发育生物学——发育生物学研究技术
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Gene expressing guiding development
When and where particular genes are active Intact embryos or sections of embryos
In situ hybrid: probesradioactive isotope, fluorescence tag or an enzyme
发育遗传学技术
• 反向遗传学技术：
其它手段：
1. 显性抑制 (dominant negative): 通过过量表达显性抑制 型蛋白 (是通过某种修饰或加工，可以抑制野生型蛋白功能 的缺陷型蛋白) 以阻断内源蛋白的活性，研究其功能的方法 。如将某些信号传导受体的膜内区域缺失等。
2. 基因捕获 (gene trap) 与增强子捕获 (enhancer trap):
常用报道基因分类：
• 绿色荧光蛋白 (GFP): 分布用荧光显微镜观察 • lacZ基因: 编码 β-半乳糖苷酶, 用特异底物显色研究其产物分布 • 荧光素酶 (luciferase): 常用体外基因表达活性分析，近年开始 体内研究
启动子活性检测法 表达载体的构建：Promoter/enhancers
High output screening genes expressed differently in different tissues or at different stages in development
控制发育的基因的鉴定及其表达和功能检测方法 基因组时代：人类基因组计划
后基因组时代＝功能基因组时代
Positional cloning:
1) 确定突变基因的 染色体定位 2) 获取该片断的基因 组序列：数据库 3) 生物信息学确定该 片段可能含有的基因 ，结合其可能的功能 和该突变体的表型， 确定候选基因 4) 实验验证：功能异 常，野生型rescue, RNAi
发育遗传学技术
• 反向遗传学技术：通过功能丧失 (loss of function)
胚胎细胞中，如运用细胞标记技术对胚胎早期卵 裂球分化命运图谱的研究。在小鼠和果蝇中常用 于转基因分析。
细胞标记物分类：
早期：活体染料如尼罗蓝或中性红，不能标记胚胎内部组织 现在：细胞外-亲脂性荧光染料如DiI/Dio，不适于组织切片
细胞内-荧光标记葡聚糖和HRP，需显微注射，通过荧光 显微镜或组织化学方法进行定位。
• RT-PCR/Northern blotting: mRNA expression
• Western blotting: protein expression • 免疫共沉淀 (Co-IP): protein-protein interaction
Northern Blotting Analysis
发育生物学研究技术
常用发育生物学研究技术简介
• 显微镜技术 (成像imaging); • 组织切片技术 (经典解剖形态学morphology);
• 生化分子生物学;
• 原位杂交技术 (in situ hybridization);
• 显微注射;
• 报告基因技术;
• 细胞标记技术;
显微镜技术
目的：观察胚胎个体
Dectection: autoradiography, fluorescence microscope, enzyme-substrate reaction
原位探测基因表达
原位探测基因表达
Distribution of mRNA for the growth factor Vg-1 in the amphibian egg. In situ hybridization with a radioactive probe. (yellow signals)
目的：观察胚胎的内部组织学结构
分类：
• 石蜡组织切片：石蜡包埋，切片机切片 • 冷冻切片：低温包埋剂包埋，低温切片机切片，对样 品中核酸的保存较好，但切片的质量差。
分子生物学技术
目的：检测目的基因或蛋白质在某一发育 时期或特定组织中的表达 分类：
• Polymerase chain reaction (PCR): DNA amplification • Real-time quantitative PCR: RNA 定量
是一种报道基因转基因技术，用于获得在某些组织中特异性 表达的基因。如报道基因转入体内，如附近有内源性增强子 ，就可启动报道基因的启动子激活。
插入诱变筛选
