细胞传代标准化步骤
细胞培养传代冻存复苏操作规程自编
细胞培养传代冻存复苏操作规程自编.doc细胞培养传代、冻存、复苏操作规程第一章总则第一条目的为规范细胞培养实验室的操作流程，确保细胞培养的质量和安全，特制定本操作规程。
第二条适用范围本规程适用于所有进行细胞培养、传代、冻存和复苏的实验室人员。
第三条安全与健康实验室人员在操作过程中必须遵守生物安全和个人防护的相关规范。
第二章细胞培养传代第四条传代前的准备检查细胞培养基、血清、胰蛋白酶等消耗品的质量和数量。
确保无菌操作台、培养箱、显微镜等设备正常运行。
第五条传代操作步骤细胞观察：在显微镜下观察细胞形态，确认细胞健康状况。
培养基更换：使用无菌操作吸去旧培养基，加入适量的胰蛋白酶。
细胞分离：待细胞变圆后，轻敲培养瓶，使细胞脱落。
细胞计数：使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。
细胞传代：根据细胞密度和传代比例，将细胞加入新的培养基中。
第六条传代后的观察观察细胞在新培养基中的附着情况。
定期检查细胞的形态和生长状态。
第三章细胞冻存第七条冻存前的准备准备冻存管、冻存液（含DMSO）、标签等。
确保液氮罐或程序降温仪处于良好状态。
第八条冻存操作步骤细胞计数：确保细胞密度和活力符合冻存要求。
冻存液配制：按照比例加入DMSO至冻存液中。
细胞悬液制备：将细胞与冻存液混合均匀。
细胞冻存：将细胞悬液分装至冻存管中，标记信息。
降温过程：将冻存管放入程序降温仪或直接浸入液氮中。
第九条冻存后的管理将冻存管放入液氮罐中，记录存放位置。
定期检查液氮罐的液位和温度。
第四章细胞复苏第十条复苏前的准备准备培养基、胰蛋白酶、无菌操作台等。
检查培养箱、显微镜等设备是否正常。
第十一条复苏操作步骤取出冻存管：从液氮罐中取出所需冻存管。
快速解冻：将冻存管置于37°C水浴中快速解冻。
细胞悬液制备：将解冻后的细胞迅速转移到含有培养基的离心管中。
离心去除DMSO：低速离心以去除DMSO。
细胞培养：将细胞重悬于新鲜培养基中，转入培养瓶中培养。
细胞传代、铺板 、冻存、复苏等细胞培养相关操作步骤和注意事项
细胞传代的步骤（贴壁细胞为例）
首先，镜下观察细胞密度，90%以上即可传代培养（为了细胞的稳定，距离上 一次传代至少间隔一天。）。
准备工作：无菌枪头、培养瓶、离心管、废液桶等所需物品，培养基、血清、 PBS、胰酶等试剂类，可根据情况，提前放入生物安全柜，进行紫外灭菌；
细胞传代的步骤（贴壁细胞为例）
培养液量 （ml）
0.1 0.2 0.5 1 2 2 5 10 5 15-30
100%细胞量（105） （约） 1 2.5 5 10 25 20 52 137 50 200
培养板需要加入的细胞量
细胞培养板中加入细胞的数量，需要考虑一下几点： 1. 常规实验的设计：转染siRNA（约30%-50%），转染质粒（约70%-
结合镜下观察，调整浓度。 ❖2. 计数细胞：参考前文中各种规格中100%满时细胞的大概数量，再根据实验的
要求，计算加入的细胞的数量。（使用计数板）
细胞计数板的使用
细胞计数板
0.1ul
干净的盖玻片
细胞计数板的使用
10-20 ul 细胞悬液 注意: 避免有气泡！
数上不数下，数左不数右
计算公式： n/4 x104 （个/ml）
4.其他：轻轻移动他人的细胞，轻轻关闭培养箱的门等
细胞冻存
准备工作：FBS，完全培养基，DMSO，或无血清冻存液，冻存管，冻存盒。 常规的细胞传代步骤，至细胞消化后离心完毕，根据细胞的量以及需要冻存的管
数配制冻存液； 冻存液： 10%DMSO+90%FBS/完全培养基（A），或者无血清冻存液（B）。 冻存程序： A ： 1. 使用冻存盒：可直接放入-80℃冰箱，第二天转移入液氮罐中。
把细胞转移到生物安全柜中，吸去培养基，加入无菌PBS（只要没过即 可），轻轻摇动清洗细胞，尽量弃尽PBS。
细胞培养传代标准操作规程
1、目的：建立Vero细胞培养传代标准操作规程，确保检验操作标准化、规范化。
为了保证培养细胞的正常生长，实验技术人员必须明确并正确执行细胞培养传代的基本操作步骤，特制订实验室细胞培养传代操作流程。
2、范围：适用于Vero细胞培养传代实验人员.3、编制依据《企业注册标准WS4—（S—009-2）—2003Z》。
4、Vero细胞培养传代操作规程4。
