丹参转基因毛状根离体培养体系的建立及分析_张夏楠

诱导率 /%
93. 3 43. 3 73. 3
第 37 卷第 15 期 2012 年 8 月
Vol. 37，Issue 15 August，2012
a. 叶片基部用于丹参毛状根诱导效果较好; b，c. 单独标号继代培养 的毛状根; d. 摇瓶中继代培养的毛状根在 20，30，40，50，60 d 时的生 长状态。
［关键词］ 丹参; 毛状根; 转基因; 离体培养
唇形科植物丹参 Salvia miltiorrhiza Bunge. 是治 疗心血管系统疾病的临床常用中药，主要含有 2 种 有效成分，脂溶性的二萜醌类化合物和水溶性的酚 酸类化合物，具有抗菌消炎、抗血栓形成、抗心肌缺 血、保肝及抗氧化的作用［1］，有着广阔的应用前景。 但由于丹参野生资源有限，有效成分在原植物根中 含量低、生长周期长等原因，原料药的供应在数量和 质量上都不能满足临床应用的需求［2］。
［稿件编号］ 20120330008 ［基金项目］ 国家自然科学基金项目( 81072990，30901965) ［通信作者］ * 黄璐琦，研究员，Tel: ( 010 ) 64014411-2955，E-mail: huangluqi@ 263. net
不明，制约其发展。进行代谢途径改良，建立稳定高 产的毛状根株系是药用植物次生代谢工程的一种有 效工具。如在莨菪中共转化 1，4-丁二胺-氮-甲基转 移酶基因和莨菪碱 6-β-羟化酶基因，使转基因莨菪 发根中东莨菪碱含量( 411 g·L － 1 ) 比野生型( 43 g ·L － 1 ) 提高了 9 倍，大大提高了莨菪烷类生物碱的 合成与积累［8］。项目组通过前期的转录组学研究， 积累了大量的关键酶基因，为针对丹参毛状根代谢 途径进行遗传改造，在本研究中，利用含有绿色荧光 过表达载体 pH7WG2D 的发根农杆菌 Accc10060 侵 染丹参叶片产生毛状根，成功建立起适合丹参转基 因毛状根离体生长的稳定转基因体系，为应用次生 代谢工程手段提高其有效成分含量，促进产业化发 展和应用奠定基础。 1 材料和方法 1. 1 试剂
表 3 不同共培养时间对诱导效率的影响 Table 3 Effects of different co-culture time on the transformation rate of hairy roots
共培养时间 /d 0 1 2 3 4
表 1 不同外植体对丹参毛状根诱导率的影响 Table 1 Effects of different explants on the induction rate of hairy roots
外植体
叶片( 叶片基部) 叶片( 非叶片基部) 茎段
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感染外植 体数目
30 30 30
生根外植 体数目
28 13 22
陕西商洛天士力药材基地丹参种子，经本实验 ·2257·
第 37 卷第 15 期 2012 年 8 月
Vol. 37，Issue 15 August，2012
室郝近大研究员鉴定为唇形科鼠尾草属植物丹参 S. miltiorrhiza。挑选饱满无破损的丹参种子用自来 水冲洗 30 min 后用无菌水漂洗 3 次，吸干水分用 75% 乙醇浸泡 45 s，0. 01% 升汞溶液浸泡 10 min，无 菌水 冲 洗 4 ～ 5 次，接 种 至 MS 固 体 培 养 基 上， ( 25 ± 2) ℃ 下暗培养 3 d，未染菌的种子转至光照培 养 1 周后可得到无菌幼苗，继续光照培养 15 ～ 20 d， 得到无菌植株，备用。 1. 3 农杆菌的活化扩增