利用转座子(transposon)或病 毒载体做诱变剂。果蝇中为P-因 子，可以随即插入基因组中，并 可以在基因组中移动，包括特殊 序列和转座酶，后代生殖细胞中 ，转座酶就会诱导P-因子在基因 中随即转座造成基因突变。
突变基因的克隆
突变体获得后，克隆引起该突变的基因
• 插入突变：利用P-因子序列作为探针，从突变体文库
GFP pA
利用大分子间的相互作用克隆新的基因
利用DNA与蛋白质间的相互作用
鉴定可与蛋白质结合的DNA序列 分离靶蛋白质，（可采用gel-shift assay) 克隆靶蛋白的表达基因。
分离时空特异性表达基因的方法 利用蛋白质之间的相互作用
酵 母 双 杂 交 法
显微注射及细胞标记技术 目的：将外源DNA、RNA或标记物等导入早期
Conditional knockout
仅使靶基因在特定的组织或 发育时期失活。Cre-lox 系 统 1) Cre编码一种重组酶，可 识别并结合位点并切除位于 两个LoxP 位点之间的序列 。 2) 两个品系：靶基因两侧都 加入LoxP 位点; 转入由组 织特异性启动子控制的cre 基因
3) 小鼠杂交， cre基因会在 特异性组织中表达，切除靶 基因，使之失活。
或功能获得 (gain of function) 实验，研究胚胎个
体所产生的表型而分析目的基因的功能。
基因修饰
1. 基因敲除;
2. 条件基因敲除;
3. 转基因;
Constructing knockout mice
获得携带有特定基因 突变个体的技术，研 究基因在发育中功能 的重要方法。 1) 构建用于基因重 组的突变基因结构 2) 重组基因导入胚 胎干细胞 (ES) 3) 注射ES入胚胎中 以获得杂合性小鼠 4) 小鼠杂交获得纯 合体小鼠并进行表型 分析。
Transgenic technique
1) 将外源基因注射到受 精卵的细胞核中， 缺点 是无法控制外源基因的 插入情况， 只能通过后 代检查DNA。 2) 将外源基因转化到ES 中，同gene knockout 3) 小鼠杂交。
发育遗传学技术
• 反向遗传学技术：
通过抑制性因子抑制目的基因的功能
Southern Blotting Analysis
Real-time PCR 仪
原位杂交技术
目的：检测某一特定基因mRNA在某胚胎 和组织中的分布情况 分类：
• 放射性标记探针：放射自显影 • 非放射性标记探针： 地高辛(DIG)-免疫组化 荧光素-荧光免疫组化 (FISH)
原位探测基因表达
从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因
获得突变体的方法
自然群体中的突变体； 化学诱变剂处理，如亚硝基－乙脲－乙亚ห้องสมุดไป่ตู้基脲
(N-nitroso-N-ethylurea ethylnitrosourea, ENU)；
外源DNA插入法，如DNA注射、病毒感染、转座
子利用等；
X－射线或 r－射线照射
分类：
•
光学(optical)显微镜:
•
•
体视显微镜: 组织分离用
荧光显微镜：
显微镜技术
激光共聚焦显微镜 (laser confocal)：荧光标记，对 胚胎或细胞中的特定蛋白质或mRNA的分布进行定性 或定量研究；图像采集的效果很好；细胞或组织的三 维重塑 (reconstructing)
组织切片技术
基因类型？ 影响途径？ 底物？
影响器官？ 胞内分布及靶位？
空间结构？
发育遗传学技术
发育生物学基本任务之一：
研究基因在胚胎发育中的作用
• 正向遗传学技术：大规模随机诱变，产生发育 异常的突变个体，然后再寻找突变的基因。 1. 大规模诱变筛选; 2. 插入诱变筛选;
3. 突变基因的克隆;
从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因
DNA插入诱变法
由含 GFP 基因的反转录病毒插入引起突变
正常胚胎 突变胚胎
X 基因
GFP 基因
完整的 X 基因使胚胎正常发育
X 基因被 GFP 基因破坏后胚胎异常发育
DNA插入诱变法
反转录病毒插入引起的突变的鉴定
病毒注射 F0 WT
F1
F2
大规模诱变筛选
突变后的表型改变： • 致死性 • 功能丧失：最常见。突变后的蛋白质比野生 型活性差；某一蛋白质完全失活的突变为无效 突变 (null mutation) • 功能获得：如某些受体突变后活化
中筛选出含P-因子的克隆，从而确定其插入点及被阻断
的基因。 • 化学诱变或射线突变：定位克隆 (positional cloning)—根据目的基因在染色体上的位置进行基因分 离的。通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来 确定突变基因的染色体位置。常用的分子标记包括单核 苷酸多态性 (SNPs)。