1试药与试液1、细胞：Vero细胞。
2、液体：0。
25%胰蛋白酶溶液；7。
5%碳酸氢钠溶液;小牛血清；PBS缓冲液；10×199培养液、灭菌注射用水、EDTA溶液。
4.2仪器与用具1、恒温培养箱；2、倒置生物显微镜。
4。
3操作方法4.3.1细胞培养、传代1、准备好细胞培养传代所需物品，紫外线照台30min。
2、挑选细胞形态佳、无污染的Vero细胞，弃旧生长液.3、细胞面经少量EDTA溶液洗涤后,加入胰蛋白酶等消化液适量（胰酶铺平培养瓶底为佳），倒置显微镜下观察培养瓶内细胞,一旦发现大量细胞胞质回缩,细胞间隙增大，但未脱离培养瓶底，立刻用吸细胞液的滴管吸出胰酶弃去，4、把细胞培养瓶置37。
0℃±0。
5℃孵育让残存的胰酶继续消化,（在37℃胰酶消化效果最佳）,每1min把培养瓶拿到倒置显微镜下观察，当观察到细胞变圆,透亮，细胞间隙明显增大时，加入先配好的完全培养基适量终止消化,用吸管轻柔吹打分散细胞，制备成均一的细胞悬液。
5、取一滴细胞悬液进行计数（此步骤是为了积累培养细胞的经验,观察多少密度的细胞具体几天可以长满,待有经验后此步骤可以省略.）6、传代：不同细胞根据细胞数量、生长快慢、难易等,一般按照1：3-1：5比例进行传代。
先用滴管吹打混匀细胞悬液，平均分配细胞悬液到各个培养瓶中，补足完全培养基使液体总体积达到40ml左右，平放到培养箱中继续培养。
7、收拾所用物品、用75%酒精喷洒操作台，擦台，保持台面整洁。
4。
3.2填写记录：1、随试验进程做好试验记录（按实验记录规范要求)，包括试剂的厂家、批号、效期，试验时间，试验结果。
细胞传代标准化步骤
细胞传代标准化流程：
穿戴好白大褂和手套,用75%酒精擦手；
1、取出细胞,显微镜下观察细胞形态和密度,确定细胞生长状况,是否需要传代或换液；
2、将培养基如有需要还有血清和大瓶高糖培养基、PBS、胰酶培养基等预热及超净台消毒
结束后,将试剂及细胞等喷酒精后移入超净台,将废液缸喷足酒精移入超净台,取酒精棉放入超净台；
3、点燃酒精灯,将瓶口拧松,过火消毒；
4、在确定细胞生长状况良好且没有污染的情况下,将培养皿中的培养基取大培养皿6ml,
中培养皿3ml至一个新的15ml离心管中；一个1ml枪头
5、用适量PBS清洗细胞表面大皿5ml,中皿3ml,并弃去PBS；一个5ml枪头
6、加入适量胰酶消化细胞大皿1ml,中皿,此时可将细胞置于37°C细胞培养箱内消化；
C2C12用5min,3T3-L1用,一个1ml枪头
7、待消化完全后,用胰酶6倍体积的完全培养基中止消化,并吹打培养皿皿底,将细胞移入
离心管；一个5ml枪头
8、1000rpm,5min离心,离心间隙可以准备好传代的细胞培养皿,并加好培养基；
9、弃上清,口擦酒精,烧口；
10、加适量完全培养基吹打混匀细胞沿壁轻轻吹打24次左右,按合适比例进行细胞传
代,在盖上标记好细胞名称、代数及传代日期并放入孵箱;一个1ml枪头
11、将所有试管收至冰箱,将废液缸及废液取出,装至一次性PE手套,废液缸喷酒精清
洗
12、用酒精棉仔细擦拭操净台表面,检查显微镜、离心机是否关闭,孵箱是否正常；
13、做试验记录,打开超净台和细胞间紫外,15min后关闭。
beas-2b细胞传代步骤
beas-2b细胞传代步骤Beas-2B细胞是一种人类正常气道上皮细胞系，广泛应用于气道疾病的研究中。
要进行Beas-2B细胞的传代，需要经过以下步骤。
步骤一：准备工作在进行细胞传代之前，需要准备一些实验室常用的培养基和试剂，如DMEM/F12培养基、胎牛血清、三春霉素等。
步骤二：细胞解冻从液氮罐中取出存放Beas-2B细胞的冻存管，将其迅速放入37℃的水浴中解冻。
解冻后，将细胞转移到离心管中，并通过离心将细胞沉积在管底。
步骤三：细胞培养将培养基预先加热至37℃，并添加适量的胎牛血清。
将解冻后的细胞转移到含有培养基的离心管中，并用移液器轻轻混合。
将混合后的细胞转移到细胞培养瓶中，放入37℃、5%CO2的培养箱中培养。
步骤四：观察细胞增殖培养的前几天，观察细胞的生长情况。
正常情况下，Beas-2B细胞会开始进行增殖，细胞数量逐渐增多，培养瓶内的细胞会呈现出充实的状态。
步骤五：细胞分离当细胞生长到80%至90%的密度时，即细胞达到对数生长期，可以进行细胞分离。
首先，将培养瓶中的培养基倒掉，并用PBS缓冲液冲洗细胞两次，以去除残留的培养基。
