topo克隆和点突变
e8基因产物LRP、GSTπ、TopoⅡ表达及临床意义
．７）
６３（５２．Ｉ）…。
。；ｏ．１ａ １８１５∞（４２１如弘 ．９）…。
．）…～
材料收集我院２００７年一２００８年手术切除
的胃癌组织标本共１５６份，患者男１２１例，女３５例； 年龄２５—８１岁，平均５６．９岁。均经病理检查确诊。 按ＴＮＭ标准分期，术前未行化疗、放疗。
１．２
８７“５６。（∞６４．．４。；。．舛５０（５７．．：５；。．Ｍ “（６３．８）…。 ．２）…。
棕黄色颗粒为阳性细胞，高倍镜下计数５个视野或
ｌ
０００个细胞，阳性细胞数≥１０％为阳性，否则为阴
鬟４４（５１．２）ｏ．０２２ ５３（６２．４＿：ｏ．５１ ２１（５１．２｛ｏ．９５ ；仉５１ ；ｎ
４ｌ 仉 ９５
）２．３２８（６８．３．０５（３４ ７（０３６ ９（６４．３）
性。其中ＬＲＰ阳性颗粒分布于细胞质。ＧＳＴ一１『阳性 颗粒分布于细胞质和（或）细胞核，Ｔｏｐｏ ＩＩ阳性颗粒 分布于细胞核。 １．３统计学方法采用ＳＰＳＳ １０．０统计软件。行 ｘ２检验，Ｐ≤ｏ．０５表示差异有统计学意义。 ２结果
５８
誊镞及黏膜下层
肌层 浆膜层 淋巴结转移 有
无
１４
１１（７８．６）
５（３５．７） ６（３１．６）０．１６ ６４（５２．０）
１９ １２３
１３（６８．４）Ｏ．４２ １３（６８．４）０．７７ ７６（６１．８） ７４（６０．２）
１４５２７１１ ４５
０‘撕 ７３（㈣６５．８）蝴８０（７２．１｛ｊ ２７㈨ｏ
Ｊ
胃癌组织中多药耐药基因产物ＬＲＰ、ＧＳＴ一仃、
Ｔｏｐｏ
ＩＩ表达及临床意义
赵大华，田东，于宁。朱玉红。吕增华 （滨州医学院附属医院，山东滨州２５６６０３）
topo克隆原理
topo克隆原理
Topo克隆是一种基因克隆技术，可以用来制备大量相同的DNA 分子。
这种技术基于一种称为Topo酶的酶的作用，它可以切割DNA 双链并重新连接它们，从而产生一个环形分子。
Topo酶在DNA分子的两端或内部形成缺口，然后将DNA分子接成一个环。
然后，DNA聚合酶可以使用这个环形模板来合成新的DNA分子。
由于Topo酶可以自行关闭环形分子，所以该技术是高效的。
Topo克隆技术的具体步骤如下：首先，将目标DNA分子与Topo 酶混合，Topo酶会在DNA分子的两端或内部形成缺口，并将DNA分子接成一个环。
然后，将混合物加入到包含DNA聚合酶和四种核苷酸（A、T、C、G）的反应体系中。
DNA聚合酶使用环形模板合成新的DNA 分子。
最后，将反应产物转化到宿主细胞中，宿主细胞会复制新的DNA分子并产生大量相同的DNA分子。
Topo克隆技术可以用于制备大量目标DNA分子，包括基因、DNA 序列、调控元件等。
它是一种非常常用的基因克隆技术，被广泛应用于分子生物学、基因工程等领域。
- 1 -。
载体、点突变
•
反应温度： TOPO酶的工作温度为20℃～37℃
• 反应时间[优化指南]： [优化指南]
PCR产物 PCR纯化产物 PCR产物 / PCR纯化产物 25℃ 10min 25℃ 5min 25℃ 15min 【大片段、特殊结构】 25℃ 20min 【大片段、特殊结构】 胶回收产物/ 胶回收产物/加A产物 25℃10～15min
TransGen TOPO Vector
• • • • • • • pEASY-T1 Cloning Vetor pEASY-T1 Simple Cloning Vetor pEASY-T3 Cloning Vetor pEASY-Blunt Cloning Vetor pEASY-Blunt Simple Cloning Vetor pEASY-E1 Expression Vetor pEASY-E2 Expression Vetor
TOPO克隆成功的关键
• • • • 引物设计 PCR条件 选用质量好的胶回收或PCR纯化试剂盒 克隆反应设置（DNA加入量、反应的温 度和时间） • 克隆感受态细胞的选择
•
引物设计： ♣引物不能磷酸化。 PCR注意事项： ♣后延伸设置为72℃10～20分钟； 目的： 保证扩增片段完整，可以有效降低扩增背景； 使用Taq系列DNA聚合酶扩增时，该步骤相当于加A反应； ♠使用Taq系列DNA聚合酶扩增（如EasyTaq、rTaq等），请选用粘端克隆载体； ♠使用Pfu系列DNA聚合酶（如EasyPfu、Probest等）扩增，请选用平端克隆载体； ♠使用复合DNA聚合酶（如TransHiFi、LA等）扩增， 既可用粘端载体，也可用平端载体（一般推荐用粘端）。
TOPO克隆和传统T4克隆比较
TOPO克隆 无需纯化可直接用于克隆 （若无杂带和引物二聚体） 5分钟 室温范围内放置即可 T4 DNA Ligase克隆 PCR产物 反应时间 反应温度 需要纯化，否则抑制连接 过夜（12小时） 需要用仪器严格控温 载体+片段 +T4 DNA Ligase Buffer +T4 DNA Ligase （污染几率大） ～60% 费时
分子生物学第五章分子生物学研究法(上)
分子生物学第五章分子生物学研究法（上）——DNA、RNA及蛋白质操作技术第三节RNA操作技术第四节SNP的理论与应用第五节基因克隆技术第六节蛋白质组与蛋白质组学技术夏玉琼2013-10-10目录RNA操作技术cDNA文库的构建基因文库的筛选SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学cDNA文库的构建切割位点用四碱基特异性的限制性内切酶部分消化DNA 片段，有的仍有切割位点质粒DNA将DNA 克隆进质粒DNA细菌克隆每个细菌都带有不同片段的DNA细菌转化分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学cDNA文库的构建cDNA的长度0.5-8 kb载体：质粒载体和噬菌体类载体完整的cDNA文库包含大于5*105的独立克隆分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学目录RNA操作技术cDNA文库的构建基因文库的筛选SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学基因文库的筛选含义通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程筛选方法核酸杂交法PCR筛选法免疫筛选法分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学核酸杂交法培养基上的菌落盖上硝酸纤维素膜移去硝酸纤维素膜裂解、中和去除细菌蛋白DNA 印迹32P 标记探针杂交放射自显影图像挑出阳性克隆保存母板分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学PCR筛选法需获得基因特异性引物将整个基因文库保存在多孔培养板上用设计好的基因探针对每个孔PCR筛选，挑出阳性的孔对阳性的孔再稀释到次级多孔板中PCR筛选重复稀释重复筛选直到与目的基因对应的单个克隆分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学免疫筛选法文库铺于E.coli 形成噬菌斑转移到硝酸纤维素膜吸收λ噬菌体中表达的外源蛋白保存原板，加入一抗筛选膜上的噬菌斑印迹洗去未结合的抗体加入酶偶联的二抗加底物显色从保存板上挑出阳性噬菌斑一抗：第一抗体，识别目标蛋白二抗：抗体的抗体，能增强信号，增加该方法的灵活性分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学目录RNA操作技术SNP的理论与应用SNP概述SNP的检测技术SNP的应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学SNP概述single nucleotide polymorphism,pronounced “snips”单核苷酸多态性基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性，发生频率1%或更高例如：某些人的染色体上的某个位置为A，而另外一些人的同样位置是T，染色体DNA同一位置上的每个碱基类型叫做一个等位位点继RFLP和SSR之后的第三代遗传标记遗传标记：在遗传分析上用作标记的基因分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学第一代遗传标记：RFLPRFLP标记是发展最早的DNA标记技术。
绣球‘杜丽’AP3基因克隆与基因编辑载体构建
㊀Ｇｕｉｈａｉａ㊀Ｆｅｂ.２０２４ꎬ４４(２):２５７－２６６ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｇｕｉｈａｉａ－ｊｏｕｒｎａｌ.ｃｏｍＤＯＩ:１０.１１９３１/ｇｕｉｈａｉａ.ｇｘｚｗ２０２２０４００２李童ꎬ王月莹ꎬ赵惠恩ꎬ２０２４.绣球 杜丽 ＡＰ３基因克隆与基因编辑载体构建[Ｊ].广西植物ꎬ４４(２):２５７－２６６.ＬＩＴꎬＷＡＮＧＹＹꎬＺＨＡＯＨＥꎬ２０２４.ＡＰ３ｇｅｎｅｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｇｅｎｅ￣ｅｄｉｔｉｎｇｖｅｃｔｏｒｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＨｙｄｒａｎｇｅａｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ Ｄｏｏｌｅｙ [Ｊ].Ｇｕｉｈａｉａꎬ４４(２):２５７－２６６.绣球 杜丽 ＡＰ３基因克隆与基因编辑载体构建李㊀童ꎬ王月莹ꎬ赵惠恩∗(花卉种质创新与分子育种北京市重点实验室ꎬ林木花卉遗传育种教育部重点实验室ꎬ国家花卉工程技术研究中心ꎬ城乡生态环境北京实验室ꎬ北京林业大学园林学院ꎬ北京１０００８３)摘㊀要:绣球(Ｈｙｄｒａｎｇｅａｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ)是以花序为主要观赏部位的园林植物ꎬ多用作切花装饰和景观营造ꎬ在亚洲㊁美洲㊁欧洲广泛栽培ꎮ为探究ＡＰ３基因在绣球花萼形成过程中的功能ꎬ加快重瓣绣球新品种培育进程ꎬ该研究以绣球 杜丽 为材料ꎬ克隆其ＭＡＤＳ￣ｂｏｘＢ类基因ＨｍＡＰ３ꎬ并结合生物信息学方法预测基因功能ꎻ根据ＨｍＡＰ３序列信息ꎬ筛选出高特异性编辑靶点并构建ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９基因编辑载体ꎬ通过农杆菌转化法将载体整合到绣球基因组中ꎮ结果表明:(１)克隆到１段ＨｍＡＰ３基因的ｃＤＮＡ序列ꎬ其序列全长５４６ｂｐꎬ共编码１８１个氨基酸ꎬ测序结果表明其氨基酸序列与参考序列一致性为１００％ꎬ与拟南芥ＡｔＡＰ３相似度为５８.８％ꎮ(２)不同属植物ＡＰ３氨基酸序列差异较大ꎬ在同属不同物种中ꎬＡＰ３蛋白主要结构较为保守ꎬ仅在少数基序上存在差异ꎮ(３)在ＨｍＡＰ３中共鉴定到２个高特异性靶点ꎬ并成功构建２个单靶点ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９基因编辑载体ꎮ(４)该研究共获得５株基因组内含有Ｃａｓ９序列的抗性芽ꎬ但其靶点均未突变ꎬ在抗性芽中没有检测到Ｃａｓ９表达ꎮ该研究探讨了ＡＰ３基因在重瓣绣球育种中的价值ꎬ对绣球的ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９基因编辑技术进行了初探ꎬ为绣球优良品种繁育工作奠定了基础ꎮ关键词:绣球ꎬＭＡＤＳ￣ｂｏｘ家族ꎬＡＰ３ꎬＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９ꎬ载体构建中图分类号:Ｑ９４３㊀㊀文献标识码:Ａ㊀㊀文章编号:１０００￣３１４２(２０２４)０２￣０２５７￣１０ＡＰ３ｇｅｎｅｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｇｅｎｅ￣ｅｄｉｔｉｎｇｖｅｃｔｏｒｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＨｙｄｒａｎｇｅａｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ ＤｏｏｌｅｙＬＩＴｏｎｇꎬＷＡＮＧＹｕｅｙｉｎｇꎬＺＨＡＯＨｕｉｅｎ∗(ＢｅｉｊｉｎｇＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＯｒｎａｍｅｎｔａｌＰｌａｎｔｓＧｅｒｍｐｌａｓｍＩｎｎｏｖａｔｉｏｎ＆ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｒｅｅｄｉｎｇꎬＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＢｒｅｅｄｉｎｇｉｎＦｏｒｅｓｔＴｒｅｅｓａｎｄＯｒｎａｍｅｎｔａｌＰｌａｎｔｓｏｆＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎꎬＮａｔｉｏｎａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒｆｏｒＦｌｏｒｉｃｕｌｔｕｒｅꎬＢｅｉｊｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＵｒｂａｎａｎｄＲｕｒａｌＥｃｏｌｏｇｉｃａｌＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔꎬＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬａｎｄｓｃａｐｅＡｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅꎬＢｅｉｊｉｎｇＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＢｅｉｊｉｎｇ１０００８３ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:ＨｙｄｒａｎｇｅａｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａｉｓａｇａｒｄｅｎｐｌａｎｔｗｉｄｅｌｙｃｕｌｔｉｖａｔｅｄｉｎＡｓｉａꎬＡｍｅｒｉｃａꎬａｎｄＥｕｒｏｐｅｗｉｔｈｉｔｓｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｓｍａｉｎｏｒｎａｍｅｎｔａｌｆｅａｔｕｒｅ.