自发突变 (spontaneous mutation)
Recessive mutation (纯合体状态) /Dominant (杂合体状态) /semidominant
自发突变 (spontaneouse mutation)
semi-dominant mutation (半显性突变)
从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因
原位探测基因表达
mRNA的检测
利用原位杂交技术研究基因表达的时空谱
FISH 探测基因表达
报道基因 (reporter gene) 技术
目的：用于启动子/增强子的分析研究。采用一些产
物易于检测的基因(报道基因)与待研究的表达调控序列 串联，通过转基因技术导入胚胎体内，分析报道基因产 物的表达来研究目的片断的转录调节活性。
1. RNA干扰;
2. 吗啉代寡聚核苷酸 (MO): 利用反义寡聚核苷
酸抑制特定mRNA (5’-UTR) 的翻译而阻断目的基
因功能的方法。主要应用在斑马鱼和爪蟾研究中，
但现在也用于miRNA研究中。
RNAi 技术
1) 双链RNA抑制含 其同源序列基因的表 达，抑制基因表达的 新方法 2) 线虫中：直接导入 dsRNA; 脊椎动物中 siRNA (21-23 nt)
化学诱变法
斑马鱼上ENU化学突变研究的成就(1996)
德国 Tubingen 美国 Harvard 初选突变体总数 保存的突变体总数 已确认的不同基因数 4264 1163 372 2383 695 220
大规模诱变筛选
通过射线或化学 诱变剂处理父本 个体，在其生殖 系细胞中产生随 机突变，然后与 wild-type母本个 体杂交，F1个体 中可能携带有基 因突变。F1与野 生型，F2 (50% 杂合突变体)群体 内杂交，F3 (25%)可出现纯 合突变个体，发 育异常
示踪基因：GFP和LacZ基因
染料细胞标记
荧光细胞标记
细胞移植
DNA/蛋白芯片
目的：高通量筛选不同胚胎细胞或组织中基因/
蛋白表达图谱，获得不同时期或组织差异表达的 基因或蛋白。
分类：
• DNA chip • Protein chip • microRNA chip
应用DNA microarrays 研究基因表达
When and where particular genes are active Intact embryos or sections of embryos
In situ hybrid: probesradioactive isotope, fluorescence tag or an enzyme
发育遗传学技术
• 反向遗传学技术：
其它手段：
1. 显性抑制 (dominant negative): 通过过量表达显性抑制 型蛋白 (是通过某种修饰或加工，可以抑制野生型蛋白功能 的缺陷型蛋白) 以阻断内源蛋白的活性，研究其功能的方法 。如将某些信号传导受体的膜内区域缺失等。
2. 基因捕获 (gene trap) 与增强子捕获 (enhancer trap):
常用报道基因分类：
• 绿色荧光蛋白 (GFP): 分布用荧光显微镜观察 • lacZ基因: 编码 β-半乳糖苷酶, 用特异底物显色研究其产物分布 • 荧光素酶 (luciferase): 常用体外基因表达活性分析，近年开始 体内研究
启动子活性检测法 表达载体的构建：Promoter/enhancers
High output screening genes expressed differently in different tissues or at different stages in development
控制发育的基因的鉴定及其表达和功能检测方法 基因组时代：人类基因组计划
后基因组时代＝功能基因组时代
Positional cloning:
1) 确定突变基因的 染色体定位 2) 获取该片断的基因 组序列：数据库 3) 生物信息学确定该 片段可能含有的基因 ，结合其可能的功能 和该突变体的表型， 确定候选基因 4) 实验验证：功能异 常，野生型rescue, RNAi
发育遗传学技术
• 反向遗传学技术：通过功能丧失 (loss of function)
胚胎细胞中，如运用细胞标记技术对胚胎早期卵 裂球分化命运图谱的研究。在小鼠和果蝇中常用 于转基因分析。
细胞标记物分类：
早期：活体染料如尼罗蓝或中性红，不能标记胚胎内部组织 现在：细胞外-亲脂性荧光染料如DiI/Dio，不适于组织切片