然后，加入适量的胰酶-EDTA 消化液，使细胞与其充分接触，并放入37℃的培养箱中进行消化。
随后，用细胞培养液停止消化反应，并用移液器轻轻吹洗，使细胞从底部离析。
步骤六：细胞传代将分离得到的细胞转移到新的细胞培养瓶中，加入适量的培养基，并放入培养箱中继续培养。
细胞传代后，可以观察到细胞数量的进一步增加，培养瓶内的细胞再次呈现出充实的状态。
细胞传代的关键是控制好细胞的分离程度和传代次数。
过度分离会导致细胞死亡，而过多的传代次数则可能引起细胞老化。
因此，在进行细胞分离和传代时，需要根据实际情况来进行调整，以保证细胞的生长和稳定。
总结起来，Beas-2B细胞的传代步骤包括准备工作、细胞解冻、细胞培养、观察细胞增殖、细胞分离和细胞传代。
通过合理的控制和操作，可以成功地进行Beas-2B细胞的传代，并为后续的实验研究提供可靠的细胞资源。
细胞传代培养的关键步骤
细胞传代培养的关键步骤
1. 选择合适的细胞株：根据研究目的选择合适的细胞株。
常见的细胞株有HEK293、CHO等。
2. 孵育细胞：将细胞株接种在含有营养物质和抗生素的培养基中，提供适宜的温度和湿度，促使细胞增殖。
3. 贴壁培养：将细胞株从液体培养基中离心收集，并悬浮在含有培养基的培养瓶中，使其黏附到培养瓶底部。
4. 细胞分离：当细胞生长到合适的密度时，进行细胞分离。
可以使用胰蛋白酶等消化酶将细胞从培养瓶中剥离。
5. 细胞传代：将分离的细胞重新接种到新的培养瓶中，继续进行培养。
6. 培养条件的管理：细胞传代过程中，需要确保培养基的质量，管理适宜的培养条件，包括温度、CO2浓度和培养时间等。
7. 污染检测：定期检测细胞培养物是否受到污染，如细菌、真菌或其他细胞株的污染。
细胞传代培养实验步骤
细胞传代培养是生物学研究中常用的实验技术，用于保持细胞系的稳定性和活力。
以下是细胞传代培养的一般步骤：
培养基准备：准备适当的培养基，包括生长因子、营养物质和抗生素（如果需要）。
确保培养基的配制符合细胞系的特殊需求。
细胞检查：使用显微镜检查细胞的形态、数量和健康状态。
确保细胞处于适当的生长状态，没有受到感染或其他异常。
细胞收获：从之前的培养瓶中将细胞收获下来。
这通常涉及用胰酶等酶类来解离细胞，使其从培养瓶表面脱离。
细胞计数：使用血球计数板或自动细胞计数仪等工具，计算细胞的数量。
这有助于确定传代时应该用多少细胞。
传代操作：将收获的细胞按照既定的比例重新分配到新的培养瓶中。
传代的目的是dilution 细胞，以确保它们能够继续健康地生长。
培养新的细胞群：将传代后的细胞放入培养箱中，提供适当的环境条件（温度、湿度、CO2浓度等），促使细胞继续生长。
观察细胞生长：在培养过程中，通过定期使用显微镜观察细胞的形态和生长状态。
确保它们没有发生异常变化。
培养基更替：根据需要，定期更换培养基，以提供新的营养物质和保持适当的环境条件。
细胞冻存（可选）：如果需要，可以将一部分细胞冻存起来，以备将来的实验使用。
冻存细胞是为了防止细胞系的丧失或污染。
以上步骤是一般细胞传代培养的基本流程，具体操作可能会根据不同的细胞系、实验目的和实验室条件而有所调整。
在进行实验前，请确保你了解所使用细胞系的特性和培养条件。
MSC细胞传代培养标准操作流程(2)
间充质干细胞传代培养标准操作流程1 目的和范围：1.1 目的：规范间充质干细胞培养操作流程，保证间充质干细胞传代产品制备的稳定性、均一性。
1.2 范围：适用于本实验室细胞培养技术人员间充质干细胞传代培养的全过程。
2 文件：2.1 间充质干细胞传代培养标准操作流程。
3 记录：3.1 间充质干细胞传代培养记录。
3.2溶液配制记录。
3.3清场记录。
4 试剂与耗材：4.1试剂：75%酒精、生理盐水、DMEM培养基（低糖）、Ultroser G(血清替代物)、干细胞冻存液、0.25%胰蛋白酶（含EDTA）。
4.2 仪器设备：超净工作台、CO2培养箱、倒置显微镜、镊子、1ml移液枪、水浴锅、离心机、细胞计数仪、电动移液枪、试管架。
4.3耗材：50ml离心管、T175培养瓶、T25培养瓶、2ml冻存管、1ml枪头、10ml移液管、封口膜、无菌纱布。
5工作程序：5.1实验前准备：5.1.1 洁净区及超净工作台紫外照射≥30min，风机开启≥5min。
5.1.2 耗材准备：将已灭菌且在有效期内的器械放入传递窗内紫外照射≥30min后，去包布，经酒精擦拭后放入超净工作台备用。
