制作用。
信号肽将加速此过程的完成，从而提高抗体的表达水平。
● 信号肽选择策略：①与表达蛋白质同源的分泌信号肽;
②与宿主表达细胞同源的分泌信号肽; ③机体内表达的分泌蛋白的分泌信号肽； ④替换高效表达蛋白质的信号肽序列作为重组抗体的信号肽； ⑤对原有抗体信号肽序列进行一级结构改造; ⑥替换某些病毒的蛋白质信号肽序列。
重组抗体的表达
1 抗体发展历程 2 重组抗体的高效表达
2.1 表达宿主的选择 2.2 表达载体的结构排列 2.3 高效表达载体的构建 2.4 抗体基因序列的优化 2.5 信号肽的选择 2.6 抗体表达系统及其筛选的策略 2.7 细胞培养工艺优化
1 抗体发展历程
重组抗体：又叫基因工程抗体, 是利用DNA和蛋白质工程技术, 在基因水平上对免疫球蛋白分子进行适当加

抗体药物

抗原（ antigen ） —— 是任何可诱发免疫反应的物质。 ※与抗体结合的部位为抗原决定簇或表位。 ※根据抗原性质分类： ①完全抗原：具备免疫原性和反应原性两种能力； ② 半抗原：只具有反应原性而没有免疫原性的物质。
抗原-抗体反应 ※是抗体的 V区互补决定区形成的三维构象与抗原高级结构表面的决定簇之间的反应，为非共价键结合，包括静电引力、氢键、范德华力、疏水作用力等； ※包括抗原抗体特异性结合和非特异性促凝聚两个阶段； ※反应特点：特异性（主要特征）、比例性、可逆性。
“Y”字形对称结构，经二硫键共价结合
特异性结合相关抗原
选择性杀伤肿瘤靶细胞
抗体药物特异性
临床使用疗效确切
动物体内靶向性分布
特定肿瘤疗效更佳
抗体药物多样性的主要表现：
抗体药物的重要特点之一是可以定向制造（ tailored
making），可以根据需要，制备具有不同治疗作用的抗体
药物。 ※针对特定的靶分子定向制备抗体药物； ※根据需要选择抗体药物的“效应分子”。
2
1)特异性识别HER2调控的细胞表面蛋白，抑制其介导信号转导，而治疗肿瘤； 2)HER-2过表达的乳腺癌化疗联用显著提高完全缓解率。
3
1)与带CD52的靶细胞结合，通过宿主效应的CDC、ADCC 和细胞凋亡等机制导致细胞死亡； 2)作用机制独特，对源于B和T细胞的各种恶性肿瘤具有很好的治疗作用。
基因
※通过基因工程技术的改造，可以降低甚至消除人体对抗体的排斥反应； ※基因工程抗体的分子量较小，可以部分降低抗体的鼠源性，更有利于穿透血管壁，进入病灶的核心部件； ※根据治疗的需要，制备新型抗体； ※可以采用原核细胞、真核细胞和植物等多种表达方式，大量表达抗体分子，大大降低生产成本。

meds标准

meds标准
"Meds" 是一个缩写，通常用于指代药物（Medications）的标准。

在医疗领域，存在一些用于标准化药物信息和管理的标准和分类系统，可以帮助医生、药师和其他医疗专业人员更好地理解和交流有关药物的信息。

以下是一些常见的药物标准和分类系统：
1. ATC（Anatomical Therapeutic Chemical Classification System）：这是一个国际通用的药物分类系统，按照药物的解剖、治疗和化学属性将药物划分为不同的组别和子组别。

2. RxNorm：这是一个用于标准化药物名称和标识符的系统，用于统一不同医疗信息系统中对药物的命名和表示。

3. NDC（National Drug Code）：这是由美国食品药品监督管理局（FDA）分配的药物识别码，用于唯一标识和追踪药物。

4. SNOMED CT（Systematized Nomenclature of Medicine - Clinical Terms）：这是一个医学临床术语系统，其中包括了广泛的医学概念和术语，包括药物方面的信息。

5. LOINC（Logical Observation Identifiers Names and Codes）：这是一个用于标识和交换医学检验和观察结果的系统，其中包括药物相关的观测项目。

这些标准和分类系统旨在提供统一的药物信息和命名规范，以促进医疗领域的协作、数据交换和研究。

具体在使用药物信息方面，可以根据具体的需求和应用场景选择合适的药物标准进行使用。

欧盟新版《药物警戒实践指南》(GVP)：第二单元- 药物警戒系统主文件(第2版)

2017年3月28日EMA /药物警戒管理规范指南（GVP）模块II - 药物警戒系统主文件（Rev 2）* 注：修订2包含以下内容：- 删除II.A中的文字指过渡期，因为这不再适用;- 在II.B中澄清PSMF的内容应反映欧盟授权的药品安全信息的全球可用性，提供全球，地区和地方级应用的药物警戒系统信息;- 删除II.A中的文字不适用，并重新安排第II.B.2.1，II.B.2.2，II.B.2.3节的内容。

和II.C.1.1。

要强调申请人药物警戒系统在初始上市许可申请时提交摘要的要求，要求通过第57条数据库（PSMF位置）初次电子提交QPPV /联系方式和PSMF位置信息注册），并只更新第57条数据库，而不需要提交I AIN类型变体（QPPV和PSMF位置信息维护）;- 在II.B.4.7中作出澄清。

列入尚未就特定审计或PSMF所要求的说明中的发现商定的纠正性和预防性行动计划，以解决公众询问;- 另外在II.B.4.8。

对产品清单中关于药品销售状况的信息的法律参考。

查看网站的联系方式欧洲药品管理局www.ema.europa.eu 药品代理商www.hma.eu欧洲药品管理局是欧盟的一个机构©欧洲药品管理局和药品代理处负责人，2017。

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该模块的修订不需要征询公众的意见，因为它只涉及更新和澄清而不涉及内容。

