topo克隆和点突变
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TransGen Easy/Fast Mutagenesis
部分重叠 突变位点位于 两条引物上
• 优点: ♠筛选方法:DpnI限制性内切酶 • 缺点: ♠引物完全重叠,线性扩增, 扩增产物不可见,可操作性差 ♠扩增产物为线状 ♠无DMT体内消化降解模板
TransGen: Easy/Fast Mutagenesis System
• 共有部分:PCR组分、DpnI酶、DMT细胞 • Easy Mutagenesis System: 使用EasyPfu酶 • Fast Mutagenesis System: 使用FastPfu酶—— 扩增速度比Taq更快、保真性比Pfu更高,扩增 10Kb左右的质粒只需2个小时! (请参考《金品是怎样炼成的》)
• 引物设计: ♣引物不能磷酸化; ♣引物5’端第一个碱基会影响下游的连接效率; • PCR注意事项: ♣后延伸设置为72℃10~20分钟; 目的: 保证扩增片段完整,可以有效降低扩增背景; 使用Taq系列DNA聚合酶扩增时,该步骤相当于加A反应。
• 目的片段加入量[为保证良好的连接效率,推荐如下] ♣ 700bp以及更小的片段:保证20ng ♣ 700bp以上的片段:保证30~100ng ♣ 2Kbp左右的片段:保证40ng ♣ 3Kbp左右的片段:保证60ng ♠片段加入量max:4µl,浓度很低时也有一定的连接效率, 体积大于5 µl会破坏反应体系平衡; ♠片段加入量min:0.5µl,浓度很高时需要稀释, 可以补充无菌水方便操作。 • 反应温度: TOPO酶的工作温度为20℃~37℃
• 毒基因: Why~其本底表达产物对宿主生长有明显抑制 How~ 选用Top10
• 基因特殊结构: Why~ 具有高AT、高GC、反向重复序列的 基因,不容易连接 How~ 调整、摸索连接体系和条件 尝试不同的载体,不同的骨架对片 段偏好性不同
所谓连接失败实为误判! 所谓连接失败实为误判!
2.PCR鉴定重组子失败: 现象:用通用引物鉴定时,扩增产物既无 目的带又无载体自连带 How~ 预变性95℃ 10min (彻底裂解菌体、释放DNA) 最好能用通用引物鉴定
操作
载体+片段 (污染几率小)
克隆效率 特点
>85% 省时(至少节约1天) 快速、高效
TransGen TOPO Vector
• • • • • • • pEASY-T1 Cloning Vetor pEASY-T1 Simple Cloning Vetor pEASY-T3 Cloning Vetor pEASY-Blunt Cloning Vetor pEASY-Blunt Simple Cloning Vetor pEASY-E1 Expression Vetor pEASY-E2 Expression Vetor
克隆载体图谱[TA Cloning]
克隆载体图谱[Blunt Cloning]
表达载体[TA Cloning]
• 一步法载体构建 一步法载体构建——藉由 藉由TOPO技术实现 技术实现! 藉由 技术实现
TOPO克隆成功的关键
• 引物设计 • PCR条件 • 克隆反应设置(DNA加入量、反应的温 度和时间) • 克隆感受态细胞的选择 • 选用质量好的胶回收或PCR纯化试剂盒
• 筛选方法: ♣体内降解:原始质粒模板可以被能降解甲基化 质粒的大肠杆菌(DMT)降解,而去甲基化的 扩增产物(发生突变的产物)不会被降解。 ♣体外降解:DpnI识别序列5’-GmATC-3’(在 DNA序列中,一般每256bp中出现一次)。甲 基化模板可被DpnI识别、切割,而去甲基化的 扩增产物(发生突变的产物)不会被降解。
传统方法:仅利用PCR
• 反向PCR定点突变 • 重叠延伸PCR定点突变 • 大引物PCR定点突变
• 反向PCR: 特点: 必须以质粒为模板; 引物方向相反; 引物需要磷酸化。
• 重叠延伸PCR: 特点:两轮PCR
• 大引物PCR: 特点:两轮PCR
• GeneTailor,QuickChange,Easy/Fast Mutagenesis System也是基于PCR原理实 现点突变,但它们与传统方法的区别主 要在于可以对突变克隆进行初步的筛选 • 筛选原理:降解甲基化质粒模板 • 筛选依据: 来自大肠杆菌的质粒99%发生甲基化; PCR是去甲基化过程,PCR产物(发生 突变的产物)是去甲基化的产物。
Mach1-T1
OmniMAX2-T1
TL-Blue
• 选择质量好的胶回收或PCR纯化试剂盒: 试剂品质很关键 质量不好的试剂盒很可能会抑制下游连接
TOPO克隆常见问题及解决方法
• • • • 克隆数少(确认感受态细胞效率正常时) 克隆阳性率低 PCR鉴定重组子失败 菌落多为淡蓝色或FishEye(白边蓝芯)
所谓连接失败实为误判! 所谓连接失败实为误判!