5.1.3 将DMEM培养基、生理盐水、Ultroser G(血清替代物)、0.25%胰蛋白酶提前30min从冰箱取出待用。
5.1.4 将DMEM培养基、生理盐水、Ultroser G(血清替代物)、0.25%胰蛋白酶用酒精擦拭后放入超净工作台，以便恢复至室温。
5.1.5 将50ml离心管、T175培养瓶、T25培养瓶、2ml冻存管、1ml枪头、10ml移液管经酒精擦拭后放入超净工作台备用。
5.2溶液配制：5.2.1配制要求：实验室所有试剂配制应在超净工作台内，按照试剂说明书或按照实验室细胞培养要求配制试剂。
5.2.2Ultroser G(血清替代物)溶液配制：取一瓶Ultroser G(血清替代物)粉剂，用一次性注射器加入20ml超纯水（无菌）使其溶解约10-15min，再用0.2um一次性过滤器过滤备用。
细胞传代培养详细操作步骤
细胞传代培养详细操作步骤
流式细胞传代培养技术是一种常用的细胞培养技术，主要用于研究细胞的生长、变化和分化特性。
在研究细胞分化，衰老和死亡过程中，流式细胞传代培养十分重要。
而对流式细胞传代培养的详细操作步骤则具有非常重要的意义。
以下我将介绍流式细胞传代培养的详细操作步骤：
1．获取样品：首先要准备所需的培养基，然后将细胞从培养皿中接种到培养基中；
2．将细胞培养在培养盘中，因为细胞细胞在培养基中不断地增殖；
3．将培养基中细胞转移到新培养皿；
4．每次培养时，从培养皿中移去细胞末端，然后用新的培养基替换原来的培养基；
5．为了使细胞保持活性，可以采用代数培养，即每隔一段时间就将培养基更新成新的培养基；
6．按照细胞对培养基配比和温度要求，调整培养基，然后加入培养基中；
7．把培养基放入培养箱中，调节温度、湿度、二氧化碳浓度，二氧化碳浓度控制在5～10％，培养温度控制在37℃附近；
8．将培养盘放入培养箱中，定期检查，控制细胞的增殖情况；
9．当细胞足够分裂时，取出培养盘，用解毒液处理，然后冰冻保存细胞，用于后续研究。
以上就是流式细胞传代培养技术的整个操作过程，从样本获取到细胞保存，是一种有效而又系统的操作技术，也是细胞培养和研究的重要方法。
熟练掌握并正确操作流式细胞传代培养，对于更好地利用细胞培养来研究细胞分化，衰老和死亡等活动有着至关重要的意义。
细胞传代的过程及注意事项
细胞传代的过程及注意事项
细胞传代是细胞培养中最常见的操作，它是将已经在体外培养的细胞
放置到新的培养基中，继续生长繁殖的一种方法。
传代的过程一般包括准
备培养基、细胞膜解析、细胞数量细胞的复制、再次放置细胞、监测细胞
增殖等步骤。
1、培养基的准备：通常，将培养基煮沸后冷却至室温，加入必要的
抗生素和其他物质后进行搅拌均匀。
2、细胞膜解析：将要传代的细胞用叉子放入悬浮于培养液中，再加
入过氧化氢酶以解析细胞膜，具体方法是将培养基中的细胞分散成一个单层，逐步加入过氧化氢酶直到达到细胞解析的程度。
3、细胞数量细胞的复制：将细胞数量复制到前面所预定的细胞比例，使细胞保持初始比例，为传代提供有利条件。
4、再次放置细胞：将复制完成的细胞液再次放置在新的培养基中，
细胞培养室中的空气湿度和温度都必须维持在合适的范围，使细胞繁殖进
行得顺畅。
5、监测细胞增殖：在每次传代后，一定要记录下新培养基中细胞的
数量、形态和其他特征，以便确定新培养基的质量。
细胞传代过程及注意事项
细胞传代过程及注意事项
细胞传代是一种实验室中常用的技术，通过将培养细胞从一个培养皿转移到另一个培养皿，使细胞恢复生长。
细胞传代的步骤一般如下：
1. 选择好培养基和培养皿。
培养基应当根据实验需要进行选择，一般为普通培养基或特殊培养基，培养皿应该选择防止氧化的培养皿，如玻璃、金属、塑料等。
2. 将细胞活化，并尽快用无菌操作法处理细胞。
在活化之前，需要检查培养细胞的情况，如果检测出来有病毒污染，则应立即处理，以避免病毒对后续实验造成影响。
3. 分离细胞。
将培养基中的细胞分离出来，一般使用0.25-0.05%的胰蛋白酶溶液，但也可以根据实验需要选择不同的分离液。
4. 传代细胞。
将分离的细胞添加到新的培养皿中，然后放置于37℃的培养箱中，细胞传代完成。
传代时应注意事项：
1. 细胞传代过程中，应保持操作环境无菌，以防止细胞污染。
2. 分离细胞时，应尽量减少细胞损伤，以确保细胞处于活性状态。
3. 在添加分离细胞时，应小心操作，以防止细胞受到外界冲击而死亡。