目录II.A。

介绍 (4)II B. 结构和流程 (4)II.B.1。

目标 (4)II.B.2。

注册和维护 (5)II.B.2.1。

申请人的药物警戒系统概述 (5)II.B.2.2。

位置，注册和维护 (6)II.B.2.3。

药物警戒系统主文件的职责转移 (7)II.B.3。

药物警戒系统的代表 (7)II.B.4。

包含在药物警戒系统主文件中的信息 (8)II.B.4.1。

PSMF关于负责药物警戒的合格人员（QPPV）部分 (9)II.B.4.2。

PSMF关于上市授权持有者组织结构的部分 (9)II.B.4.3。

利用Ｎ糖苷酶Ｆ对单克隆抗体Ｎ糖酶解条件的优化

生物技术进展２０２１年㊀第１１卷㊀第２期㊀２１４~２２２ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ㊀ＩＳＳＮ２０９５￣２３４１研究论文Ａｒｔｉｃｌｅｓ㊀收稿日期:２０２１￣０１￣１４ꎻ接受日期:２０２１￣０１￣２７㊀基金项目:上海市浦东新区科技发展基金(ＰＫＸ２０１９￣Ｓ０９)ꎮ㊀联系方式:张博慧Ｅ￣ｍａｉｌ:ｙａｏｙａｏｚｈｄ＠１６３.ｃｏｍꎻ∗通信作者许俊彦Ｅ￣ｍａｉｌ:ｊｕｎｙａｎ.ｘｕ＠ｄｒａｇｏｎｂｏａｔｂｉｏ.ｃｏｍ利用Ｎ糖苷酶Ｆ对单克隆抗体Ｎ糖酶解条件的优化张博慧ꎬ㊀贾戴辉ꎬ㊀程倩ꎬ㊀许俊彦∗ꎬ㊀邵喆ꎬ㊀黄应峰宝船生物医药科技(上海)有限公司药物分析部门ꎬ上海２０１２０３摘㊀要:为了优化利用Ｎ糖苷酶Ｆ(ＰＮＧａｓｅＦ)酶解单克隆抗体中Ｎ糖的方法ꎬ应用本公司生产的单抗对ＰＮＧａｓｅＦ酶的酶解条件进行优化ꎬ包括缓冲液ｐＨ㊁酶种类㊁仪器㊁酶解程度㊁变性缓冲液及酶加入量等ꎬ总结酶解条件对Ｎ糖谱结果的影响ꎮ结果显示ꎬ置换缓冲液至１ˑＰＢＳ中可以避免某些单抗在低ｐＨ酶解时Ｇ０Ｆ转化为Ｇ０Ｆ￣ＧＮ并可改善峰型ꎻ快速ＰＮＧａｓｅＦ和加入变性缓冲液能有效提高酶解效率ꎻＵＰＬＣ和１.７μｍ粒径色谱柱能提高分离度ꎻ不完全酶解影响Ｎ糖含量结果ꎮ研究结果表明ꎬ采用优化的酶解条件可快速㊁有效的酶解单抗上的Ｎ糖ꎬ使Ｎ糖谱结果准确可靠ꎬ为细胞株筛选和单抗药物质量控制提供有效手段ꎮ关键词:单克隆抗体ꎻＮ糖ꎻＰＮＧａｓｅＦ酶ＤＯＩ:１０.１９５８６/ｊ.２０９５￣２３４１.２０２１.０００５中图分类号:Ｑ８１９ꎬＲ９７㊀㊀㊀文献标识码:ＡＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆＨｙｄｒｏｌｙｓｉｓＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆＮ￣ｇｌｙｃａｎｆｒｏｍＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓｂｙＰＮＧａｓｅＦ㊀ＺＨＡＮＧＢｏｈｕｉꎬＪＩＡＤａｉｈｕｉꎬＣＨＥＮＧＱｉａｎꎬＸＵＪｕｎｙａｎ∗ꎬＳＨＡＯＺｈｅꎬＨＵＡＮＧＹｉｎｇｆｅｎｇＤｒｕｇＡｎａｌｙｓｉｓＤｅｐａｒｔｍｅｎｔꎬＤｒａｇｏｎｂｏａｔＢｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏ.ꎬＬｔｄꎬＳｈａｎｇｈａｉ２０１２０３ꎬＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔ:ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｄｅｖｅｌｏｐａｎｄｏｐｔｉｍｉｚｅａｍｅｔｈｏｄｏｆｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇＮ￣ｇｌｙｃａｎｆｒｏｍｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｂｙｕｓｉｎｇＰＮＧａｓｅＦꎬａｓｅｒｉｅｓｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓꎬｉｎｃｌｕｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒｐＨꎬｅｎｚｙｍｅｔｙｐｅꎬｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓꎬｄｅｇｒｅｅｏｆｅｎｚｙｍａｔｉｃｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓꎬｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｂｕｆｆｅｒｓｏｌｕｔｉｏｎａｎｄｅｎｚｙｍｅｄｏｓａｇｅｗｅｒｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｂｙｕｓｉｎｇｓｅｖｅｒａｌｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ.Ｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔꎬｂｕｆｆｅｒｅｘｃｈａｎｇｉｎｇｉｎｔｏ１ˑＰＢＳｃｏｕｌｄａｖｏｉｄｔｈｅｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｏｆｓｏｍｅｍＡｂｓｆｒｏｍＧ０ＦｔｏＧ０Ｆ￣ＧＮａｔｌｏｗｐＨａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｐｅａｋｓｈａｐｅ.ＲａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦａｎｄｄｅｎａｔｕｒｅｂｕｆｆｅｒｃｏｕｌｄｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｅｎｚｙｍａｔｉｃｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ.ＣｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆＵＰＬＣａｎｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｃｏｌｕｍｎｗｉｔｈ１.７μｍｐａｒｔｉｃｌｅｓｉｚｅｃｏｕｌｄｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ.ＩｎｃｏｍｐｌｅｔｅｅｎｚｙｍａｔｉｃｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｃｏｕｌｄａｆｆｅｃｔｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＮ￣ｇｌｙｃａｎｃｏｎｔｅｎｔ.ＲｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆＰＮＧａｓｅＦｃａｎｑｕｉｃｋｌｙａｎｄｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｈｙｄｒｏｌｙｚｅｔｈｅＮ￣ｇｌｙｃａｎｆｒｏｍｔｈｅｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙꎬｗｈｉｃｈｃａｎｐｒｏｖｉｄｅａｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇＮ￣ｇｌｙｃａｎｃｏｎｔｅｎｔｉｎｃｅｌｌｌｉｎｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇａｎｄｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｄｒｕｇｓ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙꎻＮ￣ｇｌｙｃａｎꎻｐｅｐｔｉｄｅＮｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅＦ(ＰＮＧａｓｅＦ)㊀㊀Ｎ糖基化修饰是单克隆抗体药物普遍存在的翻译后修饰现象ꎮ目前研究表明ꎬ糖基化修饰与单克隆抗体药物的功能㊁药物代谢㊁免疫原性等关系密切[１￣３]ꎬ如核心岩藻糖缺失能显著增强ＡＤＣＣ效应[４]ꎬ半乳糖能够增强ＣＤＣ活性[５]ꎻ末端Ｎ￣乙酰葡萄糖影响抗体药物半衰期[６￣７]ꎻ唾液酸化糖型具有抗炎症功能[８]ꎻα(１￣３)半乳糖和ＮＧＮＡ型唾液酸易引起免疫原性[９]等ꎮＮ糖对抗体结构也具有重要作用ꎬ能稳定ＣＨ２结构域ꎬ去糖抗体稳定性会变差ꎬ更易发生去折叠和聚集[１０]ꎮＮ糖类型和含量受细胞株㊁培养条件㊁纯化和储存[１１￣１３]等过程的影响ꎬ因此在单抗药物细胞筛选㊁工艺优化㊁纯化㊁产品放行和稳定性考察中控制和监测Ｎ糖含量ꎬ保证单抗药物安全性㊁有效性等尤为重要ꎮ目前检测Ｎ糖的方法主要有亲水色谱－荧光法[１４]㊁ＣＥ￣ＬＩＦ法[１５￣１６]和质谱法[１７￣１８]. All Rights Reserved.等ꎮ其中亲水色谱－荧光法是目前应用最为广泛的方法ꎬ该方法通常需要用糖苷酶水解糖蛋白上的Ｎ糖链ꎬ再用标记试剂进行衍生化ꎬ采用亲水色谱柱分离ꎬ荧光检测器检测ꎮ由于ＰＮＧａｓｅＦ几乎能水解所有哺乳动物细胞产生的Ｎ糖ꎬ因此得到广泛应用[１９]ꎮ传统的Ｎ糖谱检测方法一般耗时较长ꎬ目前快速Ｎ糖样品制备的试剂盒已经商品化ꎬ大幅提高了Ｎ糖的检测效率ꎬ但是通常价格昂贵ꎮ而应用快速ＰＮＧａｓｅＦ酶与传统制备过程相组合成为提高检测效率和降低检测成本的一种选择ꎮ本研究基于亲水色谱－荧光法ꎬ针对ＰＮＧａｓｅＦ水解条件进行了优化ꎬ发现和解决了酶解过程中易对结果产生影响的一些因素ꎬ建立了高效准确的Ｎ糖检测方法ꎬ以期为Ｎ糖的检测研究提供参考ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀实验材料１.１.１㊀供试品㊀本研究所用ｍＡｂ１㊁ｍＡｂ２和ｍＡｂ２￣Ｆ均为宝船生物医药科技(上海)有限公司生产的ＩｇＧ１型单克隆抗体ꎮ１.１.２㊀试剂和耗材㊀Ｎ糖苷酶Ｆ(ＰＮＧａｓｅＦ)㊁快速ＰＮＧａｓｅＦ酶(ｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ)及变性缓冲液(５ˑ)均购自ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ公司ꎻ无水乙醇㊁甲酸铵㊁乙酸㊁二甲基亚砜(ＤＭＳＯ)㊁２￣氨基苯甲酰胺(２￣ＡＢ)㊁氰基硼氢化钠㊁β￣巯基乙醇等均购自Ｓｉｇｍａ公司ꎻ甲酸和乙腈购自Ｆｉｓｈｅｒ公司ꎻＰＢＳＢｕｆｆｅｒ(１ˑ)购自上海生工ꎻ１０ｋＤ超滤离心管购自Ｍｅｒｃｋ公司ꎻ１００ｍｍｏｌＬ－１Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌ(含１％ＳＤＳꎬｐＨ９.０)溶液和非涂层－熔融石英毛细管购自Ｂｅｃｋｍａｎ公司ꎻ纯化柱(ＧｌｙｃｏＣｌｅａｎＴＭＳＣａｒｔｒｉｄｇｅｓ)购自Ｐｒｏｚｙｍｅ公司ꎻ色谱柱ＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣＧｌｙｃａｎＢＥＨＡｍｉｄｅＣｏｌｕｍｎ(１.７μｍꎬ２.１ｍｍˑ１５０ｍｍ)购自Ｗａｔｅｒｓ公司ꎻ色谱柱ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏＧｌｙｃａｎＭａｐｐｉｎｇＣｏｌｕｍｎ(２.７μｍꎬ４.６ｍｍˑ１５０ｍｍ)购自Ａｇｉｌｅｎｔ公司ꎮ１.１.３㊀主要仪器设备㊀高效液相系统(ＨＰＬＣꎬ１２６０)购自Ａｇｉｌｅｎｔ公司ꎻ超高效液相系统(ＵＰＬＣꎬＨ￣ＣｌａｓｓＰｌｕｓ)购自美国Ｗａｔｅｒｓ公司ꎻ液质联用系统(ＬＣ￣ＭＳꎬＱＥｘａｃｔｉｖｅ)和数据处理软件(ＢｉｏｐｈａｒｍａＦｉｎｄｅｒ)均购自美国Ｔｈｅｒｍｏ公司ꎻ毛细管电泳仪(ＣＥꎬＰＡ８００Ｐｌｕｓ)购自Ｂｅｃｋｍａｎ公司ꎻ真空离心浓缩干燥仪(ＲＶＣ２￣２５)购自德国Ｃｈｒｉｓｔ公司ꎮ１.２㊀实验方法１.２.１㊀蛋白沉淀和Ｎ糖衍生化㊀向酶解后的样品中加入３倍体积的冰乙醇ꎬ－１５~－２５ħ放置约１ｈꎬ高速离心１０ｍｉｎꎬ取上清干燥ꎮ加入１０μＬ２￣ＡＢ衍生化试剂ꎬ６５ħ避光孵育３ｈꎮ用纯化柱纯化后干燥ꎬ５０％乙腈复溶ꎬ准备上机分析ꎮ１.２.２㊀ＨＰＬＣ色谱条件㊀仪器采用高效液相系统(Ａｇｉｌｅｎｔꎬ１２６０)ꎻ色谱柱采用ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏＧｌｙｃａｎＭａｐｐｉｎｇＣｏｌｕｍｎꎻ流动相Ａ为１００ｍｍｏｌＬ－１甲酸铵(ｐＨ４.５)ꎬ流动相Ｂ为１００％乙腈ꎻ进样量２μＬꎻ流速０.５ｍＬｍｉｎ－１ꎻ荧光检测器激发波长２６０ｎｍꎬ发射波长４３０ｎｍꎻ色谱柱温度５５ħꎻ梯度洗脱ꎮ１.２.３㊀ＵＰＬＣ色谱条件㊀仪器采用超高效液相系统(ＷａｔｅｒｓꎬＨ￣ｃｌａｓｓｐｌｕｓ)ꎬ色谱柱采用ＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣＧｌｙｃａｎＢＥＨＡｍｉｄｅＣｏｌｕｍｎꎮ流动相Ａ为１００ｍｍｏｌＬ－１甲酸铵(ｐＨ４.