选取幼嫩的丹参无菌苗，将叶片剪成 0. 5 cm × 0. 5 cm 的小块，茎段切成 0. 5 cm 长，并用刀片将叶片 和茎段表面轻轻划伤，将外植体背面向上置于 MS 固 体培养基上，每种材料接种 30 个，25 ℃ 黑暗中预培养 2 d。将同种预培养材料放入 MS 重悬液的三角瓶中， 分别浸染 0，5，10，15，20 min，考察侵染时间对诱导效 率的影响。取出外植体，用无菌滤纸吸去菌液，放入 新的 MS 固体培养基上，黑暗中共培养 0，1，2，3，4 d， 考察不同的共培养时间对诱导效率的影响。每个时 间点均取 30 个外植体。将共培养的外植体用无菌水 清洗 3 次，400 mg·L －1 Cef 水浸泡 5 min 左右，无菌 水洗 1 次，吸干水分后移入含 400 mg·L －1 Cef 和 2. 5 mg·L －1 Hyg 的 MS 固体培养基上，于黑暗中进行筛 选培养，每 7 d 更换 1 次培养基。长至 2. 0 ～ 3. 0 cm 的抗性毛状根，切下单独标号继代培养，多次继代直 至完全除菌后将阳性根转入只含有 Hyg 的 MS 固体 培养基。30 d 后统计毛状根数并计算诱导率。 1. 5 转基因毛状根的 GFP 鉴定和 PCR 鉴定
图 1 丹参毛状根诱导及生长过程 Fig. 1 Hairy roots induction and the growth process of Salvia miltiorrhiza
2. 1. 2 侵染时间的影响 外植体在农杆菌液中侵 染 10 min 可达到最佳诱导效果，诱导率 63. 3% ，随 着时间延长，诱导率逐渐下降，侵染 20 min 时仅为 13. 3% 。菌液浓度直接影响着农杆菌侵染效率，浓 度越大，侵 染 时 间 越 长，菌 液 与 外 植 体 接 触 面 积 越 大，农杆菌中的 Ri 质粒更易进入外植体内，但菌液 浓度过高也会导致农杆菌对外植体的过度伤害致 死，或后期不能完全除菌，农杆菌过度增殖抑制毛根 的产生( 表 2) 。
过表达载体质粒转化 Accc10060 菌株，PCR 及 测序验证正确的阳性克隆转接于 1 mL 新的含有 50 mg·L － 1 Rif 和 80 mg·L － 1 Spe 的 YEB 液体培养基 中，28 ℃ ，220 r·min － 1 活化过夜，以 1∶ 50 的比例转 接于 15 mL 含有相同抗生素的 YEB 液体培养基中 扩大培养，28 ℃ ，220 r·min － 1 振荡培养至 A600 0. 5 左右，将 菌 液 倒 入 无 菌 离 心 管 中，4 ℃ 4 000 r · min － 1 离心 10 min，弃上清夜，用等体积的 MS 液体 培养基重悬沉淀菌体，备用。 1. 4 毛状根诱导及选择培养
植物基因组 DNA 提取试剂盒( 天根) ，MS 培养 基，6，7-V 培养基，头孢霉素，利福平，壮观霉素，潮 霉 素，过 表 达 空 载 体 pH7WG2D ( Gateway，Invitrogen) ，ExTaq( TaKaRa) ，倒置荧光显微镜，PCR 扩增 仪，Accc10060 农杆菌菌株由中科院植物所漆小泉 课题组惠赠，二氢丹参酮 I 购自江西本草天工科技 有限责任公司。 1. 2 丹参外植体培养
第 37 卷第 15 期 2012 年 8 月
Vol. 37，Issue 15 August，2012
·资源与鉴定·
丹参转基因毛状根离体培养体系的建立及分析
张夏楠，崔光红，蒋喜红，黄璐琦*
( 中国中医科学院 中药研究所，北京 100700)
［摘要］ 目的: 建立起丹参的转基因毛状根诱导及离体培养体系。方法: 考察了不同外植体、不同农杆菌侵染时间和共 培养时间诱导丹参毛状根的效率，共培养外植体用 400 g·L － 1 Cef 水除菌 5 min，接种在 MS + 400 g·L － 1 Cef + 2. 5 g·L － 1 Hyg 的固体培养基上，完全除菌后转接入 6，7-V + 2. 5 g·L －1 Hyg 液体培养基继代培养，GFP 荧光检测阳性毛状根，PCR 检测农杆 菌特征基因 rolC，并测定不同生长时期的毛状根干重和二氢丹参酮 I 的积累。结果: 用丹参叶片基部诱导毛状根，成功率可达 到 93. 3% ; 农杆菌侵染 10 min 诱导效率最高为 63. 3% ; 共培养 2 ～ 3 d 诱导效果最好; PCR 结合 GFP 荧光检测的方法鉴定阳性 转基因材料具有较高的可信性; 丹参毛状根生物量变化与次生代谢物积累之间有着紧密联系。结论: 成功建立起丹参转基因 毛状根离体培养体系，为进一步的基因工程应用打下基础。
将含毛状根的培养皿放在倒置荧光显微镜下， 在蓝色激发光源下观察。
取丹参新鲜叶片和毛状根各 0. 1 g，用植物基因 组 DNA 提取试剂盒提取 DNA，纯化后作为 PCR 扩 增模板。根据已发表的序列设计 Ri 质粒中 rolC 基因 ·2258·
的 PCR 引物。扩增体系: DNA 50 ng，10 × 缓冲液( 含 MgCl2 ) 2. 5 μL，PF 和 PR 引物( 均为 10 μmol·L －1 ) 各 0. 5 μL，Taq 酶 0. 3 μL，dNTP( 10 mmol·L －1 ) 2 μL，加水至 25 μL。反应条件: 94 ℃ 预变性 4 min; 94 ℃ 变性 30 s，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 1 min，30 个 循环; 72 ℃ 10 min。琼脂糖凝胶电泳分离扩增后产 物进 行 染 色 分 析。以 丹 参 叶 片 DNA 为 阴 性 对 照 ( NC) ，以非转基因丹参毛状根作为阳性对照( WT) 。 1. 6 转基因毛状根生长曲线及丹参酮类物质积累
利用生物技术方法获得有用的次生代谢产物是 药用植物代谢工程的一个重要手段。由发根农杆菌 Agrobacterium rhizogenes 感 染 植 物 形 成 的 毛 状 根 系 统，生长速度快、周期短、遗传稳定，不需要外源植物 激素，合成次生代谢物质能力强，成为生产药用成分 的良好培养系统［3］，尤其对于根类药材的药用成分 积累有着广泛应用，如人参 Panax ginseng［4］、萝芙 木 Rauvolfia verticillata［5］、朝鲜当归 Angelica gigas［6］ 等。然而，毛状根中次生代谢物含量通常较低，积累 丹参有效成分特别是丹参酮类成分的能力一直无法 达到生药 水 平［7］。 一 些 研 究 中 应 用 诱 导 子 银 离 子 ( Ag + ) 、茉莉酸甲酯( MeJA) 、水杨酸( SA) 等刺激某 些次生代谢物积累，但诱导效果不稳定，且诱导机制
经过上述筛选的阳性毛状根在长至 5 cm 后，移 入含有 2. 5 mg·L － 1 Hyg 的 6，7-V 液体培养基中， 25 ℃ 110 r·min － 1 暗培养。取同一株系生长旺盛 的丹参转基因毛状根 1 g 鲜重( FW) ，无菌条件下接 种至 100 mL 三角瓶中( 50 mL 培养液 / 瓶) ，共计 15 瓶，从继代培养第 20 天开始，每隔 10 d 取出毛状根 在 37 ℃ 培养箱干燥 48 h 至恒重后测定干重( DW) ， 每次取 3 瓶，计算平均值，绘制生长曲线。
精确称取干燥至恒重的毛状根 50 mg 于 2 mL 的 EP 管中，加入两颗甲醇浸泡过夜的磁珠，球磨机 研磨 45 s，加入 1. 5 mL MeOH，25 ℃ 超声 45 min，补 足体积至 2 mL，1 万 r·min － 1 离心 1 min，取上清，过 0. 45 μm 微孔滤膜，用于 HPLC 含量测定。二氢丹 参酮 I 的含量测定方法参照梁宗锁等［9］方法。 2 结果与讨论 2. 1 不同诱导条件对诱导效率的影响 2. 1. 1 不同外植体的影响 结果表明，相同条件下， 不同外植体诱导效果不同。叶片基部诱导效率最高， 可以达到 93. 3% ，此部位叶脉较粗，传递和运输作用 较强，对于农杆菌的侵染敏感度较高。非叶片基部和 茎段也可诱导产生毛状根，但诱导效率明显不如叶片 基部，分别为 43. 3% ，73. 3% ( 表 1) 。不同外植体上 毛状根产生的时间也不同，叶片基部在暗培养 15 d 左右，可见白色毛根长出，茎段其次，一般需要 20 ～ 30 d，叶片边缘时间最长，产生的毛状根也最少( 图 1) 。