4. 传代细胞时，应检查培养皿的清洁度，确保无污染物。
细胞传代铺板冻存复苏等细胞培养相关操作步骤和注意事项
细胞传代铺板冻存复苏等细胞培养相关操作步骤和注意事项细胞传代：细胞传代是指将已经培养得到的细胞进行继代，以维持细胞的健康生长和增殖。
具体步骤如下：1.预备培养基和消化液：准备需要的培养基和细胞消化液，将培养基预暖在37摄氏度保温箱中。
2.消化细胞：将已经生长到80-90%的细胞培养皿放到细胞消化液中消化，消化时间根据细胞的种类和生长状态而定。
消化完成后，在显微镜下观察，确保细胞基本脱落。
3.细胞计数与离心：将细胞消化液转移到离心管，进行细胞计数。
根据所需细胞数量计算所需消化液的体积，并用预暖的培养基配置所需的细胞悬液。
离心细胞消化液以去除细胞消化的消化液。
4.铺板：将计算好的细胞悬液转移到铺板中，轻轻摇晃铺板使细胞均匀分布。
放置在培养箱中，培养条件根据细胞类型而定。
注意事项：-消化时间不宜过长，否则细胞会受到过度损伤。
-细胞计数时要使用显微镜和相关计数仪器，确保准确性。
-铺板时要轻轻摇晃铺板以均匀分布细胞，避免气泡产生。
冻存：冻存是将细胞保存在低温条件下，以备日后使用。
具体步骤如下：1.细胞准备：选择处于对称生长期的细胞进行冻存。
对细胞进行消化并离心，将细胞沉淀取出至干燥的离心管。
2.冻存液准备：根据细胞的特性和保存要求选择合适的冻存液，如含有二甲基亚砜（DMSO）和甘油的培养基。
将冻存液预暖。
3.冻存管装填：将已洗净的冻存管放入液氮中预冷，稍微干燥后将细胞沉淀均匀加入冻存管中。
用塑料冻存盖或冷却后的金属冻存夹紧。
4.冷冻：将装有细胞的冻存管放入-80摄氏度的深冷冰箱中，预冻24小时到48小时。
等冷冻固化后将管子迁移到液氮冷冻罐中。
注意事项：-使用合适的冻存液，避免对细胞造成过度伤害。
-在严格消毒和无菌条件下进行冻存操作。
-细胞冷冻时，必须迅速并且均匀降温，以避免冷冻诱导的细胞损伤。
复苏：复苏是指冻存的细胞被解冻、恢复生长和增殖的过程。
具体步骤如下：1.细胞解冻：将冻存的细胞管迅速取出，直接放入37摄氏度的水浴中，轻轻摇动直至融化。
细胞传代培养(消化法)
来源：亓传德的日志细胞传代培养（消化法）具体操作：一. 传代前准备：1.预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
准备离心管，吸管，紫外线30min消毒超净工作台。
2.用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
3.正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。
4.点燃酒精灯：注意火焰不能太小。
5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8分钟再次消毒。
6.取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
7.从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。
8.打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。
二.胰蛋白酶消化；1.加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，在37℃培养箱消化2min。
2. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。
3.加入培养液：更换吸管，加入新鲜的培养液。
4.吹打：用吸管将已经消化细胞吹打成细胞悬液三.离心分散细胞：1.吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。
2.平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心3-5分钟。
3.弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用吸管轻轻吹打细胞80下制成细胞悬液。
四.分装稀释细胞：1.分装：将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。