５)ꎬ流动相Ｂ为１００％乙腈ꎬ进样量２μＬꎬ流速０.５ｍＬｍｉｎ－１ꎬ荧光检测器激发波长３３０ｎｍꎬ发射波长４２０ｎｍꎬ色谱柱温度６０ħꎬ梯度洗脱ꎮ１.２.４㊀质谱参数㊀应用液质联用系统(ＬＣ￣ＭＳꎬＱＥｘａｃｔｉｖｅ)的ＨＥＳＩ正离子模式(ＨＥＳＩ＋)ꎬ离子源的温度和电压分别为３２０ħ和３.８ｋＶꎬ离子传输管温度为２００ħꎬ其他仪器参数设置均经过优化以获得最佳信号响应ꎻ母离子扫描范围７００~３０００ｍｚ－１ꎬ分离度１５０００ꎬ分析时长６０ｍｉｎꎻ数据处理软件采用ＢｉｏｐｈａｒｍａＦｉｎｄｅｒꎮ１.２.５㊀还原毛细管凝胶电泳(ＲＣＥ￣ＳＤＳ)㊀将蛋白沉淀用１００ｍｍｏｌＬ－１Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌ(含１％ＳＤＳꎬｐＨ９.０)溶液复溶ꎬ加入β￣巯基乙醇还原ꎮ仪器采用毛细管电泳仪(ＢｅｃｋｍａｎꎬＰＡ８００ｐｌｕｓ)ꎬ毛细管采用非涂层－熔融石英毛细管ꎬＰＤＡ检测器ꎬ波长２２０ｎｍꎬ电动进样(－５ｋＶ)２０ｓꎬ电压分离(－１５ｋＶ)４０ｍｉｎꎮ２㊀结果与分析２.１㊀缓冲液ｐＨ对结果的影响分别将ｍＡｂ１和ｍＡｂ２样品调ｐＨ至４㊁５㊁６和７ꎬ取２００μｇ进行ＰＮＧａｓｅＦ酶解２４ｈꎬ检测Ｎ糖含量ꎮ实验结果如表１和图１所示ꎬｍＡｂ２在不５１２张博慧ꎬ等:利用Ｎ糖苷酶Ｆ对单克隆抗体Ｎ糖酶解条件的优化. All Rights Reserved.同ｐＨ缓冲液酶解的Ｎ糖含量高度一致ꎬ说明ｐＨ对该样品Ｎ糖水解无影响ꎻ而ｍＡｂ１中Ｎ糖含量随ｐＨ的变化出现明显差异ꎬ其中缓冲液ｐＨ为４时ꎬ峰２(ｐ２)含量出现大幅度升高ꎬ相应的峰３(ｐ３)含量明显下降ꎬｐＨ６和７条件下Ｎ糖含量基本一致ꎮ表１㊀ｍＡｂ１和ｍＡｂ２在不同ｐＨ缓冲液中酶解的Ｎ糖含量Ｔａｂｌｅ１㊀Ｎ￣ｇｌｙｃａｎｃｏｎｔｅｎｔｏｆｍＡｂ１ａｎｄｍＡｂ２ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐＨｂｕｆｆｅｒ样品名称ｐＨＮ糖含量/％ｐ１ｐ２ｐ３ｐ４ｐ５ｐ６ｐ７ｍＡｂ１４２.０２３.４５７.６６.２３.４１.６０.４５３.７４.２７６.６５.１４.２２.２０.４６３.９１.３７９.８４.８４.３２.２０.４７３.９１.０８０.２４.７４.４２.３０.４ｍＡｂ２４/７.４４６.０５.３２４.１８.２４.８５/７.６４５.８５.４２３.９８.２４.８６/７.６４５.７５.４２４.０８.２４.９７/７.４４５.７５.４２４.０８.２４.９图１㊀ｍＡｂ１和ｍＡｂ２在不同ｐＨ缓冲液中酶解的Ｎ糖色谱图Ｆｉｇ.１㊀Ｎ￣ｇｌｙｃａｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆｍＡｂ１ａｎｄｍＡｂ２ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐＨｂｕｆｆｅｒ６１２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.㊀㊀将ｍＡｂ１不同ｐＨ酶解后的蛋白进行还原ＣＥ￣ＳＤＳ检测ꎬ结果(图２)显示含Ｎ糖重链(ＨＣ)基本已被酶解成非糖基化重链(ＮＧＨＣ)ꎬ说明不同ｐＨ缓冲液下ＰＮＧａｓｅＦ酶解Ｎ糖２４ｈ后均酶解完全ꎬＮ糖含量的变化并非不完全酶解造成ꎮ利用液质联用鉴定各Ｎ糖的种类ꎬｐ２和ｐ３分别为Ｇ０Ｆ￣ＧＮ(Ａ１Ｆ)和Ｇ０Ｆ(Ａ２Ｆ)ꎮ通过比较不同时间(１㊁８和２４ｈ)酶解结果(表２)ꎬ发现缓冲液ｐＨ为４和５时ꎬｐ２和ｐ３含量的变化随着酶解时间的增加而呈梯度变化ꎬｐＨ４时尤为明显ꎻｐＨ为６和７时ꎬ变化不明显ꎮ因此推测在某些单抗分子上ꎬＧ０Ｆ上的Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖在低ｐＨ条件下易从Ｎ糖链上脱落ꎬ使Ｇ０Ｆ形成Ｇ０Ｆ￣ＧＮꎬ从而引起Ｇ０Ｆ￣ＧＮ和Ｇ０Ｆ含量的变化ꎮ因此在进行ＰＮＧａｓｅＦ酶解时ꎬ应避免酶解体系中ｐＨ过低ꎮ图２㊀ｍＡｂ１不同ｐＨ酶解蛋白ＲＣＥ￣ＳＤＳ电泳图Ｆｉｇ.２㊀ＲｅｄｕｃｅｄＣＥ￣ＳＤＳｏｆｄｅｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｆｒｏｍｍＡｂ１ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐＨｂｕｆｆｅｒ表２㊀ｍＡｂ１在不同ｐＨ缓冲液中酶解不同时间的Ｎ糖含量Ｔａｂｌｅ２㊀Ｎ￣ｇｌｙｃａｎｃｏｎｔｅｎｔｏｆｍＡｂ１ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐＨｂｕｆｆｅｒａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｍｅｓｐＨ时间/ｈＮ糖含量/％ｐ１ｐ２ｐ３ｐ４ｐ５ｐ６ｐ７Ｍａｎ４Ｇ０Ｆ￣ＧＮＧ０ＦＭａｎ５Ｇ１ＦａＧ１ＦｂＧ２Ｆ４１９.３１.０７０.７８.０４.５１.９０.８８３.４７.３７３.０５.８４.３２.００.４２４２.０２３.４５７.６６.２３.４１.６０.４５１４.５０.８７８.６６.０４.６２.２０.４８３.８２.３７８.５５.２４.４２.３０.４２４３.７４.２７６.６５.１４.２２.２０.４６１４.５０.７７９.１５.７４.５２.２０.４８３.９１.０８０.４４.９４.４２.４０.３２４３.９１.３７９.８４.８４.３２.２０.４７１４.４０.７７９.７５.４４.５２.２０.４８３.９０.８８０.４４.８４.４２.４０.３２４３.９１.０８０.２４.７４.４２.３０.４７１２张博慧ꎬ等:利用Ｎ糖苷酶Ｆ对单克隆抗体Ｎ糖酶解条件的优化. All Rights Reserved.２.２㊀置换缓冲液的选择为避免样品缓冲液ｐＨ及成分对ＰＮＧａｓｅＦ酶解的影响ꎬ用超滤离心管将样品换液至合适的溶液中再进行ＰＮＧａｓｅＦ酶解ꎮ本研究选择了１ˑＰＢＳ溶液(ｐＨ７.４)和超纯水分别置换ｍＡｂ１和ｍＡｂ２的样品缓冲液ꎬ以未置换缓冲液(ｐＨ７)为对照ꎬＰＮＧａｓｅＦ酶解２４ｈꎬ进行Ｎ糖谱检测ꎮＮ糖色谱图和含量分别见表３和图３ꎬ结果表明１ˑＰＢＳ溶液㊁超纯水和样品缓冲液(ｐＨ７)的Ｎ糖谱结果一致ꎮ因为蛋白在超纯水中稳定性较差ꎬ所以本研究选用１ˑＰＢＳ溶液(ｐＨ７.