Ｉｔｉｓｃｏｍｍｏｎｌｙｕｓｅｄｉｎｉｎｔｅｒｉｏｒｄｅｃｏｒａｔｉｏｎａｎｄｌａｎｄｓｃａｐｅｃｒｅａｔｉｏｎ.Ｔｏ收稿日期:２０２２－０５－２０基金项目:国家林业和草原局引进国际先进林业科学技术项目(２０１５－４－１５)ꎮ第一作者:李童(１９９７－)ꎬ硕士ꎬ主要从事花卉物种质资源创新与育种研究ꎬ(E￣mail)130****5858＠ꎮ∗通信作者:赵惠恩ꎬ博士ꎬ教授ꎬ研究方向为花卉种质资源创新与育种ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｚｈａｏｈｕｉｅｎ＠ｂｊｆｕ.ｅｄｕ.ｃｎꎮｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｒｏｌｅｏｆＡＰ３ｇｅｎｅｉｎｈｙｄｒａｎｇｅａｄｕｒｉｎｇｃａｌｙｘｆｏｒｍａｔｉｏｎꎬＨ.ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ Ｄｏｏｌｅｙ ｗａｓｕｓｅｄａｓｔｈｅｍａｔｅｒｉａｌ.ＴｈｅＭＡＤＳ￣ｂｏｘＣｌａｓｓＢｇｅｎｅＨｍＡＰ３ｗａｓｃｌｏｎｅｄꎬａｎｄｉｔｓｇｅｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎｗａｓｐｒｅｄｉｃｔｅｄｂｙｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓ.Ｔｏｅｘｐｌｏｒｅｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｑｕｉｃｋｅｒｂｒｅｅｄｉｎｇｎｅｗｖａｒｉｅｔｉｅｓꎬｈｉｇｈｌｙ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃｅｄｉｔｉｎｇｔａｒｇｅｔｓｗｅｒｅｓｃｒｅｅｎｅｄａｎｄＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９ｇｅｎｅ￣ｅｄｉｔｉｎｇｖｅｃｔｏｒｓｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ.ＴｈｅｖｅｃｔｏｒｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅＨ.ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａｇｅｎｏｍｅｂｙａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ:(１)ＴｈｅｃＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｆｕｌｌｌｅｎｇｔｈｏｆＨｍＡＰ３ｗａｓ５４６ｂｐꎬｅｎｃｏｄｉｎｇ１８１ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ.Ｉｔｓａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓ１００％ｓｉｍｉｌａｒｔｏｔｈｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄ５８.８％ｓｉｍｉｌａｒｔｏＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ.(２)ＡＰ３ｄｉｆｆｅｒｅｄｇｒｅａｔｌｙｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｇｅｎｅｒａ.ＷｉｔｈｉｎｔｈｅｓａｍｅｇｅｎｕｓꎬｔｈｅｍａｉｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＡＰ３ｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｃｏｎｓｅｒｖｅｄａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｄｏｎｌｙｉｎａｆｅｗｍｏｔｉｆｓ.(３)ＴｈｅｒｅｗｅｒｅｔｗｏｈｉｇｈｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃｔａｒｇｅｔｓｉｎＨｍＡＰ３.Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｗｏｓｉｎｇｌｅ￣ｔａｒｇｅｔＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９ｇｅｎｅ￣ｅｄｉｔｉｎｇｖｅｃｔｏｒｓｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ.(４)ＴｈｅｒｅｗｅｒｅｆｉｖｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｂｕｄｓｗｉｔｈＣａｓ９ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｎｔｈｅｉｒｇｅｎｏｍｅｓ.ＨｏｗｅｖｅｒꎬｔｈｅｉｒｔａｒｇｅｔｓｅｑｕｅｎｃｅｓｄｉｄｎｏｔｃｈａｎｇｅｄｕｅｔｏｔｈｅａｂｓｅｎｃｅｏｆＣａｓ９ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ.ＩｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆＡＰ３ｇｅｎｅｉｎｔｈｅｂｒｅｅｄｉｎｇｗｏｒｋｏｆｄｏｕｂｌｅｆｌｏｗｅｒｐｈｅｎｏｔｙｐｅｗａｓｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄꎬａｎｄａｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎｏｆＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９ｇｅｎｅ￣ｅｄｉｔｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｏｒＨｙｄｒａｎｇｅａｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａｗａｓｃｏｎｄｕｃｔｅｄ.ＴｈｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓｐｒｏｖｉｄｅａｂａｓｉｓｆｏｒｔｈｅｂｒｅｅｄｉｎｇｏｆＨ.ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ＨｙｄｒａｎｇｅａｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａꎬＭＡＤＳ￣ｂｏｘｆａｍｉｌｙꎬＡＰ３ꎬＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９ꎬｖｅｃｔｏｒｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ㊀㊀绣球(Ｈｙｄｒａｎｇｅａｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ)ꎬ虎耳草科绣球属ꎬ又名八仙花ꎬ在庭院景观中的应用历史悠久ꎬ是一种具有较高观赏价值的园林植物ꎬ作为世界流行的切花深受大众喜爱ꎮ目前绣球主要有蕾丝帽形和圆球形两类花序ꎬ其花序中的不育花具有大而艳丽的花瓣状萼片ꎬ是绣球的主要观赏组织ꎮ绣球不育花有单瓣和重瓣之分ꎬ其中单瓣类只有一轮观赏性萼片ꎬ重瓣类则具有多轮观赏性萼片ꎮ相比之下ꎬ重瓣绣球具有更高的观赏和经济价值ꎬ是绣球新品种培育的重要方向(Ｓｕｙａｍａｅｔａｌ.ꎬ２０１５)ꎮ目前ꎬ国内外的绣球育种方式以杂交育种为主ꎬ其育种效率低㊁周期长ꎬ难以适应日益增长的市场需求(Ｗｕｅｔａｌ.ꎬ２０２１)ꎬ需要探索更快捷㊁高效的育种方式ꎮＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９技术是一种新兴的基因编辑技术ꎬ能够定向改变植物的观赏性状ꎬ如改造花型和花色ꎬ延长观赏周期等ꎬ在园林植物新品种繁育工作中具有极大的发展潜力和经济价值(Ｋａｕｒｅｔａｌ.ꎬ２０２１)ꎮＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９基因编辑系统由Ｃａｓ９核酸酶和单引导ＲＮＡ(ｓｉｎｇｌｅｇｕｉｄｅＲＮＡꎬｓｇＲＮＡ)构成(Ｊｉｎｅｋｅｔａｌ.ꎬ２０１２)ꎬ二者在植物细胞内转录后形成复合体ꎬ识别植物基因组中的间区序列邻近基序(ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒａｄｊａｃｅｎｔｍｏｔｉｆꎬＰＡＭ)前端约２０ｎｔ核苷酸序列并结合ꎬＣａｓ９核酸酶切割该序列形成ＤＮＡ双链缺口(ＤＮＡｄｏｕｂｌｅ￣ｓｔｒａｎｄｂｒｅａｋｓꎬＤＳＢｓ)ꎬ引发植物自身损伤修复机制ꎬ产生随机的碱基缺失(Ｈｓｕｅｔａｌ.ꎬ２０１３)ꎮ与其他园艺作物相比ꎬＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９技术在园林植物中的应用较少ꎬ仅应用于毛白杨(Ｆａｎｅｔａｌ.ꎬ２０１５)㊁矮牵牛(Ｚｈａｎｇｅｔａｌ.ꎬ２０１６ꎻＳｕｎ＆Ｋａｏꎬ２０１８ꎻＸｕｅｔａｌ.ꎬ２０２０ꎻＹｕｅｔａｌ.ꎬ２０２１)㊁菊花(Ｋｉｓｈｉ￣Ｋａｂｏｓｈｉｅｔａｌ.ꎬ２０１７)㊁铁皮石斛(Ｋｕｉｅｔａｌ.ꎬ２０１７)㊁百合(Ｙａｎｅｔａｌ.ꎬ２０１９)㊁牵牛花(Ｓｈｉｂｕｙａｅｔａｌ.ꎬ２０１８ꎻＷａｔａｎａｂｅｅｔａｌ.ꎬ２０１８)㊁蓝猪耳(Ｎｉｓｈｉｈａｒａｅｔａｌ.ꎬ２０１８)与蝴蝶兰(Ｔｏｎｇｅｔａｌ.ꎬ２０２０ꎻＳｅｍｉａｒｔｉｅｔａｌ.ꎬ２０２０)ꎮ花器官由花瓣㊁花萼㊁雄蕊和心皮４个部分组成ꎬ其基因表达调控机制可以用ＡＢＣＤＥ模型来解释ꎮ在ＡＢＣＤＥ模型中ꎬＢ类基因主要负责与Ａ类基因共同调控花瓣的形成ꎬ以及与Ｃ类基因共同调控雄蕊的形成(Ｃｏｅｎ＆Ｍｅｙｅｒｏｗｉｔｚꎬ１９９１)ꎻ除Ａ类基因中的ＡＰ２属于ＡＰ２/ＥＲＦ家族外ꎬ该模型中的其余基因均属于ＭＡＤＳ￣ｂｏｘ基因家族(王莹等ꎬ２０２１)ꎮＭＡＤＳ￣ｂｏｘＢ类基因亚家族成员广泛存在于现存植物的基因组中ꎬ在裸子植物小孢子叶球与被子植物花瓣和雄蕊中均有表达ꎬ在植物发育过程中具有重要地位(Ａｌｂｅｒｔｅｔａｌ.ꎬ１９９８)ꎮＢ类基因包含ＡＰＥＴＡＬＡ３(ＡＰ３)和ＰＩＴＩＬＬＡＴＡ(ＰＩ)两个谱系ꎬ其中ＡＰ３谱系主要调控花瓣和花萼的形成(Ｊａｒａｍｉｌｌｏ＆Ｋｒａｍｅｒꎬ２００４)ꎮＡＰ３蛋白中含有保守的Ｋ￣ＢＯＸ结构域ꎬ该结构域能够引导ＡＰ３蛋白与ＰＩ㊁ＳＥＰ３㊁ＡＰ１蛋白形成四聚体ꎬ诱导花瓣原基形成(Ｍｅｌｚｅｒ＆Ｔｈｅｉßｅｎꎬ２００９ꎻＴｈｅｉßｅｎｅｔａｌ.ꎬ２０１６)ꎮ在观赏植物中ꎬ已经发现ＡＰ３基因沉默能够导致矮牵牛(ｖａｎｄｅｒＫｒｏｌꎬ１９９３)㊁兰花(Ｍｏｎｄｒａｇóｎ￣Ｐａｌｏｍｉｎｏ＆Ｔｈｅｉßｅｎꎬ２００９)与耧斗菜(Ｚｈａｎｇｅｔａｌ.ꎬ８５２广㊀西㊀植㊀物４４卷２０１３)等发生从花瓣向花萼的同源异型转变ꎮ因此ꎬ本研究对绣球 杜丽 的ＭＡＤＳ￣ｂｏｘＢ类基因ＨｍＡＰ３进行了克隆和生物信息学分析ꎻ同时结合组内前期绣球 杜丽 再生体系建立基础ꎬ借助ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９基因编辑系统ꎬ构建了２个ＨｍＡＰ３单靶点载体ꎬ转化获得抗性芽ꎬ拟探讨以下问题:(１)ＨｍＡＰ３氨基酸序列保守结构域特征与蛋白结构分析ꎻ(２)ＨｍＡＰ３系统进化关系及其生物学功能预测ꎻ(３)探究影响绣球ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９基因编辑工作成功率的因素ꎮ以期为绣球的性状改良和新品种繁育工作提供实践参考和技术支撑ꎮ１㊀材料与方法１.