细胞内-荧光标记葡聚糖和HRP，需显微注射，通过荧光 显微镜或组织化学方法进行定位。
• RT-PCR/Northern blotting: mRNA expression
• Western blotting: protein expression • 免疫共沉淀 (Co-IP): protein-protein interaction
Northern Blotting Analysis
发育生物学研究技术
常用发育生物学研究技术简介
• 显微镜技术 (成像imaging); • 组织切片技术 (经典解剖形态学morphology);
• 生化分子生物学;
• 原位杂交技术 (in situ hybridization);
• 显微注射;
• 报告基因技术;
• 细胞标记技术;
显微镜技术
目的：观察胚胎个体
Dectection: autoradiography, fluorescence microscope, enzyme-substrate reaction
原位探测基因表达
原位探测基因表达
Distribution of mRNA for the growth factor Vg-1 in the amphibian egg. In situ hybridization with a radioactive probe. (yellow signals)
目的：观察胚胎的内部组织学结构
分类：
• 石蜡组织切片：石蜡包埋，切片机切片 • 冷冻切片：低温包埋剂包埋，低温切片机切片，对样 品中核酸的保存较好，但切片的质量差。
分子生物学技术
目的：检测目的基因或蛋白质在某一发育 时期或特定组织中的表达 分类：
• Polymerase chain reaction (PCR): DNA amplification • Real-time quantitative PCR: RNA 定量
是一种报道基因转基因技术，用于获得在某些组织中特异性 表达的基因。如报道基因转入体内，如附近有内源性增强子 ，就可启动报道基因的启动子激活。
插入诱变筛选
利用转座子(transposon)或病 毒载体做诱变剂。果蝇中为P-因 子，可以随即插入基因组中，并 可以在基因组中移动，包括特殊 序列和转座酶，后代生殖细胞中 ，转座酶就会诱导P-因子在基因 中随即转座造成基因突变。
突变基因的克隆
突变体获得后，克隆引起该突变的基因
• 插入突变：利用P-因子序列作为探针，从突变体文库
GFP pA
利用大分子间的相互作用克隆新的基因
利用DNA与蛋白质间的相互作用
鉴定可与蛋白质结合的DNA序列 分离靶蛋白质，（可采用gel-shift assay) 克隆靶蛋白的表达基因。
分离时空特异性表达基因的方法 利用蛋白质之间的相互作用
酵 母 双 杂 交 法
显微注射及细胞标记技术 目的：将外源DNA、RNA或标记物等导入早期
Conditional knockout
仅使靶基因在特定的组织或 发育时期失活。Cre-lox 系 统 1) Cre编码一种重组酶，可 识别并结合位点并切除位于 两个LoxP 位点之间的序列 。 2) 两个品系：靶基因两侧都 加入LoxP 位点; 转入由组 织特异性启动子控制的cre 基因
3) 小鼠杂交， cre基因会在 特异性组织中表达，切除靶 基因，使之失活。
或功能获得 (gain of function) 实验，研究胚胎个
体所产生的表型而分析目的基因的功能。
基因修饰
1. 基因敲除;
2. 条件基因敲除;
3. 转基因;
Constructing knockout mice
获得携带有特定基因 突变个体的技术，研 究基因在发育中功能 的重要方法。 1) 构建用于基因重 组的突变基因结构 2) 重组基因导入胚 胎干细胞 (ES) 3) 注射ES入胚胎中 以获得杂合性小鼠 4) 小鼠杂交获得纯 合体小鼠并进行表型 分析。
Transgenic technique
1) 将外源基因注射到受 精卵的细胞核中， 缺点 是无法控制外源基因的 插入情况， 只能通过后 代检查DNA。 2) 将外源基因转化到ES 中，同gene knockout 3) 小鼠杂交。
发育遗传学技术
• 反向遗传学技术：
通过抑制性因子抑制目的基因的功能
Southern Blotting Analysis
Real-time PCR 仪
原位杂交技术
目的：检测某一特定基因mRNA在某胚胎 和组织中的分布情况 分类：
• 放射性标记探针：放射自显影 • 非放射性标记探针： 地高辛(DIG)-免疫组化 荧光素-荧光免疫组化 (FISH)