４)置换样品的缓冲液ꎮ表３㊀ｍＡｂ１和ｍＡｂ２在样品缓冲液㊁１ˑＰＢＳ和超纯水中的Ｎ糖含量Ｔａｂｌｅ３㊀Ｎ￣ｇｌｙｃａｎｃｏｎｔｅｎｔｏｆｍＡｂ１ａｎｄｍＡｂ２ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｉｎｓａｍｐｌｅｂｕｆｆｅｒꎬ１ˑＰＢＳａｎｄｗａｔｅｒ样品名称缓冲液Ｎ糖含量/％ｐ１ｐ２ｐ３ｐ４ｐ５ｐ６ｐ７ｍＡｂ１样品缓冲液(ｐＨ７)３.９１.０８０.２４.７４.４２.３０.４１ˑＰＢＳ３.９０.８８０.４４.８４.４２.４０.３超纯水３.９１.０８０.４４.９４.４２.４０.３ｍＡｂ２样品缓冲液(ｐＨ７)/７.４４５.７５.４２４.０８.２４.９１ˑＰＢＳ/７.６４５.９５.４２４.０８.２４.８超纯水/７.７４５.８５.４２４.０８.２４.８图３㊀ｍＡｂ１和ｍＡｂ２在样品缓冲液㊁１ˑＰＢＳ和超纯水中的Ｎ糖色谱图Ｆｉｇ.３㊀Ｎ￣ｇｌｙｃａｎｐｒｏｆｉｌｅｓｏｆｍＡｂ１ａｎｄｍＡｂ２ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｉｎｓａｍｐｌｅｂｕｆｆｅｒꎬ１ˑＰＢＳａｎｄｗａｔｅｒ２.３㊀不同ＰＮＧａｓｅＦ酶对Ｎ糖结果的影响直接取２００μｇ样品ꎬ分别加入快速ＰＮＧａｓｅＦ酶(ｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ)和ＰＮＧａｓｅＦ进行酶解ꎬＮ糖谱如图４所示ꎮ结果显示用ｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ进行酶解时ꎬ若选择用ＵＰＬＣ和１.７μｍ粒径的ＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣＧｌｙｃａｎＢＥＨＡｍｉｄｅＣｏｌｕｍｎ色谱柱ꎬ则由于分离度的提高ꎬｍＡｂ２的Ｎ糖色谱图(图４Ｂ)中Ｇ０Ｆ和Ｇ１Ｆａ出现肩峰ꎬ而ＨＰＬＣ结果８１２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.Ａ:ｍＡｂ２未置换缓冲液ＨＰＬＣ检测ꎻＢ:ｍＡｂ２未置换缓冲液ＵＰＬＣ检测ꎻＣ:ｍＡｂ２置换缓冲液ＵＰＬＣ检测ꎮ图４㊀不同ＰＮＧａｓｅＦ的Ｎ糖谱结果Ｆｉｇ.４㊀Ｎ￣ｇｌｙｃａｎｐｒｏｆｉｌｅｓｏｆｍＡｂ２ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔＰＮＧａｓｅＦ(图４Ａ)由于分离度较差ꎬ此峰未得到有效分离ꎮ当将ｍＡｂ２样品缓冲液置换至１ˑＰＢＳ中时(图４Ｃ)ꎬ该肩峰消失ꎮ综合２.１~２.３部分的研究结果可知ꎬ将样品置换缓冲液至合适的溶液中再进行ＰＮＧａｓｅＦ酶解ꎬ对改善Ｎ糖谱峰形和结果准确度至关重要ꎬ本研究采用了１ˑＰＢＳ溶液ꎬ效果良好ꎮ另外ꎬ在置换缓冲液的基础上使用快速ＰＮＧａｓｅＦ能将酶解时间缩短为数十分钟ꎬ有效提高了检测效率ꎮ选择ＵＰＬＣ能有效提高分辨率ꎮ２.４㊀蛋白变性对酶解效率的影响本研究发现ꎬ在非变性条件下利用快速ＰＮＧａｓｅＦ酶解不同单抗所需酶解时间差异明显ꎬ从数分钟至数小时不等ꎮ为了有效提高酶解效率ꎬ选择所需酶解时间最长的ｍＡｂ２￣Ｆ置换缓冲液至１ˑＰＢＳ中ꎬ加入变性缓冲液(５ˑ)和１μＬｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ酶ꎬ５０ħ孵育１０ｍｉｎ后进行Ｎ糖谱检测处理ꎬ将沉淀的蛋白进行还原ＣＥ￣ＳＤＳ检测ꎬ以未加变性缓冲液(５ˑ)样品为对照ꎮ由图５还原ＣＥ￣ＳＤＳ结果可知ꎬ相同的酶解时间条件下ꎬ蛋白变性后由于高级结构被破坏ꎬＮ糖充分暴露与酶接触ꎬ所以其酶解效果更好ꎮ２.５㊀酶解程度对Ｎ糖结果的影响在非变性条件下加入不同体积的ｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ酶对ｍＡｂ２￣Ｆ进行Ｎ糖谱检测处理ꎬ将沉淀的蛋白进行还原ＣＥ￣ＳＤＳ检测ꎬ以加入变性缓冲液(５ˑ)和１μＬｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ酶的样品为对照ꎬ酶解条件均选择５０ħ㊁１０ｍｉｎꎮ由图６(左)９１２张博慧ꎬ等:利用Ｎ糖苷酶Ｆ对单克隆抗体Ｎ糖酶解条件的优化. All Rights Reserved.可知ꎬ在非变性条件下酶解相同时间ꎬ酶量的增加使非糖基化组分增多ꎬ但酶量增加至２μＬ时酶解效果仍较差ꎬ而变性条件下用１μＬｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ酶解ꎬ糖基化组分基本被转换成非糖基化组分ꎮＮ糖水解的程度不同ꎬＮ糖含量(表４)明显成梯度变化ꎬ说明ＰＮＧａｓｅＦ对不同类型的Ｎ糖水解效率不同ꎬ因此为了获得样品中真实的Ｎ糖含量水平ꎬ应将Ｎ糖尽量酶解完全ꎮ图５㊀ｍＡｂ２￣Ｆ在变性和非变性条件下切糖后还原ＣＥ￣ＳＤＳ图谱Ｆｉｇ.５㊀ＲＣＥ￣ＳＤＳｐｒｏｆｉｌｅｓｏｆｍＡｂ２￣Ｆｄｅｇｌｙｃａｔｅｄｉｎｎａｔｕｒｅａｎｄｄｅｎａｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ表４㊀不同体积ｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ酶解ｍＡｂ２￣Ｆ的Ｎ糖含量Ｔａｂｌｅ４㊀Ｎ￣ｇｌｙｃａｎｃｏｎｔｅｎｔｏｆｍＡｂ２￣ＦｄｅｇｌｙｃａｔｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦａｍｏｕｎｔＲａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ/μＬＮ糖含量/％Ｇ０Ｍａｎ５Ｇ１ａＧ１ｂＧ２０.５４３.４１８.４１８.４５.５２.６１.０４８.０１２.９２０.１６.４２.９２.０５４.５７.９２１.２７.３３.１１＋变性５５.２７.５２０.０８.０３.１３㊀讨论Ｎ糖检测结果的准确性受多种因素的影响ꎮ在缓冲液ｐＨ对ＰＮＧａｓｅＦ酶解的影响研究中发现ꎬ低ｐＨ能使某些单抗在酶解过程中Ｇ０Ｆ逐渐转化为Ｇ０Ｆ￣ＧＮꎬ造成检测结果的严重偏差ꎬ这种情况通常出现在ＰｒｏｔｅｉｎＡ亲和纯化后的样本ꎬ在低ｐＨ洗脱后直接进行酶解ꎬ若先将样品缓冲液ｐＨ调至中性或进行换液处理ꎬ能够避免ｐＨ的影响ꎮ对照ｍＡｂ２置换和未置换样品缓冲液酶解结果ꎬ置换缓冲液能有效消除Ｇ０Ｆ和Ｇ１Ｆａ的肩峰ꎬ消除样品缓冲液成分对检测结果的影响ꎮ另外ꎬ本研究对多种单抗的研究发现ꎬ酶解程度不同的Ｎ糖检测结果存在明显差异ꎬ说明Ｎ糖苷酶Ｆ对不同类型的Ｎ糖水解效率不同ꎬ这与已有文献报道[２０]一致ꎮ因此为了获得样品中真实的Ｎ糖含量水平ꎬ应将Ｎ糖尽量酶解完全ꎮ酶解程度可采用将蛋白沉淀进行还原ＣＥ￣ＳＤＳ检测ꎬ观察非糖基化组分含量的变化情况ꎮ在细胞株筛选和工艺优化阶段ꎬ快速㊁准确的Ｎ糖检测结果能够有效推进开发进度ꎬ而该阶段０２２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.