１试验材料和试剂绣球 杜丽 种植于北京植物园(１１６ʎ２８ᶄＥ㊁４０ʎ００ᶄＮ)ꎮ于４月选取翠绿㊁无病虫害的叶片作为试验材料ꎬ将叶片与叶柄一并剪下ꎬ放入干净的蒸馏水中转移至实验室ꎮ试验所用的试剂盒包括植物总ＲＮＡ提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司ꎬＤＰ４３２]ꎬｃＤＮＡ反转录试剂盒(ＴａＫａＲａꎬＲＲ０４７Ａ)ꎬＤＮＡ凝胶回收试剂盒(北京擎科生物科技股份有限公司ꎬＧＥ０１０１)ꎬＯｎｅｓｔｅｐＺＴＯＰＯ￣Ｂｌｕｎｔ/ＴＡ零背景快速克隆试剂盒(北京庄盟生物科技有限公司ꎬＺＣ２０６)ꎬＳＥ无缝克隆和组装试剂盒(北京庄盟生物科技有限公司ꎬＺＣ２３１)ꎬ限制性内切酶ＢｓａＩ[纽英伦生物技术(北京)有限公司]ꎮ１.２绣球 杜丽 ＨｍＡＰ３基因克隆依据在ＮＣＢＩ上查找到的绣球 ＢｌｕｅＳｋｙ (Ｈ.ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ ＢｌｕｅＳｋｙ )ＡＰ３基因(ＧｅｎＢａｎｋ:ＡＦ２３０７０２.１)的ＣＤＳ序列进行引物设计(表１)并合成高特异性引物ꎮ按照试剂盒说明书提取试验材料ＲＮＡꎬ并将ＲＮＡ反转录成ｃＤＮＡꎮ以ｃＤＮＡ为模板ꎬ用ＫＯＤＯｎｅ高保真ＤＮＡ聚合酶(ＴＯＹＯＢＯꎬＫＭＭ￣１０１)ꎬ以ＨｍＡＰ３￣Ｆ１/Ｒ１为引物(表１)进行ＰＣＲ扩增ꎮ扩增产物利用琼脂糖凝胶电泳进行纯化ꎬ将目的片段所处区域凝胶切割下来ꎬ按照ＤＮＡ凝胶回收试剂盒说明书回收ꎮ纯化后的ＰＣＲ产物连接Ｔ载体后转入ＤＨ５α大肠杆菌感受态涂布平板培养１２ｈꎬ选取单菌落送至测序公司(北京擎科生物科技股份有限公司)进行质粒提取和测序工作ꎬ获得ＨｍＡＰ３基因的ＣＤＳ序列ꎮ１.３绣球 杜丽 ＨｍＡＰ３基因生物信息学分析使用Ｃｅｌｌ￣ＰＬｏｃ(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｃｓｂｉｏ.ｓｊｔｕ.ｅｄｕ.ｃｎ/ｂｉｏｉｎｆ/Ｃｅｌｌ￣ＰＬｏｃ￣２/)对ＨｍＡＰ３进行亚细胞定位预测(Ｃｈｏｕ＆Ｓｈｅｎꎬ２０１０)ꎮ利用ＮＣＢＩ￣ＢＬＡＳＴ(ｈｔｔｐｓ://ｂｌａｓｔ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/Ｂｌａｓｔ.ｃｇｉ)比对ＨｍＡＰ３氨基酸序列相似性ꎬ下载比对结果中排名在前列的其他植物ＡＰ３氨基酸序列ꎬ同时下载拟南芥ＡｔＡＰ３氨基酸序列ꎬ通过ＭＥＧＡ￣Ｘ软件的邻接法(ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣ｊｏｉｎｉｎｇｍｅｔｈｏｄꎬＮＪ)构建系统进化树(Ｚｈａｎｇｅｔａｌ.ꎬ２０１９)ꎮ利用ＭＥＭＥ(ｈｔｔｐ://ｍｅｍｅ￣ｓｕｉｔｅ.ｏｒｇ/ｔｏｏｌｓ/ｍｅｍｅ/)预测ＨｍＡＰ３氨基酸序列保守基序ꎮ通过ＰｒｏｒＰａｒａｍ(ｈｔｔｐｓ://ｗｅｂ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ/ｐｒｏｔｐａｒａｍ/)分析ＨｍＡＰ３蛋白的理化性质(Ｌｉｅｔａｌ.ꎬ２０２０)ꎮ分别使用蛋白二级结构预测工具ＳＯＰＭＡ(ｈｔｔｐｓ://ｎｐｓａ￣ｐｒａｂｉ.ｉｂｃｐ.ｆｒ/ｃｇｉ￣ｂｉｎ/ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ.ｐｌ?ｐａｇｅ＝ｎｐｓａ＿ｓｏｐｍａ.ｈｔｍｌ/)和蛋白三级结构预测工具Ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ(ｈｔｔｐｓ://ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ/)对ＨｍＡＰ３氨基酸序列进行分析ꎮ１.４ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９基因编辑载体构建和转化使用ＣＲＩＳＰＲ靶点设计网站ＣＲＩＳＰＲｄｉｒｅｃｔ(ｈｔｔｐ://ｃｒｉｓｐｒ.ｄｂｃｌｓ.ｊｐ/)根据ＨｍＡＰ３基因的ＣＤＳ序列ꎬ选择ＰＡＭ位点和ＧＣ含量在４０％~６０％之间的高特异性靶点ꎮ以ｐＣＡＭＢＩＡ１３００￣ｓｇＲＮＡ/Ｃａｓ９载体质粒为模板ꎬ以ＨｍＡＰ３￣Ｆ２/Ｒ２㊁ＨｍＡＰ３￣Ｆ３/Ｒ３为引物(表１)ꎬ进行ＰＣＲ扩增获得带有黏性末端的目的片段ꎮ使用内切酶ＢｓａⅠ酶切获得ｐＣＡＭＢＩＡ１３００￣ｓｇＲＮＡ/Ｃａｓ９线性载体ꎬ用无缝克隆试剂盒(北京庄盟生物科技有限公司ꎬＺＣ２３１)连接载体和目的片段ꎬ获得重组质粒ꎮ构建好的质粒转入ＤＨ５α大肠杆菌感受态涂布平板培养１２ｈꎬ选取单菌落送至测序公司(北京擎科生物科技股份有限公司)进行质粒提取和测序工作ꎬ回收构建成功的载体质粒ꎮ将构建好的载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３００::ＨｍＡＰ３利用冻融法转入ＧＶ３１０１农杆菌感受态中ꎬ在２抗ＬＢ培养基(５０ｍｇ Ｌ￣１卡那霉素＋５０ｍｇ Ｌ￣１利福平)中２８ħ培养２ｄꎬ挑取单菌落在ＬＢ液体培养基扩繁ꎮ离心收集扩繁的农杆菌菌体ꎬ加入适量侵染液(ＭＳ＋３０ｇ Ｌ￣１蔗糖＋２００μｍｏｌ Ｌ￣１乙酰丁香酮)调至ＯＤ６００＝０.４ꎮ将绣球 杜丽 叶片剪切成１ｃｍˑ１ｃｍ的小块ꎬ在叶背划３~４刀ꎬ放入上述配制好的侵染液中９５２２期李童等:绣球 杜丽 ＡＰ３基因克隆与基因编辑载体构建浸泡侵染１０ｍｉｎꎬ转接到共培养培养基(ＭＳ＋２.０ｍｇ Ｌ￣１６￣ＢＡ＋０.１ｍｇ Ｌ￣１ＩＢＡ)上暗培养２ｄꎬ再转移到筛选培养基(ＭＳ＋２.０ｍｇ Ｌ￣１６￣ＢＡ＋０.１ｍｇ Ｌ￣１ＩＢＡ＋２ｍｇ Ｌ￣１潮霉素＋２００ｍｇ Ｌ￣１头孢霉素)中至获得抗性再生芽ꎮ１.５抗性芽检测和鉴定取抗性芽叶片ꎬ使用基因组提取试剂盒获取叶片ＤＮＡꎬ再依次使用总ＲＮＡ提取试剂盒㊁ｃＤＮＡ反转录试剂盒获取叶片ｃＤＮＡꎮ分别以叶片ＤＮＡ和ｃＤＮＡ为模板ꎬ以Ｃａｓ９￣Ｆ/Ｒ为引物扩增Ｃａｓ９序列ꎬ扩增片段长度为７６４ｂｐꎮ以叶片ＤＮＡ为模板ꎬ以ＨｍＡＰ３￣Ｆ１/Ｒ１为引物扩增抗性芽ＨｍＡＰ３序列ꎬ扩增产物送至测序公司(北京擎科生物科技股份有限公司)测序ꎮ使用ＤＮＡＭＡＮ比对测序结果与野生型序列差异ꎮ２㊀结果与分析２.１绣球 杜丽 ＡＰ３基因克隆与序列分析参考绣球 ＢｌｕｅＳｋｙ ＡＰ３基因ＣＤＳ序列ꎬ利用ＨｍＡＰ３￣Ｆ１/ＨｍＡＰ３￣Ｒ１引物(表１)ꎬ在绣球 杜丽 ｃＤＮＡ文库中克隆到了一段完全一致的核苷酸序列ꎮ克隆到的基因序列全长５４６ｂｐꎬ共编码１８１个氨基酸ꎬ利用ＮＣＢＩ分析其氨基酸序列ꎬ发现在３０~１２３ｂｐ处包含１个Ｋ￣ＢＯＸ保守结构域(图１)ꎮ该氨基酸序列Ｃ端含有ＰＩ基序和ｅｕＡＰ３基序ꎬ符合ＭＡＤＳ￣ｂｏｘ家族特征ꎬ命名为ＨｍＡＰ３ꎮ将ＨｍＡＰ３与拟南芥ＡｔＡＰ３氨基酸序列比对ꎬ其相似度为５８.８％ꎻＨｍＡＰ３与绣球 ＢｌｕｅＳｋｙ ＡＰ３的ＤＮＡ序列相似度为１００％ꎮ因此ꎬ推测该基因为绣球 杜丽 ＡＰ３基因ꎮ亚细胞定位预测结果显示ＨｍＡＰ３在细胞核中表达ꎮ２.２绣球 杜丽 ＡＰ３蛋白理化性质与结构分析以拟南芥ＭＡＤＳ￣ｂｏｘ类蛋白三级结构为模型ꎬ预测ＨｍＡＰ３蛋白三级结构ꎬ可见该结构中含有２条长α￣螺旋ꎬ螺旋间纽结为９０ʎꎻ其预测结果ＧＭＱＥ(全球模型质量估计)值为０.３２ꎬＱＭＥＡＮ得分为０.７４ʃ０.０５ꎬ模型可信度和质量较高(图２)ꎮ绣球 杜丽 的ＨｍＡＰ３蛋白分子式为Ｃ９２７Ｈ１４６２Ｎ２６８Ｏ２８７Ｓ７ꎬ分子量为２１１７７.８５Ｄꎮ该蛋白共包含１８１个氨基酸ꎬ不稳定系数为３８.７９ꎬ属稳定蛋白ꎮ蛋白带负电荷残基总数(Ａｓｐ＋Ｇｌｕ)为２８ꎬ带正电荷残基总数(Ａｒｇ＋Ｌｙｓ)为２５ꎬ理论等电点为６.１７ꎮ蛋白脂肪指数为７９.１２ꎬ亲水性(ＧＲＡＶＹ)为－０.７９１ꎬ为亲水性蛋白ꎮＨｍＡＰ３蛋白二级结构中α￣螺旋占比最高ꎬ为６４.０９％ꎻ其他结构占比由高到低依次为无规则卷曲(２２.６５％)㊁延伸链(８.８４％)㊁β￣折叠(４.４２％)(图３)ꎮ２.３绣球 杜丽 ＡＰ３蛋白系统进化与ｍｏｔｉｆ分析将ＨｍＡＰ３氨基酸序列提交到ＮＣＢＩ进行ＢＬＡＳＴ比对ꎬ在比对结果中选取下载与该序列相似度较高的其他植物ＡＰ３氨基酸序列ꎬ在ＭＥＧＡ￣Ｘ软件上用邻接法构建系统进化树(图４)ꎮ从整体上来看ꎬ绣球等蔷薇亚纲菊超目植物被聚为同一大支ꎬ说明ＡＰ３蛋白在系统进化过程中具有一定保守性ꎮ从各小分支来看ꎬ不同物种间的ＡＰ３序列存在一定差异ꎬ而同物种间的序列相似度则较高ꎮ相对而言ꎬ绣球与神秘果(Ｓｙｎｓｅｐａｌｕｍｄｕｌｃｉｆｉｃｕｍ)㊁洒金桃叶珊瑚(Ａｕｃｕｂａｊａｐｏｎｉｃａｖａｒ.ｂｏｒｅａｌｉｓ)和欧洲枸骨(Ｉｌｅｘａｑｕｉｆｏｌｉｕｍ)亲缘关系最近ꎮ在模式植物中ꎬ绣球与烟草(Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ)的亲缘关系比拟南芥(Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ)更近ꎮ因此ꎬ使用烟草基因组作为预测绣球基因编辑靶点的参考基因组更为适宜ꎮ在ＭＥＭＥ￣ｍｏｔｉｆｓｕｉｔｅ工具上对上述氨基酸序列进行分析后ꎬ获得了１５个ｍｏｔｉｆ及其在序列中的相对位置(图４)ꎮ大部分植物ＡＰ３序列包含７个ｍｏｔｉｆꎬ其中有８个ＡＰ３序列包含８个ｍｏｔｉｆꎬ１个ＡＰ３序列包含９个ｍｏｔｉｆꎮ所有ＡＰ３序列Ｃ端较为保守ꎬ均含有ｍｏｔｉｆ２㊁ｍｏｔｉｆ４㊁ｍｏｔｉｆ５㊁ｍｏｔｉｆ６和ｍｏｔｉｆ７ꎬ而Ｎ端多含ｍｏｔｉｆ３ꎮ与其他植物相比ꎬ绣球ＡＰ３序列中含有特有的ｍｏｔｉｆ１２ꎬ此外仅洒金桃叶珊瑚ＡＰ３序列中含有这一基序ꎬ说明ＨｍＡＰ３相对其他植物ＡＰ３蛋白可能会有更多功能ꎮ对同源基因来说ꎬ其序列的ｍｏｔｉｆ大体相似ꎬ然而在不同物种间仍存在一定的差异ꎬ这些差异导致了不同物种间同源基因的功能差异ꎮ２.４ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９基因编辑载体构建利用ＣＲＩＳＰＲｄｉｒｅｃｔ在ＨｍＡＰ３上共选取到２个特异性强的靶点ꎬ分别命名为ＨｍＡＰ３￣Ｔａｇｅｔ１(５ᶄ￣ＧＡＴＣＴＧＴＡＣＣＡＧＡＣＧＡＣＡＡＴ＋ＧＧＧ￣３ᶄ)和ＨｍＡＰ３￣Ｔａｇｅｔ２(５ᶄ￣ＴＧＡＡＣＧＡＡＡＧＴＡＴＣＧＡＧＴＡＣ＋ＣＧＧ￣３ᶄ)ꎬ其ＧＣ含量分别为４５％和４０％ꎬ其与ＰＡＭ位点相邻的１２ｂｐ在参考基因组(烟草)中均仅比对到１个位点ꎬ证明该靶点具有较强特异性ꎮ用引物ＨｍＡＰ３￣Ｆ２/Ｒ２㊁ＨｍＡＰ３￣Ｆ３/Ｒ３在质粒上扩增含有０６２广㊀西㊀植㊀物４４卷表１㊀本研究中所使用的引物序列Ｔａｂｌｅ１㊀Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓｕｓｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ引物名称Ｐｒｉｍｅｒｎａｍｅ序列(５ᶄң３ᶄ)Ｓｅｑｕｅｎｃｅ(５ᶄң３ᶄ)退火温度Ａｎｎｅａｌｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ(ħ)用途ＰｕｒｐｏｓｅＨｍＡＰ３￣Ｆ１ＨｍＡＰ３￣Ｒ１５ᶄ￣ＡＴＧＴＴＣＴＣＣＡＣＴＡＣＣＡＡＣＡＡＡＣＴ￣３ᶄ５ᶄ￣ＣＴＡＡＴＣＧＡＧＣＡＡＴＧＣＡＴＡＣＧＴＡＧ￣３ᶄ５６ＨｍＡＰ３全长扩增ＨｍＡＰ３ｆｕｌｌ￣ｌｅｎｇｔｈａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＨｍＡＰ３￣Ｆ２ＨｍＡＰ３￣Ｒ２５ᶄ￣ＡＣＡＧＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＡＧＴＡＧＴＧＡＴＴＧＧＡＴＣＴＧＴＡＣＣＡＧＡＣＧＡＣＡＡＴＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣ￣３ᶄ５ᶄ￣ＴＴＣＴＧＣＡＧＡＣＡＡＡＴＧＧＣＣＣＣＣＡＴＴＣＧＧＡＧＴＴＴＴＴＧＴＡＴＣＴ￣３ᶄ５８ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９载体构建￣靶点１ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９ｖｅｃｔｏｒｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ￣Ｔａｒｇｅｔ１ＨｍＡＰ３￣Ｆ３ＨｍＡＰ３￣Ｒ３５ᶄ￣ＡＣＡＧＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＡＧＴＡＧＴＧＡＴＴＧＧＴＡＣＴＣＧＡＴＡＣＴＴＴＣＧＴＴＣＡＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣ￣３ᶄ５ᶄ￣ＴＴＣＴＧＣＡＧＡＣＡＡＡＴＧＧＣＣＣＣＣＡＴＴＣＧＧＡＧＴＴＴＴＴＧＴＡＴＣＴ￣３ᶄ５８ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９载体构建￣靶点２ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９ｖｅｃｔｏｒｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ￣Ｔａｒｇｅｔ２Ｃａｓ９￣ＦＣａｓ９￣Ｒ５ᶄ￣ＣＡＡＧＴＴＣＡＴＣＡＡＧＣＣＣＡＴＣＣ￣３ᶄ５ᶄ￣ＧＴＣＣＴＣＧＴＴＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＴＣ￣３ᶄ５２抗性芽Ｃａｓ９序列检测Ｃａｓ９ｓｅｑｕｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｔｂｕｄｓ∗表示终止子ꎮ∗ｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ.图１㊀ＨｍＡＰ３的序列及其结构域分析Ｆｉｇ.１㊀ＳｅｑｕｅｎｃｅａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｄｏｍａｉｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＨｍＡＰ３黏性末端的目的片段ꎬ与线性载体连接ꎬ用大肠杆菌转化后挑取单菌落测序ꎬ测序结果表明目的片段已成功插入载体ꎬ插入片段与载体结构如图５所示ꎮ绣球对潮霉素敏感性很高ꎬ经２ｍｇ Ｌ￣１潮霉素筛选后ꎬ在侵染约２０００枚叶片后仅培育出９株抗性芽(图６:Ａ)ꎮ以抗性芽叶片ＤＮＡ为模板ꎬ１６２２期李童等:绣球 杜丽 ＡＰ３基因克隆与基因编辑载体构建图２㊀ＨｍＡＰ３蛋白三级结构Ｆｉｇ.２㊀ＴｅｒｔｉａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＨｍＡＰ３ｐｒｏｔｅｉｎ分别使用靶基因序列扩增引物ＨｍＡＰ３￣Ｆ１/ＨｍＡＰ３￣Ｒ１和Ｃａｓ９序列扩增引物Ｃａｓ９￣Ｆ/Ｃａｓ９￣Ｒ对抗性芽进行鉴定ꎮ扩增和测序结果表明ꎬ９株抗性芽叶片基因组中有５株可克隆到Ｃａｓ９序列ꎬ但其靶点序列均未发生突变(图６:Ｂ)ꎮ提取抗性芽叶片总ＲＮＡ后反转录获得ｃＤＮＡꎬ再次克隆Ｃａｓ９序列ꎬ发现所有样品均无法扩增出条带ꎮ该现象说明虽然载体序列已成功整合到载体基因组上ꎬ但是Ｃａｓ９蛋白并未成功转录和表达ꎬ因此ꎬ编辑靶点的序列没有改变ꎮ３㊀讨论与结论本研究克隆了绣球 杜丽 的ＨｍＡＰ３基因ꎬ并对其核苷酸序列与氨基酸序列进行了生物信息学分析ꎮ研究发现ＨｍＡＰ３与模式植物拟南芥(Ｙａｎｇｅｔａｌ.ꎬ２００３)及园艺作物绿竹(朱龙飞ꎬ２０１３)㊁葡萄(胡晓燕等ꎬ２０２１)㊁菠萝(郑雪文等ꎬ２０２１)在特有的Ｋ￣ＢＯＸ结构域上长度相近㊁结构相似ꎬ表明此结构域在不同物种的ＡＰ３中高度保守ꎮ理化性质分析结果表明ＨｍＡＰ３是稳定的亲水性蛋白ꎬ与郑雪文等(２０２１)的研究结果一致ꎮ在ＨｍＡＰ３蛋白三级结构模型中ꎬＫ￣ＢＯＸ形成长α￣螺旋结构ꎬ与植物ＭＡＤＳ￣ｂｏｘ家族中Ｋ￣ＢＯＸ结构域特征一致ꎬ该结构在ＡＰ３与其他蛋白结合形成四聚体的过程中发挥关键作用(Ｙａｎｇ＆Ｊａｃｋꎬ２００４)ꎮＨｍＡＰ３蛋白系统进化树表明ＡＰ３基因在植物系统进化过程中的保守性ꎬ其中绣球与金鱼草㊁烟草和番茄ＡＰ３基因聚类在同一大分支ꎬ亲缘关系较近ꎬ与Ｖｉａｅｎｅ等(２００９)研究结果相似ꎮＭａｒｔｉｎｏ等(２００６)和Ｌｉｕ等(２００４)研究发现ꎬ番茄ＳｌＡＰ３与烟草ＮｔＡＰ３基因沉默后代表现出花萼轮数增多㊁花瓣消失的性状ꎮ通过同源比对ꎬ推测绣球 杜丽 ＨｍＡＰ３基因与其同源基因ＳｌＡＰ３㊁ＮｔＡＰ３功能相似ꎬ可能负责调控绣球花器官中花萼和花瓣的形成ꎮ本研究构建了２个绣球ＨｍＡＰ３单靶点载体ꎬ并在转化获得的抗性芽基因组中检测到载体序列ꎬ但在抗性芽中未检测到Ｃａｓ９序列的表达和编辑位点序列突变ꎮ本研究与Ｒｅｎ等(２０１３)的研究结果相似ꎬ他推测基因编辑效率与启动子活性有关ꎬ当ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９基因编辑载体中的启动子从ｎｏｓ￣ｍｉｎｉ变为Ｕ６ｂ启动子时ꎬ遗传突变率可从０提高至３.２％ꎮ在观赏植物中ꎬＫｉｓｈｉ￣Ｋａｂｏｓｈｉ等(２０１９)的研究也佐证了这一观点ꎬ系统性比较了Ｕｂｉｑｕｔｉｎ㊁ＣａＭＶ３５Ｓ和ＣｍＡｃｔｉｎ２启动子的表达活性差异后ꎬ发现ＣａＭＶ３５Ｓ和Ｕｂｉｑｕｔｉｎ启动子在菊花愈伤组织中活性均低于菊花ＣｍＡｃｔｉｎ２启动子ꎮ本研究使用的Ｃａｓ９序列启动子为Ｕｂｉｑｕｔｉｎ启动子ꎬ猜想其在绣球组织中的表达活性极低ꎬ导致Ｃａｓ９序列在抗性芽中未表达ꎮ在下一步绣球基因编辑工作中ꎬ可将载体中启动子更换为绣球本源启动子ꎬ进一步探究启动子活性对基因编辑成功率的影响ꎮ本研究发现绣球对潮霉素的高敏感性也是影响ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９基因编辑效率的重要因素ꎮ本研究使用２ｍｇ Ｌ￣１潮霉素浓度对绣球抗性芽进行筛选ꎬ再生率仅为０.４５％ꎬ与苹果(贾东杰等ꎬ２０１３)等在潮霉素筛选下的再生情况相符ꎬ推测绣球野生型基因组内不含有潮霉素抗性基因ꎮ甘煌灿等(２０１８)提出可通过在再生筛选过程中逐渐增加潮霉素浓度的方法ꎬ提高抗性芽的成活率ꎮ后续的绣球抗性芽的筛选条件可通过调整不同再生阶２６２广㊀西㊀植㊀物４４卷蓝色表示α￣螺旋ꎬ紫色表示无规则卷曲ꎬ绿色表示β￣折叠ꎬ红色表示延伸链ꎮＢｌｕｅｉｎｄｉｃａｔｅｓα￣ｈｅｌｉｘꎬｐｕｒｐｌｅｉｎｄｉｃａｔｅｓｒａｎｄｏｍｃｏｉｌꎬｇｒｅｅｎｉｎｄｉｃａｔｅｓβ￣ａｎｇｌｅꎬａｎｄｒｅｄｉｎｄｉｃａｔｅｓｅｘｔｅｎｄｅｄｓｔｒａｎｄ.图３㊀ＨｍＡＰ３蛋白二级结构Ｆｉｇ.３㊀ＳｅｃｏｎｄａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＨｍＡＰ３ｐｒｏｔｅｉｎ图４㊀ＨｍＡＰ３蛋白系统进化和ｍｏｔｉｆ分析Ｆｉｇ.４㊀ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎｄｍｏｔｉｆａｎａｌｙｓｉｓｏｆＨｍＡＰ３ｐｒｏｔｅｉｎ３６２２期李童等:绣球 杜丽 ＡＰ３基因克隆与基因编辑载体构建Ａ.ｐＣＡＭＢＩＡ１３００::ＨｍＡＰ３载体结构ꎻＢ.载体中目的片段测序结果ꎮＡ.ＳｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｐＣＡＭＢＩＡ１３００::ＨｍＡＰ３ｖｅｃｔｏｒꎻＢ.Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅｔａｒｇｅｔｆｒａｇｍｅｎｔｉｎｔｈｅｖｅｃｔｏｒ.图５㊀ｐＣＡＭＢＩＡ１３００::ＨｍＡＰ３载体图谱及目的片段插入情况Ｆｉｇ.５㊀ｐＣＡＭＢＩＡ１３００::ＨｍＡＰ３ｖｅｃｔｏｒｍａｐｐｉｎｇａｎｄｔａｒｇｅｔｆｒａｇｍｅｎｔｉｎｓｅｒｔｉｏｎＡ.绣球 杜丽 抗性芽的生长状况ꎻＢ.抗性芽基因组中Ｃａｓ９序列扩增(Ｍ.ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒꎻＷＴ.野生型ꎻ１~９.绣球 杜丽 抗性芽)ꎮＡ.ＲｅｓｉｓｔａｎｔｂｕｄｓｇｒｏｗｔｈｏｆＨｙｄｒａｎｇｅａｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ Ｄｏｏｌｅｙ ꎻＢ.Ｃａｓ９ｓｅｑｕｅｎｃｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｇｅｎｏｍｅｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｔｂｕｄｓ(Ｍ.ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒꎻＷＴ.Ｗｉｌｄｔｙｐｅꎻ１－９.ＲｅｓｉｓｔａｎｔｂｕｄｓｏｆＨ.ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ Ｄｏｏｌｅｙ ).图６㊀绣球 杜丽 抗性芽检测Ｆｉｇ.６㊀ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｔｂｕｄｓｏｆＨｙｄｒａｎｇｅａｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ Ｄｏｏｌｅｙ４６２广㊀西㊀植㊀物４４卷段潮霉素浓度的方式来进一步优化ꎬ以提高基因编辑效率ꎮ本研究在绣球 杜丽 中克隆到１个ＨｍＡＰ３基因ꎬｃＤＮＡ序列全长５４６ｂｐꎬ共编码１８１个氨基酸ꎬ为稳定的亲水性蛋白ꎬ氨基酸序列结构分析证明其具有ＭＡＤＳ￣ｂｏｘＢ类基因亚家族特征ꎬ系统进化分析表明ＨｍＡＰ３与烟草㊁番茄㊁金鱼草亲缘关系较近ꎬ基序组成结构保守ꎻ以ＨｍＡＰ３为靶点ꎬ成功构建２个以Ｃａｓ９基因㊁ｓｇＲＮＡ㊁潮霉素抗性基因为骨架的ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９基因编辑载体ꎬ并将载体序列整合到绣球基因组中ꎮ上述研究结果为进一步研究ＨｍＡＰ３基因功能奠定了理论基础ꎬ为重瓣绣球基因编辑辅助育种工作提供技术支撑ꎮ参考文献:ＡＬＢＥＲＴＶＡꎬＧＵＳＴＡＦＳＳＯＮＭＨＧꎬＬＡＵＲＥＮＺＩＯＬＤꎬ１９９８.Ｏｎｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓꎬｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｇｅｎｅｔｉｃｓꎬａｎｄｔｈｅａｎｇｉｏｓｐｅｒｍｐｅｔａｌ[Ｍ]//ＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｙｓｔｅｍａｔｉｃｓｏｆｐｌａｎｔｓⅡ.Ｂｏｓｔｏｎ:Ｓｐｒｉｎｇｅｒ:３４９－３７４.ＣＨＯＵＫＣꎬＳＨＥＮＨＢꎬ２０１０.Ｃｅｌｌ￣ＰＬｏｃ２.０:ａｎｉｍｐｒｏｖｅｄｐａｃｋａｇｅｏｆｗｅｂ￣ｓｅｒｖｅｒｓｆｏｒｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｖａｒｉｏｕｓｏｒｇａｎｉｓｍｓ[Ｊ].ＮａｔＳｃｉꎬ２(１０):１０９０.ＣＯＥＮＥＳꎬＭＥＹＥＲＯＷＩＴＺＥＭꎬ１９９１.Ｔｈｅｗａｒｏｆｔｈｅｗｈｏｒｌｓ:ｇｅｎｅｔｉｃｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇｆｌｏｗｅｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ[Ｊ].Ｎａｔｕｒｅꎬ３５３(６３３９):３１－３７.ＦＡＮＤꎬＬＩＵＴＴꎬＬＩＣＦꎬｅｔａｌ.ꎬ２０１５.ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９￣ｍｅｄｉａｔｅｄｔａｒｇｅｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｉｎＰｏｐｕｌｕｓｉｎｔｈｅｆｉｒｓｔｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ[Ｊ].ＳｃｉＲｅｐꎬ５(１):１－７.ＧＡＮＨＣꎬＬＡＩＣＣꎬＰＡＮＨꎬｅｔａｌ.ꎬ２０１８.Ｐｌａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｊａｓｍｉｎｅ[Ｊａｓｍｉｎｕｍｓａｍｂａｃ(Ｌｉｎｎ.)Ａｉｔｏｎ]ｃａｌｌｕｓｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＤＦＲｇｅｎｅｆｒｏｍｓｐｉｎｅｇｒａｐｅ(ＶｉｔｉｓｄａｖｉｄｉｉＦｏëｘ.)[Ｊ].ＣｈｉｎＪＴｒｏｐＣｒｏｐꎬ３９(６):１１２８－１１３６.[甘煌灿ꎬ赖呈纯ꎬ潘红ꎬ等ꎬ２０１８.刺葡萄ＤＦＲ基因植物表达载体构建及转化茉莉花愈伤组织的研究[Ｊ].热带作物学报ꎬ３９(６):１１２８－１１３６.]ＨＳＵＰＤꎬＳＣＯＴＴＤＡꎬＷＥＩＮＳＴＥＩＮＪＡꎬｅｔａｌ.ꎬ２０１３.ＤＮＡｔａｒｇｅｔｉｎｇｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｏｆＲＮＡ￣ｇｕｉｄｅｄＣａｓ９ｎｕｃｌｅａｓｅｓ[Ｊ].ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌꎬ３１(９):８２７－８３２.ＨＵＸＹꎬＧＵＯＣＬꎬＷＡＮＧＬꎬｅｔａｌ.ꎬ２０２１.ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＶｖＭＡＤＳ４６ｉｎｒｅｄｇｌｏｂｅａｎｄｔｈｏｍｐｓｏｎｓｅｅｄｌｅｓｓｆｏｒｓｅｅｄｌｅｓｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ[Ｊ].ＪＦｒｕｉｔＳｃｉꎬ３８(８):１２３１－１２３９.[胡晓燕ꎬ郭春磊ꎬ王莉ꎬ等ꎬ２０２１.无核白及红地球葡萄ＶｖＭＡＤＳ４６基因的克隆及其无核调控功能分析[Ｊ].果树学报ꎬ３８(８):１２３１－１２３９.]