2.显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。
注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。
最后要做好标记。
五.继续培养：用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。
传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。
单层培养细胞的一般传代步骤
单层培养细胞的一般传代步骤引言：单层培养细胞是生物学实验中常用的一种方法，用于研究细胞的生理功能、病理机制以及药物筛选等。
传代是维持细胞活性的重要步骤之一。
本文将介绍单层培养细胞的一般传代步骤，帮助读者了解如何正确进行细胞的传代工作。
一、准备工作在进行细胞传代之前，需要做好以下准备工作：1. 清洗培养皿：使用含有酒精的消毒液对培养皿进行清洗，确保无菌。
2. 准备培养基：根据细胞类型的不同，选择适当的培养基，并添加适量的血清和抗生素。
3. 预热培养基：将培养基倒入培养皿中，放入恒温培养箱预热至37摄氏度。
二、收获细胞1. 培养皿检查：检查培养皿中细胞的生长情况，确保细胞达到传代的要求。
2. 倒出培养液：将培养皿中的培养液倒掉，注意避免将细胞吸出。
3. 洗涤细胞：加入足够的无菌生理盐水或PBS缓冲液，轻轻摇晃培养皿，使细胞悬浮于液体中。
4. 吸取细胞：使用吸管或移液器吸取细胞悬浮液，并转移到新的培养皿中。
三、传代细胞1. 稀释细胞：根据细胞密度和传代比例，将细胞悬浮液稀释至适当浓度。
2. 播种细胞：将稀释后的细胞悬浮液均匀地滴在预热的培养基上，确保细胞均匀分布。
3. 培养细胞：将培养皿放入恒温培养箱中，维持适宜的温度、湿度和二氧化碳浓度，细胞继续生长。
4. 观察细胞：每天观察细胞的生长情况，注意观察细胞数量、形态和健康状况。
5. 细胞分裂：当细胞达到合适的密度时，进行下一次传代，重复以上步骤。
四、细胞培养的注意事项1. 操作无菌：在进行细胞培养的每一步骤中，都要保持无菌操作，避免细胞被细菌或真菌污染。
2. 避免细胞过度生长：细胞过度生长会导致细胞凋亡或突变，因此要根据细胞类型和实验需求，合理控制细胞的传代次数。
3. 注意细胞状态：观察细胞形态和生长情况，及时发现细胞异常或污染情况，以便进行相应的处理。
4. 避免细胞冻存：细胞传代过程中，尽量避免频繁的细胞冻存，以免对细胞产生不良影响。
5. 定期更换培养基：培养基中的营养物质和生长因子会逐渐耗尽，因此要定期更换新鲜的培养基，以提供足够的营养物质。
细胞培养—传代—冻存—western blot等实验相关步骤
围绕siRNAs的相关实验详细步骤及总结实验一: 细胞传代培养材料: 15ml离心管、枪（头1ml、200ul、10ul）、无菌吸管、培养瓶、含10%FBS 的RPMI—1640(OVCAR-3)、M5A(SKOV-3)、PBS、trypsin等1、步骤: （以下均在超净台内, 酒精灯旁操作）（SKOV-3）2、打开超净台, 将离心管、枪（头）、吸管等工具置于紫外线下照射30min；含10%FBS的RPMI—1640、trypsin、PBS放在37°C水浴恒温箱中预热。
取一个生长良好的细胞培养瓶（密度适中, 细胞成梭形连接, 贴壁良好）, 弃旧培养基, PBS 2ml 清洗2次（切勿用力吹打）。
用移液枪取trypsin 1ml沿细胞生长壁对侧壁注入, 然后放平培养瓶, 使贴壁细胞与trypsin充分接触, 置于CO2培养箱2min左右（时间不能太长, 以免损伤细胞）。
4.往培养瓶中加入1640 1~2ml, 随后用移液枪将悬液移到15ml离心管中, 离心1000 r/min, 5min。
5.弃上清液, 加入少量10%FBS的1640培养基使成细胞悬液。
6、分装, 按1:2~3传代, 每瓶4~5ml。
倒置显微镜下观察（细胞突起消失变圆形, 细胞间隙等距）, 标记。
7、放入CO2培养箱中培养, 第二天观察生长状况。
总结: 1.在用离心机时, 看清楚是RCF还是RPM；调节Temp.以及Time。
2.在用移液枪吸出trypsin充分消化后的细胞后, 须知用少量培养液清洗一下培养瓶, 并将清洗液移入离心管中。