3.菌落多为淡蓝色或FishEye: Why~ 插入片段没有影响LacZ基因读码框 插入片段小(小于400bp) How~ 不要丢弃平板! 进行进一步鉴定
基因Hale Waihona Puke Baidu点突变技术
• 利用PCR实现点突变的几种传统方法 • GeneTailor,QuickChange, Easy /Fast Mutagenesis System 三种市售点突变试剂盒的比较
1.克隆数少或阳性率低:
胶回收片段 产物不新鲜 DNA浓度低 反应时间
毒基因
基因特殊结构
• 上述五种情况,均需要适当延长连接反 应时间!以保证连接效率和克隆数。 (可参考上文的载体连接反应时间) • 另外每种情况也有一些特别的地方可以 改进,进一步提高克隆效果。
• PCR产物不新鲜: Why~ 3’端热力学不稳定,3’-“A”容易 脱落 直接导致TA克隆效率低 How~ PCR产物置于4℃保存1~2天内使用 不要冷冻PCR产物 PCR结束后立即使用效果最好
TOPO 克隆技术与基因定点突变技术
北京全式金生物技术有限公司 www.transgen.com.cn
背景资料
• 基因克隆是分子生物学必不可少的工具,传统 的T4 DNA Ligase方法实验周期长。 • TOPO克隆——5分钟快速克隆,是克隆技术的 革命。这个技术上的飞跃为实现“加速科研” 的理念提供了先决条件。 • 基因定点突变技术——改造基因的便利方法。 基因功能研究已经成为生命科学研究的新热点, 因此需要强有力的工具保证基因结构和功能关 系研究的进行。
TransGen:
♠引物部分重叠,指数扩增,扩增产物可见,易于操作; 扩增产物为环状; ♠两条引物上均有突变点,突变效率高; ♠DpnI体外降解筛选 + DMT体内降解筛选=双重筛选 双重筛选! 双重筛选 大大提高阳性率。
• TransGen:Easy/Fast Mutagenesis System 引物设计示意图
TOPO克隆和传统T4克隆比较
Topo克隆 无需纯化可直接用于克隆 (若无杂带和引物二聚体) 5分钟 T4 DNA Ligase克隆
PCR产物 反应时间
需要纯化,否则抑制连接 过夜(12小时) 载体+片段 +T4 DNA Ligase Buffer +T4 DNA Ligase (污染几率大) ~60% 费时
TOPO克隆——原理
TOPO克隆——过程
TOPO克隆——过程
TOPO克隆迅速、便捷
载 体 片 段
5 min
产 物
TOPO克隆——克隆策略
PCR产物 有无杂带?有无引物二聚体? 均有或有杂带 Gel Extraction Kit 均无 基因克隆、转化 无杂带,有引物二聚体 PCR Purification Kit
重叠区 延伸区
FWD 5’ 3’ 5’ REV 3’
正向引物上的突变点
反向引物上的突变点
引物设计
Invitrogen GeneTailer
部分重叠 突变位点位于 一条引物上
扩增特点
指数扩增, 指数扩增,产物可见 产物为环状
模板降解方法
DMT细胞体内降解 DMT细胞体内降解
线性扩增, 线性扩增,产物不可 DpnI酶体外降解 完全重叠 Stratagene 见 QuickChange 突变位点位于 两条引物上 产物为线状 指数扩增, 指数扩增,产物可见 产物为环状 DMT细胞体内降解 DMT细胞体内降解 DpnI酶体外降解
• 克隆胶回收片段: Why~ 紫外照射和EB对dsDNA造成损伤; (受到损伤的DNA不是连接的最佳底物) 3’-“A”容易在电泳过程中被核酸外切 酶降解,导致TA连接效率低; 试剂残留的抑制。 How~ 操作中通过细节注意避免
• 目的片段浓度很低: Why~ 无法保证有效碰撞 How~ 浓缩DNA
• 反应时间:
PCR产物 PCR纯化产物 PCR产物 / PCR纯化产物 25℃ 10min 25℃ 5min 25℃ 15min 【大片段、特殊结构】 25℃ 20min 【大片段、特殊结构】 胶回收产物/ 胶回收产物/加A产物 25℃10~15min
• 克隆感受态细胞的选择:
Top10 DH5α JM109 XL1-Blue 适用于毒基因的克隆 普遍使用 同源重组率低,提取质粒质量最好 适合非甲基化DNA的转化 (必要时可以代替DMT) 具有T1、T5噬菌体抗性, 在液体培养基中生长速度快 具有T1、T5噬菌体抗性, 可用于文库构建 适用于大质粒DNA和重组产物的转化 降低片段大小的偏爱性,可用于文库构建
Invitrogen: GeneTailor Mutagenesis System
• 优点 ♠引物部分重叠,指数扩增 ♠扩增产物可见,易于操作 ♠筛选方法:DMT体内降解 • 缺点: ♠突变点在一条引物上 ♠无DpnI限制性内切酶降解模板
Stratagene: QuickChange Mutagenesis System
TOPO克隆技术
• • • • TOPO克隆原理 TOPO克隆策略 TOPO克隆成功的关键 TOPO克隆常见问题及解决方法
TOPO克隆原理
• TOPO即Topoisomerase 拓扑异构酶 • 特点: 由316个氨基酸组成 识别5’-CCCTT-3’ 同时具有限制性内切酶和连接酶的功能 不需要能量