ＪＡＲＡＭＩＬＬＯＭＡꎬＫＲＡＭＥＲＥＭꎬ２００４.ＡＰＥＴＡＬＡ３ａｎｄＰＩＳＴＩＬＬＡＴＡｈｏｍｏｌｏｇｓｅｘｈｉｂｉｔｎｏｖｅｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｓｉｎｔｈｅｕｎｉｑｕｅｐｅｒｉａｎｔｈｏｆＡｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉａ(Ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉａｃｅａｅ) 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ＡＰ３基因克隆与基因编辑载体构建２０１８.ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９ｓｙｓｔｅｍｆｏｒｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｆｌｏｗｅｒｃｏｌｏｒｉｎＴｏｒｅｎｉａｆｏｕｒｎｉｅｒｉ[Ｊ].ＢｍｃＰｌａｎｔＢｉｏｌꎬ１８(１):１－９.ＲＥＮＸＪꎬＳＵＮＪꎬＨＯＵＳＤＥＮＢＥꎬｅｔａｌ.ꎬ２０１３.ＯｐｔｉｍｉｚｅｄｇｅｎｅｅｄｉｔｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｏｒＤｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒｕｓｉｎｇｇｅｒｍｌｉｎｅ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃＣａｓ９[Ｊ].ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡꎬ１１０(４７):１９０１２－１９０１７.ＳＥＭＩＡＲＴＩＥꎬＮＯＰＩＴＡＳＡＲＩＳꎬＳＥＴＩＡＷＡＴＩＹꎬｅｔａｌ.ꎬ２０２０.ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９ｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇｓｙｓｔｅｍｆｏｒｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｒｅｅｄｉｎｇｏｆｏｒｃｈｉｄｓ[Ｊ].ＩｎｄｏｎｅｓＪＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌꎬ２５(１):６１－６８.ＳＨＩＢＵＹＡＫꎬＷＡＴＡＮＡＢＥＫꎬＯＮＯＭꎬ２０１８.ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９￣ｍｅｄｉａｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｏｆｔｈｅＥＰＨＥＭＥＲＡＬ１ｌｏｃｕｓｔｈａｔｒｅｇｕｌａｔｅｓｐｅｔａｌｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅｉｎＪａｐａｎｅｓｅｍｏｒｎｉｎｇｇｌｏｒｙ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌＢｉｏｃｈｅｍꎬ１３１(３６):５３－５７.ＳＵＮＬＨꎬＫＡＯＴＨꎬ２０１８.ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９￣ｍｅｄｉａｔｅｄｋｎｏｃｋｏｕｔｏｆＰｉＳＳＫ１ｒｅｖｅａｌｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｒｏｌｅｏｆＳ￣ｌｏｃｕｓＦ￣ｂｏｘｐｒｏｔｅｉｎ￣ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇＳＣＦｃｏｍｐｌｅｘｅｓｉｎｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｏｆｎｏｎ￣ｓｅｌｆＳＲＮａｓｅｓｄｕｒｉｎｇｃｒｏｓｓ￣ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅｐｏｌｌｉｎａｔｉｏｎｉｎｓｅｌｆ￣ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｌｅＰｅｔｕｎｉａｉｎｆｌａｔａ[Ｊ].ＰｌａｎｔＲｅｐｒｏｄꎬ３１(２):１２９－１４３.ＳＵＹＡＭＡＴꎬＴＡＮＩＧＡＷＡＴꎬＹＡＭＡＤＡＡꎬｅｔａｌ.ꎬ２０１５.Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅｏｆｔｈｅｄｏｕｂｌｅ￣ｆｌｏｗｅｒｅｄｔｒａｉｔｉｎｄｅｃｏｒａｔｉｖｅｈｙｄｒａｎｇｅａｆｌｏｗｅｒｓ[Ｊ].ＨｏｒｔｉｃＪꎬ８４(３):２５３－２６０.ＴＨＥＩßＥＮＧꎬＭＥＬＺＥＲＲꎬＲÜＭＰＬＥＲＦꎬ２０１６.ＭＡＤＳ￣ｄｏｍａｉｎｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓａｎｄｔｈｅｆｌｏｒａｌｑｕａｒｔｅｔｍｏｄｅｌｏｆｆｌｏｗｅｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ:ｌｉｎｋｉｎｇｐｌａｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎ[Ｊ].Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔꎬ１４３(１８):３２５９－３２７１.ＴＯＮＧＣＧꎬＷＵＦＨꎬＹＵＡＮＹＨꎬｅｔａｌ.ꎬ２０２０.Ｈｉｇｈ￣ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ￣ｂａｓｅｄｅｄｉｔｉｎｇｏｆＰｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓｏｒｃｈｉｄＭＡＤＳｇｅｎｅｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＪꎬ１８(４):８８９－８９１.ＶＡＮＤＥＲＫＲＯＬꎬＢＲＵＮＥＬＬＥＡꎬＴＳＵＣＨＩＭＯＴＳꎬｅｔａｌ.ꎬ１９９３.ＦｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｅｔｕｎｉａｆｌｏｒａｌｈｏｍｅｏｔｉｃＭＡＤＳｂｏｘｇｅｎｅｐＭＡＤＳ１[Ｊ].ＧｅｎｅＤｅｖꎬ７(７ａ):１２１４－１２２８.ＶＩＡＥＮＥＴꎬＶＥＫＥＭＡＮＳＤꎬＩＲＩＳＨＶＦꎬｅｔａｌ.ꎬ２００９.Ｐｉｓｔｉｌｌａｔａ ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎｓａｓａｍｏｄｅｆｏｒｆｌｏｒａｌｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎ(Ｂａｓａｌ)ａｓｔｅｒｉｄｓ[Ｊ].ＭｏｌＢｉｏｌＥｖｏｌꎬ２６(１１):２６２７－２６４５.ＷＡＮＧＹꎬＭＵＹＸꎬＷＡＮＧＪꎬ２０２１.ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｐｌａｎｔｆｌｏｒａｌｏｒｇａｎｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｂｙｔｈｅＭＡＤＳ￣ｂｏｘｇｅｎｅｆａｍｉｌｙ[Ｊ].ＡｃｔａＡｇｒｉｃＺｈｅｊｉａｎｇꎬ３３(６):１１４９－１１５８.[王莹ꎬ穆艳霞ꎬ王锦ꎬ２０２１.ＭＡＤＳ￣ｂｏｘ基因家族调控植物花器官发育研究进展[Ｊ].浙江农业学报ꎬ３３(６):１１４９－１１５８.]ＷＡＴＡＮＡＢＥＫꎬＯＤＡ￣ＹＡＭＡＭＩＺＯＣꎬＳＡＧＥ￣ＯＮＯＫꎬｅｔａｌ.ꎬ２０１８.ＡｌｔｅｒａｔｉｏｎｏｆｆｌｏｗｅｒｃｏｌｏｕｒｉｎＩｐｏｍｏｅａｎｉｌｔｈｒｏｕｇｈＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９￣ｍｅｄｉａｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｏｆｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｃｌｅａｖａｇｅｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ４[Ｊ].ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＲｅｓꎬ２７(１):２５－３８.ＷＵＸＢꎬＨＵＬＳＥ￣ＫＥＭＰＡＭꎬＷＡＤＬＰＡꎬｅｔａｌ.ꎬ２０２１.Ｇｅｎｏｍｉｃｒｅｓｏｕｒｃｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｆｏｒｈｙｄｒａｎｇｅａ[Ｈｙｄｒａｎｇｅａｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ(Ｔｈｕｎｂ.)Ｓｅｒ.] Ａｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅａｓｓｅｍｂｌｙａｎｄａｈｉｇｈ￣ｄｅｎｓｉｔｙｇｅｎｅｔｉｃｌｉｎｋａｇｅｍａｐ[Ｊ].Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅꎬ７(２５):１－１３.ＸＵＪＰꎬＫＡＮＧＢＣꎬＮＡＩＮＧＡＨꎬｅｔａｌ.ꎬ２０２０.ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９￣ｍｅｄｉａｔｅｄｅｄｉｔｉｎｇｏｆ１￣ａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅ￣１￣ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｏｘｉｄａｓｅ１ｅｎｈａｎｃｅｓＰｅｔｕｎｉａｆｌｏｗｅｒｌｏｎｇｅｖｉｔｙ[Ｊ].ＰｌａｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＪꎬ１８(１):２８７－２９７.ＹＡＮＲꎬＷＡＮＧＺＰꎬＲＥＮＹＭꎬｅｔａｌ.ꎬ２０１９.ＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｅｆｆｉｃｉｅｎｔｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｓａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９ｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎＬｉｌｉｕｍｐｕｍｉｌｕｍＤＣ.Ｆｉｓｃｈ.ａｎｄＬｉｌｉｕｍｌｏｎｇｉｆｌｏｒｕｍＷｈｉｔｅＨｅａｖｅｎ[Ｊ].ＩｎｔＪＭｏｌＳｃｉꎬ２０(１２):２９２０ＹＡＮＧＹＺꎬＦＡＮＮＩＮＧＬꎬＪＡＣＫＴꎬ２００３.ＴｈｅＫｄｏｍａｉｎｍｅｄｉａｔｅｓｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｆｌｏｒａｌｏｒｇａｎｉｄｅｎｔｉｔｙｐｒｏｔｅｉｎｓꎬＡＰＥＴＡＬＡ３ａｎｄＰＩＳＴＩＬＬＡＴＡ[Ｊ].ＰｌａｎｔＪꎬ３３(１):４７－５９.ＹＡＮＧＹＺꎬＪＡＣＫＴꎬ２００４.ＤｅｆｉｎｉｎｇｓｕｂｄｏｍａｉｎｓｏｆｔｈｅＫｄｏｍａｉｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｆｏｒｐｒｏｔｅｉｎ￣ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｏｆｐｌａｎｔＭＡＤＳｐｒｏｔｅｉｎｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔｌＢｉｏｌꎬ５５(１):４５－５９.ＹＵＪꎬＴＵＬＨꎬＳＵＢＢＵＲＡＪＳꎬｅｔａｌ.ꎬ２０２１.ＳｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｔａｒｇｅｔｉｎｇｏｆｄｕｐｌｉｃａｔｅｄｇｅｎｅｓｉｎＰｅｔｕｎｉａｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓｆｏｒｆｌｏｗｅｒｃｏｌｏｒｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｖｉａＣＲＩＳＰＲ￣Ｃａｓ９ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐꎬ４０(６):１０３７－１０４５.ＺＨＡＮＧＢꎬＹＡＮＧＸꎬＹＡＮＧＣＰꎬｅｔａｌ.ꎬ２０１６.ＥｘｐｌｏｉｔｉｎｇｔｈｅＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９ｓｙｓｔｅｍｆｏｒｔａｒｇｅｔｅｄｇｅｎｏｍｅｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｉｎＰｅｔｕｎｉａ[Ｊ].