3、每取用一个容器, 拧开或者拧上盖子时, 注意在酒精灯上旋转一圈。
另外, 记住用酒精棉球经常擦拭台面。
4、在用移液枪或者吸管混匀细胞悬液过程中, 动作轻柔, 避免产生气泡等。
实验二: 细胞冻存材料: 15ml离心管、枪（头1ml、200ul、10ul）、无菌吸管、冻存管、RPMI —1640(OVCAR-3)、M5A(SKOV-3)、FBS、PBS、trypsin、DMSO等步骤: （以下均在超净台内, 酒精灯旁操作）（OVCAR-3）1.打开超净台, 将离心管、枪（头）、吸管等工具置于紫外线下照射30min；FBS、RPMI—1640、trypsin、PBS放在37°C水浴恒温箱中预热。
细胞传代培养标准操作规程
细胞传代培养（消化法）标准操作规程一、原理细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大,就必须进行传代（再培养）。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。
同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。
悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
二、材料和试剂1. 无菌磷酸生理缓冲液（PBS）2。
胰酶-EDTA溶液(0。
05%胰酶-0.53mM EDTA-4Na）: 以10ml分装于15 ml 无菌离心管中，保存于–20℃，使用前放在37℃水槽回温。
3. 新鲜培养基4。
无菌吸管/离心管/培养瓶三、操作步骤1。
传代前准备(1）预热培养用液:把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
(2）用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
（3）正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间,不仅便于操作而且可减少污染。
(4）点燃酒精灯：注意火焰不能太小。
(5)准备好将要使用的消毒后的空培养瓶.（6）取出预热好的培养用液,用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
（7）从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。
(8）打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒.2。
胰蛋白酶消化（1）加入消化液：小心吸出旧培养液,用PBS清洗（冲洗）,加入适量消化液（胰蛋白酶液)，注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。
（2）显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。
（3)吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液.3. 吹打分散细胞(1）吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。
（2)吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中.（3）平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中,以1000转/分钟离心6—8分钟。
细胞传代实验原理
细胞传代实验原理细胞传代实验是指将培养瓶或培养皿中的贴壁细胞或悬浮细胞收集下来，重新分布到新的培养容器中，继续维持细胞生长的过程。
这是组织培养和细胞培养中非常重要的基础技术，也是细胞生物学和分子生物学研究的常规操作。
原理：细胞传代的主要目的是为了防止细胞在有限的培养容器中过度拥挤，造成营养不足、代谢废物积累、细胞老化甚至死亡。
同时，传代也是维持细胞处于对数生长期（log phase）的必要步骤，这是细胞增殖最快、最适合进行实验的阶段。
步骤：1. 吸除旧培养基：将培养容器中的旧培养基吸除干净，留下附着在底部的细胞层。