原位探测基因表达
从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因
获得突变体的方法
自然群体中的突变体； 化学诱变剂处理，如亚硝基－乙脲－乙亚ห้องสมุดไป่ตู้基脲
(N-nitroso-N-ethylurea ethylnitrosourea, ENU)；
外源DNA插入法，如DNA注射、病毒感染、转座
子利用等；
X－射线或 r－射线照射
分类：
•
光学(optical)显微镜:
•
•
体视显微镜: 组织分离用
荧光显微镜：
显微镜技术
激光共聚焦显微镜 (laser confocal)：荧光标记，对 胚胎或细胞中的特定蛋白质或mRNA的分布进行定性 或定量研究；图像采集的效果很好；细胞或组织的三 维重塑 (reconstructing)
组织切片技术
基因类型？ 影响途径？ 底物？
影响器官？ 胞内分布及靶位？
空间结构？
发育遗传学技术
发育生物学基本任务之一：
研究基因在胚胎发育中的作用
• 正向遗传学技术：大规模随机诱变，产生发育 异常的突变个体，然后再寻找突变的基因。 1. 大规模诱变筛选; 2. 插入诱变筛选;
3. 突变基因的克隆;
从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因
DNA插入诱变法
由含 GFP 基因的反转录病毒插入引起突变
正常胚胎 突变胚胎
X 基因
GFP 基因
完整的 X 基因使胚胎正常发育
X 基因被 GFP 基因破坏后胚胎异常发育
DNA插入诱变法
反转录病毒插入引起的突变的鉴定
病毒注射 F0 WT
F1
F2
大规模诱变筛选
突变后的表型改变： • 致死性 • 功能丧失：最常见。突变后的蛋白质比野生 型活性差；某一蛋白质完全失活的突变为无效 突变 (null mutation) • 功能获得：如某些受体突变后活化
中筛选出含P-因子的克隆，从而确定其插入点及被阻断
的基因。 • 化学诱变或射线突变：定位克隆 (positional cloning)—根据目的基因在染色体上的位置进行基因分 离的。通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来 确定突变基因的染色体位置。常用的分子标记包括单核 苷酸多态性 (SNPs)。
自发突变 (spontaneous mutation)
Recessive mutation (纯合体状态) /Dominant (杂合体状态) /semidominant
自发突变 (spontaneouse mutation)
semi-dominant mutation (半显性突变)
从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因
原位探测基因表达
mRNA的检测
利用原位杂交技术研究基因表达的时空谱
FISH 探测基因表达
报道基因 (reporter gene) 技术
目的：用于启动子/增强子的分析研究。采用一些产
物易于检测的基因(报道基因)与待研究的表达调控序列 串联，通过转基因技术导入胚胎体内，分析报道基因产 物的表达来研究目的片断的转录调节活性。
1. RNA干扰;
2. 吗啉代寡聚核苷酸 (MO): 利用反义寡聚核苷
酸抑制特定mRNA (5’-UTR) 的翻译而阻断目的基
因功能的方法。主要应用在斑马鱼和爪蟾研究中，
但现在也用于miRNA研究中。
RNAi 技术
1) 双链RNA抑制含 其同源序列基因的表 达，抑制基因表达的 新方法 2) 线虫中：直接导入 dsRNA; 脊椎动物中 siRNA (21-23 nt)
化学诱变法
斑马鱼上ENU化学突变研究的成就(1996)
德国 Tubingen 美国 Harvard 初选突变体总数 保存的突变体总数 已确认的不同基因数 4264 1163 372 2383 695 220
大规模诱变筛选
通过射线或化学 诱变剂处理父本 个体，在其生殖 系细胞中产生随 机突变，然后与 wild-type母本个 体杂交，F1个体 中可能携带有基 因突变。F1与野 生型，F2 (50% 杂合突变体)群体 内杂交，F3 (25%)可出现纯 合突变个体，发 育异常
示踪基因：GFP和LacZ基因
染料细胞标记
荧光细胞标记
细胞移植
DNA/蛋白芯片
目的：高通量筛选不同胚胎细胞或组织中基因/
蛋白表达图谱，获得不同时期或组织差异表达的 基因或蛋白。
分类：
• DNA chip • Protein chip • microRNA chip
应用DNA microarrays 研究基因表达