ＳｃｉＲｅｐꎬ６(１):１－８.ＺＨＡＮＧＪＪꎬＹＡＮＧＥＤꎬＨＥＱꎬｅｔａｌ.ꎬ２０１９.Ｇｅｎｏｍｅ￣ｗｉｄｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅＷＲＫＹｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｉｎｄｒｕｍｓｔｉｃｋ(ＭｏｒｉｎｇａｏｌｅｉｆｅｒａＬａｍ.)[Ｊ].ＰｅｅｒＪꎬ７(７０９３):１－２０.ＺＨＡＮＧＲꎬＧＵＯＣＣꎬＺＨＡＮＧＷＥꎬｅｔａｌ.ꎬ２０１３.ＤｉｓｒｕｐｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐｅｔａｌｉｄｅｎｔｉｔｙｇｅｎｅＡＰＥＴＡＬＡ３￣３ｉｓｈｉｇｈｌｙｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｌｏｓｓｏｆｐｅｔａｌｓｗｉｔｈｉｎｔｈｅｂｕｔｔｅｒｃｕｐｆａｍｉｌｙ(Ｒａｎｕｎｃｕｌａｃｅａｅ) [Ｊ].ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉꎬ１１０(１３):５０７４－５０７９.ＺＨＥＮＧＸＷꎬＯＵＹＡＮＧＹＷꎬＰＡＮＸＬꎬｅｔａｌ.ꎬ２０２２.ＡｎａｌｙｓｉｓｏｎｃｌｏｎｉｎｇｏｆＡｃＭＡＤＳ１４ｇｅｎｅａｎｄｉｔｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｄｕｒｉｎｇｆｌｏｗｅｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｐｉｎｅａｐｐｌｅ[Ｊ].ＧｕａｎｇｄｏｎｇＡｇｒｉｃＳｃｉꎬ４９(１):４２－５０.[郑雪文ꎬ欧阳嫣惟ꎬ潘晓璐ꎬ等ꎬ２０２２.菠萝ＡｃＭＡＤＳ１４基因的克隆及其在花发育中的表达分析[Ｊ].广东农业科学ꎬ４９(１):４２－５０.]ＺＨＵＬＦꎬ２０１３.ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｆｕｎｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＢｃｌａｓｓｇｅｎｅｓｉｎＢａｍｂｕｓａｏｌｄｈａｍｉｉ[Ｄ].Ｈａｎｇｚｈｏｕ:ＺｈｅｊｉａｎｇＡ＆ＦＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ.[朱龙飞ꎬ２０１３.绿竹Ｂ类基因克隆与功能初步分析[Ｄ].杭州:浙江农林大学.](责任编辑㊀周翠鸣)６６２广㊀西㊀植㊀物４４卷。
生物工程知识：快速克隆技术——加速DNA序列分析和基因克隆
生物工程知识：快速克隆技术——加速DNA序列分析和基因克隆快速克隆技术——加速DNA序列分析和基因克隆随着生物技术的不断发展，分子生物学技术成为现代生命科学研究中的重要工具之一，通过对生物分子的研究，人们可以深入了解生命体的组成和运作方式，为解决人类和社会面临的诸多问题提供依据和解决途径。
其中，DNA序列分析和基因克隆是现代生命科学研究中最为基础和重要的研究方法之一。
而为了加速DNA序列分析和基因克隆，快速克隆技术应运而生。
快速克隆技术是一类利用高效的DNA重组技术将外源DNA序列导入宿主细胞，并产生可重现、高效、无需寻找突变位点的定向克隆方法。
它不仅缩短了基因克隆的时间，而且方便了对DNA序列的修饰。
快速克隆技术的主要优势在于，可以直接对目标DNA序列进行点突变、插入、删减等修饰，从而实现对基因功能的探究，为分子生物学研究提供有力手段。
快速克隆技术主要包括克隆扩增和重组克隆两种方法。
克隆扩增是一种在PCR反应中同时进行克隆扩增和定向作用的技术，通过使用末端限制性核酸内切酶和pCR®4-TOPO®克隆载体，可以实现PCR产物的快速克隆扩增。
重组克隆则利用了DNA重组酶的高效作用，在宿主细胞内完成DNA重组反应，将目标DNA序列在不损失信息的情况下导入到载体中，从而实现快速、准确、方便的基因克隆。
在快速克隆技术的应用中，需要注意一些技术要点。
首先，对于目标DNA序列的选择需要仔细考虑，得到的DNA序列必须保持完整性，并且没有任何突变；其次，在重组克隆中，DNA重组反应必须充分进行，可以通过调节DNA浓度、DNA重组酶的用量和反应时间等因素来达到最佳反应效果；此外，对于载体的选择也非常重要，通常会选择T/A克隆载体，如pCR®4-TOPO®克隆载体，在克隆扩增反应中具有很好的适用性，而在重组克隆中，较常用的载体有pET-28a，pGEX等。
使用快速克隆技术进行基因克隆，需要进行单克隆鉴定。
家蚕基因定位克隆
突变在U位点在家蚕产生是因为机翼光盘蜕皮激素的压抑响应无翅蛹和蛾。
隐性等位基因发生自发并映射在家蚕遗传连锁群1013.0。
通过定位克隆，我们该负责基因是边缘（FNG）编码FNG糖基转移酶，它参与调节Notch信号通路。
在四个不同的等位基因，我们发现了大量缺失FNG基因k和无义突变中，邻，和n。
在野生型（WT）蚕，FNG积极表现在翼片，脑和生殖器官从第四到NAL龄，但几乎没有在测试的其他组织。
原位杂交结果显示，FNG mRNA在野生翼盘的背层。
在无翅（WG）的mRNA，FNG-介导的Notch信号通路的下游标记，被定位于在WT翼盘背腹边界，但在边路盘明显压抑。
虽然果蝇FNG 的无效突变导致胚后的杀伤力，在家蚕FNG功能丧失只影响翼形态发生，组织分化表明昆虫之间的FNG不同的重要作用.翼的形成是一个重要的形态学变化翅膀的翼成虫盘，以回应昆虫保幼激素，蜕皮激素和。
果蝇的翼盘是一个良好的研究模型系统识别-ING参与模式的形成众多基因和形态理解过程的基因调控。
然而，无论是在果蝇中发现的机制实际上是应用竹叶提取其它昆虫物种还有待。
此外，虽然许多研究显示蜕皮激素对体外培养的翼盘发展的影响，鲜为人知的是，激素介导翼和变态过程中组织分化的分子机制。
翼的突变体中的原因是到涉及''基因的功能丧失。
显然，我们在K翼光盘表达异常的基因，发现膜联蛋白B13（Anxb13）的表达完全。
通过比较野生型和通过使用Anxb13的cDNA 作探针进行杂交ķ的基因组结构，我们发现，在整个基因是从第k基因组丢失。
此外，我们已经发现，Anxb13位于染色体（LG10），其包含的轨迹上。
这些表明，该基因可能位于附近Anxb13。
我们承诺通过定位克隆，以确定该基因，开始在Anxb13基因，细菌染色体（BAC）文库筛选和鸟枪法测序的基础上。
首先，我们比较了在k个突变体与野生型的周围区域的结构。
我们检测到一个大的染色体缺失以k，其中包括Anxb13和其他4个基因。
定点突变技巧：从单点突变到多点突变[指南]
![定点突变技巧：从单点突变到多点突变[指南]](https://img.taocdn.com/s3/m/a0bdc26f1611cc7931b765ce0508763231127490.png)
定点突变技术：从单点突变到多点突变体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是我们在实验室中改造/优化基因常用的手段。
蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关系是蛋白质组研究的重点之一。
对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质…体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是我们在实验室中改造/优化基因常用的手段。
蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关系是蛋白质组研究的重点之一。
对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于我们了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质的结构/结构域。
而利用定点突变技术改造基因，相信大家也非常熟悉：比如野生型的绿色荧光蛋白（wtGFP）是在紫外光激发下能够发出微弱的绿色荧光，经过对其发光结构域的特定氨基酸定点改造，现在的GFP能在可见光的波长范围被激发（吸收区红移），而且发光强度比原来强上百倍，甚至还出现了黄色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白等等。
定点突变技术的潜在应用领域很广，比如研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改造启动子或者DNA作用元件，提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面。
对于单点突变，Stratagene公司的QuikChange Site-directed Mutagenesis kit是不错的选择，通过巧妙设计，将质粒定点突变技术变得简单有效。
准备突变的质粒必须是从常规E.coli中经纯化试剂盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提的质粒。
设计一对包含突变位点的引物（正、反向），和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热褪火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。
TOPO克隆
Powerful PCR Cloning ToolsTopo TA克隆方法（Topo TA Cloning Kit）Topo TA克隆原理与TA克隆一样，唯一不同的是TA克隆用的是T4连接酶把PCR片断连接到T 载体上，而Topo TA Cloning用的是DNA Topoisomerase。
Topoisomerase的用途一般使用在复制DNA前把超螺旋DNA切割使之解旋后，再连接成线性DNA。
Topo TA克隆即使用Topoisomerase高效连接的特性把含3`A端的PCR扩增片断快速连接到3`T 端载体上，整个反应只需五分钟！一般T4连接酶需过夜才能高效连接。
Topo TA克隆系统提供Topoisomerase I载体，感受态细胞，SOC培养基等。
Topo平端克隆方法和长PCR片断克隆法（Zero Blunt Topo PCR Cloning Kit）（Topo XL PCR Cloning Kit）因为越来越多高确限度热稳定酶如Pfx、Pfu被用于PCR扩增，使到PCR后都只是平端产物。
这种平端克隆往往效率低，并且有非特异性背景菌落产生，造成筛选困难。
Topo平端克隆主要改良载体设计，把ccdB （Control of cell death）基因并入到mcs中，如果没有DNA片断插入，ccdB基因则会表达，ccdB基因的表达蛋白，会破坏细菌的DNA gyrase，造成细菌染色体的降解导致细菌死亡。
如果有插入片断，则ccdB基因表达受到阻碍，所以细胞可生长。
这样可以把高背景的缺点改善，节省筛选的时间。
Topo平端克隆与Topo TA方法一样，操作简单快速。
T OPO PCR表达克隆法传统限制酶切法必须把目标片段切下来再连接至表达载体上，这会导致一些非原始蛋白的其他氨基酸也混在其中，从而影响蛋白表达和蛋白的功能。
利用TOPO克隆技术把PCR产物直接克隆至表达载体，则可避免这种情况。
TOPO PCR表达克隆法仍利用特异引物把目标基因PCR扩增后，再利用高效的Topoisomerase 酶把产物快速连接到T表达载体上，这是到载体上的目标基因不含非编码区，Invitrogen提供了原核细胞、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞的各种PCR克隆表达系统。
靶向药物治疗的靶点突变检测与筛选方法
靶向药物治疗的靶点突变检测与筛选方法靶向药物是一种针对肿瘤发生的分子机制和变化的药物治疗方法。
与传统的化疗药物相比，靶向药物具有更好的疗效和较少的副作用，因此被广泛应用于肿瘤治疗中。
为了使靶向药物治疗更加精准和有效，靶点突变的检测与筛选方法显得至关重要。
本文将介绍一些常用的靶向药物治疗的靶点突变检测与筛选方法。
一、组织样本获取与处理靶向药物治疗的靶点突变检测与筛选首先需要获取肿瘤组织样本，并进行适当的处理。
常用的组织样本包括肿瘤活检样本和手术切除标本。
其中，肿瘤活检样本通常通过穿刺或内窥镜等方式获取，而手术切除标本则需要进行切片和固定处理，以保证样本的质量和稳定性。
二、分子生物学方法1. 蛋白质结构分析：通过蛋白质结构分析来确定靶点的结构和功能特征，从而了解靶点是否存在突变。
常用的方法包括X射线晶体学、核磁共振和电子显微镜等。
2. DNA测序技术：DNA测序技术是靶点突变检测的重要方法之一。
常用的DNA测序方法包括Sanger测序、高通量测序和全外显子测序等。
这些方法可以对肿瘤组织样本中的基因进行全面和准确地检测，以寻找可能存在的靶点突变。