2. 消化细胞：对于贴壁细胞，通常需要添加胰蛋白酶或其他细胞消化酶，使细胞从培养容器底部脱落并分离开来。
消化时间根据细胞类型和密度而异，一般几分钟到几十分钟不等。
3. 终止消化：在适当的时候，需要终止消化过程，以避免过度消化导致细胞损伤。
这通常通过添加含有血清或其他抑制剂的培养基来完成。
4. 吹打混匀：将消化后的细胞悬液轻柔吹打，使细胞分散成单个细胞。
5. 计数与稀释：使用血球计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数，并根据需要将细胞稀释到适宜浓度。
6. 接种：将稀释好的细胞悬液接种到新的培养容器中，补充新鲜的培养基。
7. 培养：将接种后的细胞放回培养箱中，继续培养。
注意事项：- 传代过程中要尽量保持无菌操作，避免细胞污染。
- 掌握好消化时间，避免细胞损伤。
- 细胞密度不能太低或太高，以保证细胞健康生长。
- 使用质量良好的培养基和血清。
细胞传代实验是维持细胞系稳定增长和进行后续实验的基础，因此需要严格控制操作条件和步骤。
细胞传代培养的原理及操作步骤
一．细胞传代培养的原理及操作步骤
（一）原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，须进行传代再培养。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。
同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。
悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
（二）细胞传代培养具体操作
1、细胞：贴壁细胞株
2、操作步骤
1）将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。
2)加入0.5-1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。
3)瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。
随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。
观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。
一般室温消化时间约为1-3分钟。
4)用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。
第二天观察贴壁生长情况。
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细胞传代标准化流程：
穿戴好白大褂和手套，用75%酒精擦手；
1、取出细胞，显微镜下观察细胞形态和密度，确定细胞生长状况，是否需要传代或换液；
2、将培养基（如有需要还有血清和大瓶高糖培养基）、PBS、胰酶培养基等预热及超净台消毒
结束后，将试剂及细胞等喷酒精后移入超净台，将废液缸喷足酒精移入超净台，取酒精棉放入超净台；
3、点燃酒精灯，将瓶口拧松，过火消毒；
4、在确定细胞生长状况良好且没有污染的情况下，将培养皿中的培养基取（大培养皿6ml，中
培养皿3ml）至一个新的15ml离心管中；（一个1ml枪头）
5、用适量PBS清洗细胞表面（大皿5ml，中皿3ml），并弃去PBS；（一个5ml枪头）
6、加入适量胰酶消化细胞（大皿1ml，中皿0.5ml），此时可将细胞置于37°C细胞培养箱内消
化；（C2C12用5min，3T3-L1用1.5min），（一个1ml枪头）
7、待消化完全后，用胰酶6倍体积的完全培养基中止消化，并吹打培养皿皿底，将细胞移入离
心管；（一个5ml枪头）
8、1000rpm，5min离心，离心间隙可以准备好传代的细胞培养皿，并加好培养基；
9、弃上清，口擦酒精，烧口；
10、加适量完全培养基吹打混匀细胞(沿壁轻轻吹打24次左右)，按合适比例进行细胞传代，
在盖上标记好细胞名称、代数及传代日期并放入孵箱。
（一个1ml枪头）
11、将所有试管收至冰箱，将废液缸及废液取出，装至一次性PE手套，废液缸喷酒精清洗
12、用酒精棉仔细擦拭操净台表面，检查显微镜、离心机是否关闭，孵箱是否正常；
13、做试验记录，打开超净台和细胞间紫外，15min后关闭。