图６㊀不同体积ｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ酶解ｍＡｂ２￣Ｆ的ＲＣＥ￣ＳＤＳ和Ｎ糖谱图Ｆｉｇ.６㊀Ｎ￣ｇｌｙｃａｎａｎｄＲＣＥ￣ＳＤＳｐｒｏｆｉｌｅｓｏｆｍＡｂ２￣ＦｄｅｇｌｙｃａｔｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦａｍｏｕｎｔ巨大的样本量又对成本控制提出更高的要求ꎬ因此建立一种高效㊁准确且低成本的Ｎ糖检测方法尤为重要ꎮ本研究确定了较为通用的ＰＮＧａｓｅＦ酶对单克隆抗体的酶解条件ꎬ即为将样品置换缓冲液至１ˑＰＢＳꎬ取适量样品加入变性缓冲液(５ˑ)和１μＬＲａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ酶ꎬ５０ħ孵育１０ｍｉｎꎬ进行后续除蛋白㊁干燥等处理ꎬ快速ＰＮＧａｓｅＦ酶和变性处理的应用ꎬ将酶解时间大幅缩短ꎬ提高了检测效率ꎻ同时采用传统的ＵＰＬＣ和ＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣＧｌｙｃａｎＢＥＨＡｍｉｄｅＣｏｌｕｍｎ色谱柱ꎬ有效提高了分离度ꎬ并控制了检测成本ꎮ参㊀考㊀文㊀献[１]㊀ＦＲＩＥＳＳＷꎬＳＥＩＤＬＡꎬＳＯＥＲＧＥＬＦꎬｅｔａｌ..Ｎ￣ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙａｎｄｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅꎬｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｐｈａｒ￣ｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＦｃｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｓ[Ｊ].Ｅｕｒ.Ｊ.Ｐｈａｒｍ.Ｂｉｏｐｈａｒｍ.ꎬ２０１６ꎬ１００:９４－１００. [２]㊀刘晓宇.单克隆抗体糖基化修饰的研究现状和进展[Ｊ].中国生物制品学杂志ꎬ２０２０ꎬ３３(２):２１６－２２１. [３]㊀ＬＩＵＬ.Ａｎｔｉｂｏｄｙｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎａｎｄｉｔｓｉｍｐａｃｔｏｎｔｈｅｐｈａｒｍａｃｏ￣ｋｉｎｅｔｉｃｓａｎｄｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＦｃ￣ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｓ[Ｊ].Ｊ.Ｐｈａｒｍ.Ｓｃｉ.ꎬ２０１５ꎬ１０４(６):１８６６－１８８４.[４]㊀ＳＨＩＥＬＤＳＲＬꎬＬＡＩＪꎬＫＥＣＫＲꎬｅｔａｌ..Ｌａｃｋｏｆｆｕｃｏｓｅｏｎｈｕ￣ｍａｎＩｇＧ１Ｎ￣ｌｉｎｋｅｄｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｉｍｐｒｏｖｅｓｂｉｎｄｉｎｇｔｏｈｕｍａｎＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａｎｄａｎｔｉｂｏｄｙ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｅｌｌｕｌａｒｔｏｘｉｃｉｔｙ[Ｊ].Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.ꎬ２００２ꎬ２７７:２６７３３－２６７４０.[５]㊀ＢＯＹＤＰＮꎬＬＩＮＥＳＡＣꎬＰＡＴＥＬＡＫ.Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｔｈｅｒｅ￣ｍｏｖａｌｏｆｓｉａｌｉｃａｃｉｄꎬｇａｌａｃｔｏｓｅａｎｄｔｏｔａｌｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｏｎｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＣａｍｐａｔｈ￣１Ｈ[Ｊ].Ｍｏｌ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.ꎬ１９９５ꎬ３２:１３１１－１３１８.[６]㊀ＪＯＮＥＳＡＪꎬＰＡＰＡＣＤＩꎬＣＨＩＮＥＨꎬｅｔａｌ..Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｃｌｅａｒ￣１２２张博慧ꎬ等:利用Ｎ糖苷酶Ｆ对单克隆抗体Ｎ糖酶解条件的优化. All Rights Reserved.ａｎｃｅｏｆｇｌｙｃｏｆｏｒｍｓｏｆａｃｏｍｐｌｅｘｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｃａｕｓｅｄｂｙｔｅｒｍｉｎａｌＮ￣ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅｉｓｓｉｍｉｌａｒｉｎｈｕｍａｎｓａｎｄｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓｍｏｎｋｅｙｓ[Ｊ].Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ２００７ꎬ１７:５２９－５４０.[７]㊀ＫＥＣＫＲꎬＮＡＹＡＫＮꎬＬＥＲＮＥＲＬꎬｅｔａｌ..ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｃｏｍｐｌｅｘｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｗｈｏｓｅｖａｒｉａｂｌｅｍｅｔａｂｏｌｉｃｃｌｅａｒａｎｃｅｉｎｈｕｍａｎｉｓｄｅｐｅｎｄｅｎｔｏｎｔｅｒｍｉｎａｌＮ￣ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅｃｏｎｔｅｎｔ[Ｊ].Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓꎬ２００８ꎬ３６:４９－６０.