3. PCR技术：聚合酶链式反应（PCR）是检测靶点突变的常用方法。
通过特异性引物扩增突变位点，然后进行电泳分析，可以快速、准确地检测有无靶点突变。
常见的PCR技术包括限制性片段长度多态性（RFLP）分析、聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分析和荧光定量PCR等。
4. 荧光原位杂交（FISH）技术：FISH技术可以在细胞或组织水平上检测靶点的基因拷贝数和突变情况。
通过使用特异性探针与靶点序列杂交，可以对这些序列进行显微观察和分析，以确定靶点的突变状态。
三、免疫组织化学（IHC）技术免疫组织化学技术是一种通过对组织样本进行抗体标记和染色的方法来检测蛋白质的表达情况。
对于靶向药物治疗的靶点突变筛选来说，IHC技术可以帮助我们直接观察和分析靶点是否突变。
质粒定点突变操作步骤
质粒定点突变
1.简介
定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变等。
定点突变能迅速高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。
本实验主要原理是设计一对包含突变位点的引物，和模板质粒退火后用高保真DNA聚合酶循环延伸后用Dpnl 酶切延伸产物。
由于原来的模板质粒来源于常规大肠杆菌，是经过dam甲基化修饰的，对Dpnl敏感而被切碎（Dpnl 识别序列为甲基化的GATC，GA TC在几乎各种质粒中不止一次出现），而体外合成的突变质粒没有甲基化不被消化因此得以在成功转化，随后得到突变的质粒克隆。
2.材料
2.1试剂
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（诺唯赞Vazyme Biotech，#P505-d1-AA）
2 × Phanta Max Buffer（诺唯赞Vazyme Biotech，#PB505）
dNTP Mix (10 mM each)（诺唯赞Vazyme Biotech，# P031-01/02）
DMSO
3.步骤
1、设计一对包含突变位点的互补引物。
2、反应体系
反应程序
所有操作请在冰上进行，各组分解冻后请充分混匀，用完之后请及时放回-20℃保存。
3、反应产物加入0.5 μl Dpnl酶，37 ℃静置>2 hs。
4、静置后取2 μl加入100 μl Turbo进行转化，后面步骤同分子克隆。
分子克隆方法
3’ nnnnnnnC 连接
Gnnnnnnn 5’
• 2、用于去除一段序列
• 1、通过酶切的方法 • 酶的选择： • 1、选择黏性末端的酶 • 2、选择配合较好的酶 • 3、避免平末端酶 • 4、避免同尾酶 • 如 bamh1 GGATCC和 bgl2 AGATCT
• 2、PCR获得 • 一、引物设计 • 一般在扩增引物的5’端增加酶切位点，并且
加保护碱基。 •如
• 3、基因合成 • 在合成基因的同时，应将用于克隆的酶切
其他克隆技巧
1、同尾酶 因同尾酶如 bamh1 GGATCC和 bgl2 AGATCT。 具有相同的黏性末端，所以这两种酶是可以 连接在一起的 用途，当目的DNA上有酶切位点限制时可以 选用同尾酶替换。
目的基因上有bamh1，可用bgl2来代替。
• 2、补平 • 1、用于去酶切位点 • SAC1酶切位点
位点一起合成。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
• 克隆载体： • 一、通过酶切获得的载体 • 二、PMD18-T • 三、topo载体
• 一、通过酶切获得的载体 • 1、有合适酶切位点的载体，如：
• 2、无合适酶切位点的载体 • 这里可以用两中方法来做 • 1、通过突变PCR方法 增加酶切位点 • 2、将整个载体PCR下来，然后在引物两端
普通连接
目的：分离一个已知DNA序列，并以活体内
方式获得许多复制品的过程。这一复制过程 经常被用于增加并获取DNA片段中的基因， 但也可用来增加某些任意的DNA序列，如启 动子、非编码序列或是随机的DNA片断。
方法
• 一、目的DNA的获得 • 1、通过酶切的方法 • 2、PCR获得 • 3、基因合成
• 二、PMD18-T • 本载体1 μl（50 ng） • 进行克隆时，Vector DNA和Insert DNA 的摩
基因定点突变方法及其应用
基因定点突变方法及其应用基因定点突变是指在基因组中特定位置的发生的突变。
基因定点突变可以是单个碱基的突变，也可以是多个碱基的突变。
这可以发生在DNA、RNA或蛋白质的编码区域或非编码区域。
基因定点突变方法是用于研究基因突变的工具和技术。
它们在生物医学研究、疾病诊断、药物研发等领域有着广泛的应用。
1.PCR扩增：PCR扩增是一种常用的基因定点突变方法，可以快速有效地扩增所需的DNA片段。
通过在PCR反应中引入突变引物，可以在特定位点引入单个碱基变异。
这种方法被广泛应用于基因功能研究、遗传性疾病的诊断和突变的检测等领域。
2.扩增-测序：扩增-测序方法是一种将突变引物引入待测基因位点的PCR扩增方法，随后使用测序技术验证突变是否成功。
这种方法可用于研究基因突变与人类遗传病之间的相互关系，还可以用于检测药物抗性突变、病毒突变等领域。
3.分子克隆：分子克隆是一种将特定DNA片段插入载体DNA的方法。
通过将突变片段与目标DNA结合，随后将其放入宿主细胞，可将所需的突变引入到目标基因中。
这种方法广泛应用于蛋白质工程、基因功能研究等领域。
4. CRISPR-Cas9系统：这些基因定点突变方法在基因功能研究、疾病诊断和治疗、药物研发等领域有着广泛的应用。
在基因功能研究中，通过引入特定的突变，研究人们可以研究基因的功能和调控机制。
例如，通过基因定点突变，可以研究基因在发育、免疫反应、代谢调节等过程中的作用和调节机制。
在疾病诊断和治疗中，基因定点突变方法可以用于检测与一些遗传性疾病有关的突变。
例如，通过扩增-测序方法可以检测BRCA1和BRCA2基因的突变，从而评估患者患乳腺和卵巢癌的风险。
此外，基因定点突变方法也可以用于基于个体遗传背景的个体化药物治疗。
在药物研发领域，基因定点突变方法可以用于评估药物的疗效和副作用。
通过引入特定的突变，可以模拟蛋白质靶点的突变，评估药物对该靶点的亲和力和选择性。
这对于开发更有效和安全的药物具有重要意义。
SnapGene中文使用教程
SnapGene使用教程一、SnapGene中的几个View介绍View1:Map1.打开一个质粒图谱文件，在Topol ogy option处选择ci rcula r。
得如下界面：显示质粒图谱的酶切位点。
右侧箭头可显示不同厂家出售的酶。
显示质粒图谱的开放阅读框及转录方向。
点击其显示的箭头可显示该ORF的片段大小、G C%值等一些信息。
显示片段名称。
△给非编码序列命名：如多克隆位点。
先找到质粒图谱中的多克隆位点的第一个酶切位点和最后一个酶切位点。
点击左侧se quenc e，找到两个酶切位点之间的序列。
View2:Sequen ce点击Sequ ence，得到如下界面：显示编码的氨基酸序列，有缩写和全写两种。
View3：Enzyme s点击Enzy mes，得到如下界面：View4：Featur es点击Features，得到如下界面：显示各个已命名片段的一些特点。
二、对片段进行注释1.给编码序列命名：点击其中一个箭头，按Featu re→Add Transl atedFeatur e，弹出以下窗口：Featur e：给该片段命名。
Type：选择该片段的类型，右侧箭头代表阅读方向。
Color：选择颜色。
2.给非编码序列命名：如多克隆位点。
先找到质粒图谱中的多克隆位点的第一个酶切位点和最后一个酶切位点。
点击左侧se quenc e，找到两个酶切位点之间的序列。
3.给质粒图谱增加引物序列：按Edit→Find，输入引物序列，找到质粒序列对应位置，点击Primers→Add primer，弹出该界面：按上下游引物选择Top Strand还是Bot tom Strand，在Prime r处可给该引物命名，随后即可显示该引物在图谱Map中的位置。
topo克隆和点突变
• 克隆胶回收片段： Why~ 紫外照射和EB对dsDNA造成损伤； (受到损伤的DNA不是连接的最佳底物) 3’-“A”容易在电泳过程中被核酸外切 酶降解，导致TA连接效率低； 试剂残留的抑制。 How~ 操作中通过细节注意避免
• 目的片段浓度很低： Why~ 无法保证有效碰撞 How~ 浓缩DNA
• 优点： ♠筛选方法：DpnI限制性内切酶
• 缺点： ♠引物完全重叠，线性扩增，
扩增产物不可见，可操作性差 ♠扩增产物为线状 ♠无DMT体内消化降解模板
TransGen: Easy/Fast Mutagenesis System
• 共有部分：PCR组分、DpnI酶、DMT细胞 • Easy Mutagenesis System： 使用EasyPfu酶 • Fast Mutagenesis System： 使用FastPfu酶—— 扩增速度比Taq更快、保真性比Pfu更高，扩增 10Kb左右的质粒只需2个小时！ （请参考《金品是怎样炼成的》）
线性扩增，产物不可 见 产物为线状 指数扩增，产物可见 产物为环状
DpnI酶体外降解
TransGen Easy/Fast Mutagenesis
部分重叠 突变位点位于 两条引物上
DMT细胞体内降解 DpnI酶体外降解
传统方法：仅利用PCR
• 反向PCR定点突变 • 重叠延伸PCR定点突变 • 大引物PCR定点突变
• 反向PCR： 特点： 必须以质粒为模板； 引物方向相反； 引物需要磷酸化。
• 重叠延伸PCR： 特点：两轮PCR
• 大引物PCR： 特点：两轮PCR
• GeneTailor，QuickChange，Easy/Fast Mutagenesis System也是基于PCR原理实 现点突变，但它们与传统方法的区别主 要在于可以对突变克隆进行初步的筛选 • 筛选原理：降解甲基化质粒模板 • 筛选依据： 来自大肠杆菌的质粒99%发生甲基化； PCR是去甲基化过程，PCR产物（发生 突变的产物）是去甲基化的产物。
非标记探针检测中异常融解峰的特征分析
非标记探针检测中异常融解峰的特征分析提示：非标记探针检测依赖于双链DNA结合染料，通过反应产物和探针的融解去发现及确定目的序列。
在非标记探针检测的发展及应用过程中，异常融解峰有时会被检测到并有可能影响结果的解释。
本报告中，我们对RET基因第10外显子的非标记探针检测中所出现的异常融解曲线进行了研究。
非标记探针3’端的不完全封闭导致了聚合酶介导的探针延伸，是出现异常融解曲线的决定因素。
本报告更进一步测试了3’端修饰物如C3 spacer, 氨基修饰的C6、磷酸化、反向dT、3’端单碱基错配等在非标记探针实验中的封闭能力。
在本实验中，虽然没有一个3’端修饰物是100%有效的，但氨基修饰的C6、反向dT、C3 spacer表现出非常好的封闭效力（≦1%未封闭），磷酸则不是一个好的封闭物（≧2%未封闭），而单碱基错配则应避免作为3’端的封闭修饰物。
非标记探针及产物融解分析被用于检测人类RET、囊性纤维化、factor V基因及其它疾病中的SNP及小片段缺失。
该方法使用3’端封闭的非标记探针及双链dsDNA结合染料LCGreen Plus (Idaho Technology, Salt Lake City, UT)发现及确定目的序列。
非标记探针并不带有荧光基团，更确切地说，当与双链结合染料共同使用时，它们与不对称PCR所产生的单链ssDNA退火，从而产生一种融解曲线信号。
与其他只检测探针互补序列的方法不同，非标记探针系统可以通过分析dsDNA扩增产物的融解情况来检测探针以外区域的SNP。
dsDNA结合染料的高灵敏度和低特异度需要有明确的融合曲线图以精确鉴别插入、缺失或多态性。
在非标记探针的优化过程中，异常融解曲线常常是由引物二聚体和非特异扩增引起的，可以通过改变退火温度或重新设计引物序列降低甚至消除。
一旦优化完成，1个非标记探针分析会产生2个融解峰：dsDNA产物的融解及探针从不对称PCR的ssDNA脱离下来所产生的融解。
T载体-B载体与PCR克隆困扰
T载体-B载体与PCR克隆困扰盘古基因李万波PCR技术给基因工程带来了巨大的变革，生物学家可以配合DNA内切酶随意放大、克隆基因。
一、T-载体与B-载体PCR产物的克隆技术也得到了长足发展，T/A克隆载体（简称“T载体”）就是上世纪末发展起来的。
Taq酶是第一个被克隆的嗜热菌DNA聚合酶，由于发现了Taq酶具有不依赖DNA模板的核苷酸末端转移酶活性，能够给双链DNA 的3’-末端添加1个碱基，所以T/A克隆技术应运而生。
Taq酶在dNTP俱全的情况下，优先添加1个A碱基（3’-A Protruding）, 当只有其它某个碱基时，她就退而求其次，也能加上1个其它碱基，比如“dTTP”。
PCR产物的平端连接效率本来很低，这是因为常规合成的寡核苷酸引物5’-端不带磷酸，T4 DNA连接酶只能将DNA链的3’-OH和另一DNA链的5’-P(磷酸基团)相连。
DNA内切酶切开的平末端5’带有磷酸基，只有这条链能与PCR产物的3’-OH发生连接反应，另一条链没有粘性。
T/A克隆时也一样，只能连接单链，另一条链上的缺口（Nick）需要受体菌（Host Bacteria）体内的激酶和连接酶帮助修补，才能成为完整的环状质粒，完成滚环复制，抵抗筛选压（抗生素毒性）。
所以，如果质粒转化感受态菌后的37℃温育不够1小时，菌落数是会减少的。
上世纪80年代，拓扑异构酶1B的发现使得PCR产物的平端克隆技术（Blunt-end cloning vector, B-载体）取得了巨大改进。
拓扑异构载体对平末端的连接速度和效率至今无可匹敌。
这类载体有盘古基因的pACK4a系列、原核表达载体Topoied系列、哺乳类载体Topoied系列，此外还有Invitrogen 和全式金的相应载体。
该类载体由于Topoisomerase Ib的微弱的记忆功能，需要PCR引物的5’第一个碱基尽量与载体处理前切除的5’端碱基相同，这样才能获得近乎100%的克隆率。
Gateway技术
• 1.3 进行LR反应。 混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的 载体以及Gateway LR Clonase酶，构建表达克 隆。（表达克隆用来在合适的宿主中进行蛋 白的表达和分析。）
PCR定向（PCR-Directional）TOPO克隆
• 定向TOPO克隆使得克隆PCR产物和其它的DNA分子更加快 速和有效。简单连接可以产生大于90%的重组子。 • 定向TOPO克隆可以定向克隆平端PCR产物到入门载体，简 化了酶切，连接，筛选等PCR后续步骤。 • 目前有两种定向TOPO克隆载体:pENTR/D-TOPO 和 pENTR/SD/ D-TOPO，有以下特点：
Gate way 技术 的灵 活性
Gateway技术原理
• Gateway技术是基于已研究的清楚的λ噬菌体位 点特异重组系统（attB x attP →attL x attR）， 由 BP和LR两个反应过程构成。 • BP反应是利用一个attB DNA片段或表达克隆和 一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个 入门克隆。 • LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体 之间的重组反应。 LR反应用来在平行的反应中 转移目的序列到一个或更多个目的载体。
Байду номын сангаас Topo原理
• Topo TA克隆原理与TA克隆一样，唯一不同的是TA克隆用的是T4 连接酶把PCR片断连接到T载体上，而Topo TA Cloning用的是DNA Topoisomerase（DNA拓扑异构酶I），该酶同时具有限制酶和连 接酶特性。 其生物学功能是在复制DNA前把超螺旋DNA切割使 之解旋后，再连接成线性DNA。 • Topoisomerase有高效连接的特性把含3`A端的PCR扩增片断快速 连接到3`T端载体上，整个反应只需五分钟！一般T4连接酶需过 夜才能高效连接 • 实验常用牛痘病毒拓扑异构酶I可特异性地识别五核苷酸序列5’(C/T)CCTT-3’，并且可与连接到3´胸腺嘧啶脱氧核苷的磷酸基团 形成共价键。 它切割一条 DNA 链，而使 DNA 解旋。 随后，这 种酶重新连接被切割的链，并使自身从 DNA 上释放出来。 为了 利用拓扑异构酶的再连接活性，我们提供在每个3´磷酸基团连 接有拓扑异构酶 I 的线性化TOPO®载体。 这样，载体便能够轻 易地将 DNA 序列与配伍末端连接在一起
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克隆载体图谱[Blunt Cloning]
表达载体[TA Cloning]
• 一步法载体构建 一步法载体构建——藉由 藉由TOPO技术实现 技术实现! 藉由 技术实现
TOPO克隆成功的关键
• 引物设计 • PCR条件 • 克隆反应设置（DNA加入量、反应的温 度和时间） • 克隆感受态细胞的选择 • 选用质量好的胶回收或PCR纯化试剂盒
TOPO克隆技术
• • • • TOPO克隆原理 TOPO克隆策略 TOPO克隆成功的关键 TOPO克隆常见问题及解决方法
TOPO克隆原理
• TOPO即Topoisomerase 拓扑异构酶 • 特点： 由316个氨基酸组成 识别5’-CCCTT-3’ 同时具有限制性内切酶和连接酶的功能 不需要能量
Mach1-T1
OmniMAX2-T1
TL-Blue
• 选择质量好的胶回收或PCR纯化试剂盒： 试剂品质很关键 质量不好的试剂盒很可能会抑制下游连接
TOPO克隆常见问题及解决方法
• • • • 克隆数少（确认感受态细胞效率正常时） 克隆阳性率低 PCR鉴定重组子失败 菌落多为淡蓝色或FishEye（白边蓝芯）
TransGen Easy/Fast Mutagenesis
部分重叠 突变位点位于 两条引物上
• 引物设计： ♣引物不能磷酸化； ♣引物5’端第一个碱基会影响下游的连接效率； • PCR注意事项： ♣后延伸设置为72℃10～20分钟； 目的： 保证扩增片段完整，可以有效降低扩增背景； 使用Taq系列DNA聚合酶扩增时，该步骤相当于加A反应。
• 目的片段加入量[为保证良好的连接效率，推荐如下] ♣ 700bp以及更小的片段：保证20ng ♣ 700bp以上的片段：保证30~100ng ♣ 2Kbp左右的片段：保证40ng ♣ 3Kbp左右的片段：保证60ng ♠片段加入量max：4µl，浓度很低时也有一定的连接效率， 体积大于5 µl会破坏反应体系平衡； ♠片段加入量min：0.5µl，浓度很高时需要稀释， 可以补充无菌水方便操作。 • 反应温度： TOPO酶的工作温度为20℃～37℃
TOPO克隆和传统T4克隆比较
Topo克隆 无需纯化可直接用于克隆 （若无杂带和引物二聚体） 5分钟 T4 DNA Ligase克隆
PCR产物 反应时间
需要纯化，否则抑制连接 过夜（12小时） 载体+片段 +T4 DNA Ligase Buffer +T4 DNA Ligase （污染几率大） ～60% 费时
TOPO克隆——原理
TOPO克隆——过程
TOPO克隆——过程
TOPO克隆迅速、便捷
载 体 片 段
5 min
产 物
TOPO克隆——克隆策略
PCR产物 有无杂带？有无引物二聚体？ 均有或有杂带 Gel Extraction Kit 均无 基因克隆、转化 无杂带，有引物二聚体 PCR Purification Kit
TransGen：
♠引物部分重叠，指数扩增，扩增产物可见，易于操作； 扩增产物为环状； ♠两条引物上均有突变点，突变效率高； ♠DpnI体外降解筛选 + DMT体内降解筛选=双重筛选 双重筛选！ 双重筛选 大大提高阳性率。
• TransGen：Easy/Fast Mutagenesis System 引物设计示意图
传统方法：仅利用PCR
• 反向PCR定点突变 • 重叠延伸PCR定点突变 • 大引物PCR定点突变
• 反向PCR： 特点： 必须以质粒为模板； 引物方向相反； 引物需要磷酸化。
• 重叠延伸PCR： 特点：两轮PCR
• 大引物PCR： 特点：两轮PCR
• GeneTailor，QuickChange，Easy/Fast Mutagenesis System也是基于PCR原理实 现点突变，但它们与传统方法的区别主 要在于可以对突变克隆进行初步的筛选 • 筛选原理：降解甲基化质粒模板 • 筛选依据： 来自大肠杆菌的质粒99%发生甲基化； PCR是去甲基化过程，PCR产物（发生 突变的产物）是去甲基化的产物。
• 反应时间：
PCR产物 PCR纯化产物 PCR产物 / PCR纯化产物 25℃ 10min 25℃ 5min 25℃ 15min 【大片段、特殊结构】 25℃ 20min 【大片段、特殊结构】 胶回收产物/ 胶回收产物/加A产物 25℃10～15min
• 克隆感受态细胞的选择：
Top10 DH5α JM109 XL1-Blue 适用于毒基因的克隆 普遍使用 同源重组率低，提取质粒质量最好 适合非甲基化DNA的转化 （必要时可以代替DMT） 具有T1、T5噬菌体抗性， 在液体培养基中生长速连接失败实为误判！
３．菌落多为淡蓝色或FishEye： Why~ 插入片段没有影响LacZ基因读码框 插入片段小（小于400bp） How~ 不要丢弃平板！ 进行进一步鉴定
基因定点突变技术
• 利用PCR实现点突变的几种传统方法 • GeneTailor，QuickChange， Easy /Fast Mutagenesis System 三种市售点突变试剂盒的比较
TOPO 克隆技术与基因定点突变技术
北京全式金生物技术有限公司
背景资料
• 基因克隆是分子生物学必不可少的工具，传统 的T4 DNA Ligase方法实验周期长。 • TOPO克隆——5分钟快速克隆，是克隆技术的 革命。这个技术上的飞跃为实现“加速科研” 的理念提供了先决条件。 • 基因定点突变技术——改造基因的便利方法。 基因功能研究已经成为生命科学研究的新热点， 因此需要强有力的工具保证基因结构和功能关 系研究的进行。
• 筛选方法： ♣体内降解：原始质粒模板可以被能降解甲基化 质粒的大肠杆菌（DMT）降解，而去甲基化的 扩增产物（发生突变的产物）不会被降解。 ♣体外降解：DpnI识别序列5’-GmATC-3’（在 DNA序列中，一般每256bp中出现一次）。甲 基化模板可被DpnI识别、切割，而去甲基化的 扩增产物（发生突变的产物）不会被降解。
Invitrogen： GeneTailor Mutagenesis System
• 优点 ♠引物部分重叠，指数扩增 ♠扩增产物可见，易于操作 ♠筛选方法：DMT体内降解 • 缺点： ♠突变点在一条引物上 ♠无DpnI限制性内切酶降解模板
Stratagene： QuickChange Mutagenesis System
重叠区 延伸区
FWD 5’ 3’ 5’ REV 3’
正向引物上的突变点
反向引物上的突变点
引物设计
Invitrogen GeneTailer
部分重叠 突变位点位于 一条引物上
扩增特点
指数扩增， 指数扩增，产物可见 产物为环状
模板降解方法
DMT细胞体内降解 DMT细胞体内降解
线性扩增， 线性扩增，产物不可 DpnI酶体外降解 完全重叠 Stratagene 见 QuickChange 突变位点位于 两条引物上 产物为线状 指数扩增， 指数扩增，产物可见 产物为环状 DMT细胞体内降解 DMT细胞体内降解 DpnI酶体外降解
• 优点： ♠筛选方法：DpnI限制性内切酶 • 缺点： ♠引物完全重叠，线性扩增， 扩增产物不可见，可操作性差 ♠扩增产物为线状 ♠无DMT体内消化降解模板
TransGen: Easy/Fast Mutagenesis System
• 共有部分：PCR组分、DpnI酶、DMT细胞 • Easy Mutagenesis System： 使用EasyPfu酶 • Fast Mutagenesis System： 使用FastPfu酶—— 扩增速度比Taq更快、保真性比Pfu更高，扩增 10Kb左右的质粒只需2个小时！ （请参考《金品是怎样炼成的》）
• 毒基因： Why~其本底表达产物对宿主生长有明显抑制 How~ 选用Top10
• 基因特殊结构： Why~ 具有高AT、高GC、反向重复序列的 基因，不容易连接 How~ 调整、摸索连接体系和条件 尝试不同的载体，不同的骨架对片 段偏好性不同
所谓连接失败实为误判！ 所谓连接失败实为误判！
２．PCR鉴定重组子失败： 现象：用通用引物鉴定时，扩增产物既无 目的带又无载体自连带 How~ 预变性95℃ 10min （彻底裂解菌体、释放DNA） 最好能用通用引物鉴定
• 克隆胶回收片段： Why~ 紫外照射和EB对dsDNA造成损伤； (受到损伤的DNA不是连接的最佳底物) 3’-“A”容易在电泳过程中被核酸外切 酶降解，导致TA连接效率低； 试剂残留的抑制。 How~ 操作中通过细节注意避免
• 目的片段浓度很低： Why~ 无法保证有效碰撞 How~ 浓缩DNA
１．克隆数少或阳性率低：
胶回收片段 产物不新鲜 DNA浓度低 反应时间
毒基因
基因特殊结构
• 上述五种情况，均需要适当延长连接反 应时间！以保证连接效率和克隆数。 （可参考上文的载体连接反应时间） • 另外每种情况也有一些特别的地方可以 改进，进一步提高克隆效果。
• PCR产物不新鲜： Why~ 3’端热力学不稳定，3’－“A”容易 脱落 直接导致TA克隆效率低 How~ PCR产物置于4℃保存1～2天内使用 不要冷冻PCR产物 PCR结束后立即使用效果最好
操作
载体+片段 （污染几率小）
克隆效率 特点
>85% 省时（至少节约1天） 快速、高效
TransGen TOPO Vector
• • • • • • • pEASY-T1 Cloning Vetor pEASY-T1 Simple Cloning Vetor pEASY-T3 Cloning Vetor pEASY-Blunt Cloning Vetor pEASY-Blunt Simple Cloning Vetor pEASY-E1 Expression Vetor pEASY-E2 Expression Vetor