[８]㊀ＮＩＭＭＥＲＪＡＨＮＦꎬＲＡＶＥＴＣＨＪＶ.Ｔｈｅａｎｔｉ￣ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙａｃ￣ｔｉｖｉｔｙｏｆＩｇＧ:ｔｈｅｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓＩｇＧｐａｒａｄｏｘ[Ｊ].Ｊ.Ｅｘｐ.Ｍｅｄ.ꎬ２００７ꎬ２０４:１１－１５.[９]㊀王冲ꎬ郭怀祖.不同细胞系表达的抗ＥＧＦＲ单抗糖基化结构对比分析[Ｊ].生物工程学报ꎬ２０１７ꎬ３３(６):１０１８－１０２７. [１０]㊀ＺＨＥＮＧＫꎬＢＡＮＴＯＧＣꎬＢＡＹＥＲＲ.Ｔｈｅｉｍｐａｃｔｏｆｇｌｙｃｏｓｙｌａ￣ｔｉｏｎｏｎｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｓｔａｂｉｌｉｔｙ[Ｊ].ＭＡｂｓꎬ２０１１ꎬ３:５６８－５７６.[１１]㊀ＫＩＬＤＥＧＡＡＲＤＨＦꎬＦＡＮＹＺꎬＳＥＮＪＷꎬｅｔａｌ..Ｇｌｙｃｏｐｒｏｆｉｌ￣ｉｎｇｅｆｆｅｃｔｓｏｆｍｅｄｉａａｄｄｉｔｉｖｅｓｏｎＩｇＧｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙＣＨＯｃｅｌｌｓｉｎｆｅｄ￣ｂａｔｃｈｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｂｉｏｅｎｇｉｎ.ꎬ２０１６ꎬ１１３(２):３５９－３６６.[１２]㊀ＢＥＮＪＡＭＩＮＤꎬＮＥＨＡＭꎬＭＩＣＨＡＥＬＢ.Ａｌｏｗｒｅｄｏｘｐｏｔｅｎｔｉａｌａｆｆｅｃｔｓｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙａｓｓｅｍｂｌｙａｎｄｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｉｎｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅ[Ｊ].Ｊ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０１７ꎬ２４６:７１－８０.[１３]㊀ＳＴＥＦＡＮＦꎬＪＯＥＲＧＨꎬＨＡＮＮＳ￣ＣＨＲＩＳＴＩＡＮＭ.Ｇｌｙｃａｔｉｏｎｄｕｒｉｎｇｓｔｏｒａｇｅａｎｄａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｆｏｒｍｕ￣ｌａｔｉｏｎｓ[Ｊ].Ｅｕｒ.Ｊ.Ｐｈａｒｍ.Ｂｉｏｐｈａｒｍ.ꎬ２００８ꎬ７０:４２－５０. [１４]㊀丛宇婷ꎬ胡良海.单克隆抗体药物糖基化修饰分析研究进展[Ｊ].色谱ꎬ２０１６ꎬ３４(１２):１１８６－１１９１.[１５]㊀ＭＥＬＩＳＳＡＨꎬＹＡＮＧＷꎬＲＩＣＨＡＲＤＲ.ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＮ￣ｌｉｎｋｅｄｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｉｎａｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｐｒｏｄｕｃｅｄｉｎＮＳ０ｃｅｌｌｓｕｓｉｎｇｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｗｉｔｈｌａｓｅｒ￣ｉｎｄｕｃｅｄｆｌｕｏｒｅｓ￣ｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎ[Ｊ].Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓꎬ２０１３ꎬ６:３９３－４０６. [１６]㊀ＧＥＮＮＡＲＯＬＡꎬＳＡＬＡＳ￣ＳＯＬＡＮＯＯ.Ｏｎ￣ｌｉｎｅＣＥ￣ＬＩＦ￣ＭＳｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｏｒｔｈｅｄｉｒｅｃｔｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＮ￣ｌｉｎｋｅｄｇｌｙｃａｎｓｆｒｏｍｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ[Ｊ].Ａｎａｌｙｔ.Ｃｈｅｍ.ꎬ２００８ꎬ８０:３８３８－３８４５.[１７]㊀李媛ꎬ邱建华ꎬ陈家琪ꎬ等.液相色谱－质谱技术对利妥昔单抗及其类似药结构表征和相似性的研究[Ｊ].国际生物制品学杂志ꎬ２０１６ꎬ３９(３):１１６－１２１.[１８]㊀ＣＨＥＮＸꎬＦＬＹＮＮＧＣ.ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＮ￣ｇｌｙｃａｎｓｆｒｏｍｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＧｂｙｏｎ￣ｌｉｎｅｒｅｖｅｒｓｅｄ￣ｐｈａｓｅｈｉｇｈ￣ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ/ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ[Ｊ].Ａｎ￣ａｌｙｔ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.ꎬ２００７ꎬ３７０:１４７－１６１.[１９]㊀ＴＡＲＥＮＴＩＮＯＡＬꎬＧÓＭＥＺＣＭꎬＰＬＵＭＭＥＲＴＨＪ.Ｄｅｇｌｙｃｏ￣ｓｙｌａｔｉｏｎｏｆａｓｐａｒａｇｉｎｅ￣ｌｉｎｋｅｄｇｌｙｃａｎｓｂｙｐｅｐｔｉｄｅ:Ｎ￣ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅＦ[Ｊ].Ｂｉｏ￣ｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ１９８５ꎬ２４:４６６５－４６７１.[２０]㊀ＨＵＡＮＧＹＮꎬＲＯＮＯ.ＫｉｎｅｔｉｃｓｏｆＮ￣ｇｌｙｃａｎｒｅｌｅａｓｅｆｒｏｍｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＧ(ＩｇＧ)ｂｙＰＮＧａｓｅＦ:ａｌｌｇｌｙｃａｎｓａｒｅｎｏｔｃｒｅａｔｅｄｅｑｕａｌ[Ｊ].Ｊ.Ｂｉｏｍｏｌ.Ｔｅｃｈｎ.ꎬ２０１７ꎬ２８:１５０－１５７.２２２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.。

抗体药物的名词解释

抗体药物的名词解释抗体药物，是指利用生物技术手段从动物或人体中提取、通过进一步研究与改造得到的一类重要药物。

抗体是免疫系统中的一种蛋白质，能够与特定的抗原结合，并识别并中和病原体，起到免疫防御的作用。

抗体药物的出现给很多难以治疗的疾病带来了新的希望。

一、抗体药物的历史和发展抗体药物的历史可以追溯到19世纪末。

当时，法国微生物学家Emil von Behring首次发现了人的血浆中含有一种可以抵抗破伤风病毒的物质，他将其命名为“抗体”。

这是人类首次对抗体的认识，也为抗体药物的研究启示了一道闪光之光。

随着科技的进步，人们发现利用抗体作为治疗药物具有巨大的潜力。

20世纪，随着生物技术的飞速发展，抗体药物的研究进入了新的时代。

1986年，第一种人源化单克隆抗体药物Orthoclone OKT3在美国获得批准上市，这标志着抗体药物正式进入临床应用阶段。

此后，抗体药物的研究蓬勃发展，不断涌现出一大批重要的抗体药物，为许多疾病的治疗提供了全新的选择。

二、抗体药物的类型根据制备方式和来源，抗体药物主要分为四类：小分子抗体、完全人源抗体、人源化抗体和单克隆抗体。

1. 小分子抗体：小分子抗体是指分子量较小、结构较简单的抗体，通常由1-5个单克隆抗体片段组成。

相对于其他抗体药物，小分子抗体有很好的渗透性和稳定性，能够更容易通过细胞膜，在组织间穿梭，因此对一些具有细胞内靶点的疾病具有独特的药理学优势。

2. 完全人源抗体：完全人源抗体是指完全由人源的抗原决定区(Fab)构成的抗体。

由于与人体自身免疫系统具有较高的相似性，完全人源抗体通常具有较好的稳定性和生物相容性，在潜在的免疫系统相关问题上风险较小。

3. 人源化抗体：人源化抗体是指将小鼠或其他动物源的抗体框架与人类Fc区域结合的抗体。

人源化抗体的结构介于完全人源抗体和小鼠抗体之间，既保留了小鼠源抗体的抗原识别能力，又减小了免疫反应的发生。

4. 单克隆抗体：单克隆抗体是指由具有相同抗原特异性的单个抗体细胞克隆而获得的抗体。

生物制药中的表达系统选择和使用注意事项

生物制药中的表达系统选择和使用注意事项生物制药是一项利用生物学原理和技术来生产药物的领域，其中表达系统的选择和使用是至关重要的步骤。

表达系统是指将目标基因转录成mRNA并翻译成蛋白质的系统，它直接关系到生物制药中药物产量、质量和效力等方面。

在选择和使用表达系统时，需要考虑多种因素，包括目标蛋白的性质、产量要求、系统稳定性和成本效益等。

首先，选择表达系统时需要考虑目标蛋白的性质。

不同的蛋白质具有不同的结构和功能，因此需要根据目标蛋白是否是酶、激素、抗体等来选择合适的表达系统。

例如，如果目标蛋白是细胞内酶，可以考虑使用大肠杆菌表达系统，因为大肠杆菌对这类蛋白的表达效果较好。

而如果目标蛋白是复杂的膜蛋白，可以考虑使用哺乳动物细胞表达系统，因为哺乳动物细胞具有更接近人体细胞的表达环境。

其次，生物制药中的表达系统选择还需考虑产量要求。

不同的表达系统对蛋白质的表达能力有所差异，选择合适的表达系统可以提高蛋白质的产量。

例如，选择细胞系表达系统时，可以选择具有高复制和表达能力的细胞系，如CHO细胞。

此外，一些表达系统还可以通过基因工程技术增加蛋白质的产量。

例如，可以通过插入多个目标基因拷贝、优化启动子序列和信使RNA的稳定性等方式来提高表达系统的产量。

同时，选择表达系统还需要考虑系统的稳定性。

所谓稳定性指的是表达系统能否持续稳定地表达目标蛋白。

在生物制药中，长时间和稳定的表达对于大规模生产药物至关重要。

因此，选择具有稳定表达能力的表达系统非常重要。

例如，大肠杆菌表达系统常常因为由于毒力基因的表达而导致大规模突变，从而降低了系统的稳定性。

而哺乳动物细胞表达系统，虽然表达系统稳定性较高，但细胞系的稳定性会受到外界环境的影响。

此外，成本效益也是选择表达系统时需要考虑的因素。

不同的表达系统所需的设备、耗材和操作成本都不同。

因此，在选择表达系统时，需要综合考虑产量要求和成本效益。

对于小规模生产或科研用途而言，大肠杆菌表达系统通常是较为经济的选择；而对于大规模生产企业而言，哺乳动物细胞表达系统可能更具成本效益。

重组蛋白的表达系统(详细版)

• 启动子受细胞类型的限制，在不同的细胞系中有很大不同，因此需根据宿主细胞（尤其是真核宿主）的类型选择不同的启动子以便于目的基因的高效表达。
• 融合标签： • 融合标签是与目的蛋白共表达的一段多肽，方便重组蛋白的纯化、固定和检测，表3给出了常用的重组
标签。如果不需要对重组蛋白进行纯化，尽量不要引入融合标签，以免影响蛋白性质；如果重组蛋白本身能够结合某种亲和柱，如某些金属结合蛋白可以结合Ni-NTA，某些糖结合蛋白能够特异识别糖类，也不必引入标签。 • 融合标签的引入能够大大简化重组蛋白的纯化流程，并提高蛋白溶解度。商业化表达质粒，如pET、 pGEX等提供了各种纯化标签和融合蛋白供选，应根据蛋白具体情况进行选择。 • His-tag是最常用的纯化标签，它具有很多优点：标签较短（10-20个氨基酸残基），不带电（pH8.0），免疫原性差，通常不影响重组蛋白的结构和功能，Ni2+亲和力高，能够通过一步纯化达到60%-90%的纯度。 • 如果蛋白质溶解度不高，导致折叠困难、表达量低，可以选择较大的融合标签（GST、MBP、Trx等）帮助重组蛋白表达和折叠，提高重组蛋白溶解度，从而提高表达量。较大的融合标签有时也会导致翻译困难甚至提前中止，纯化后发现大部分都是标签蛋白也是常见现象。翻译的提前中止会大大影响重组蛋白产率和后续纯化，所以在短标签能够达到目的的时候，尽量不要选择大的融合标签。 • 标签位置的选择也很重要：N端标签（短的或长的）自身带有启动子和适应宿主偏好的密码子，可以帮助目的蛋白表达，提高表达量，但是提前中止翻译的蛋白片段也会被一并纯化出来，降低重组蛋白纯度，对蛋白酶敏感的、自身容易降解的以及一级序列中有集中的疏水残基区的蛋白尤其要避免使用N端标签； C端标签则可以保证只有完整蛋白得到纯化。另外，如果蛋白的近N端或近C端有重要功能区，如酶活中心、配体结合位点、二硫键、多聚体稳定界面、相互作用界面等，则要避免纯化标签位于该末端，以免影响重组蛋白的结构和功能。