载体、点突变

• 筛选方法： ♣体内降解：原始质粒模板可以被能降解甲基化 质粒的大肠杆菌（DMT）降解，而去甲基化的 扩增产物（发生突变的产物）不会被降解。 ♣体外降解：DpnI识别序列5’-GmATC-3’（在 DNA序列中，一般每256bp中出现一次）。甲 基化模板可被DpnI识别、切割，而去甲基化的 扩增产物（发生突变的产物）不会被降解。
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目的片段加入量：跑电泳可见的浓度，加入1µl即可。 1 优化指南： 优化指南 如果按照上述操作没有得到理想的结果，请按照以下具体要求调整： ♣ 700bp以及更小的片段：保证20ng ♣ 700bp以上的片段：保证30~100ng 700bp 30~100ng ♣ 2Kbp左右的片段：保证40ng ♣ 3Kbp左右的片段：保证60ng ♠片段加入的最大量：4µl，浓度很低时也有一定的连接效率， 体积大于5 µl会破坏反应体系平衡； ♠片段加入的最小量：0.5µl，浓度非常高时需要稀释，否则会产生抑制， 可以补充无菌水方便操作。
• 选择质量好的胶回收或PCR纯化试剂盒： 试剂品质很关键 质量不好的试剂盒很可能会抑制下游连接
• 克隆感受态细胞的选择： 基因对感受态细胞的偏好性很大， 即使是Top10也有可能遇到无法正常进行实 验的情况，因此需要我们针对自己的实验进行 适当的摸索和选择。
• 克隆感受态细胞的选择：
Top10 DH5α JM109 XL1-Blue 适用于毒基因的克隆 普遍使用 同源重组率低，提取质粒质量最好 适合非甲基化DNA的转化 （必要时可以代替DMT） 具有T1、T5噬菌体抗性， 在液体培养基中生长速度快 具有T1、T5噬菌体抗性， 可用于文库构建 适用于大质粒DNA和重组产物的转化 降低片段大小的偏爱性，可用于文库构建
Stratagene： QuickChange Mutagenesis System
• 优点： ♠筛选方法：DpnI限制性内切酶 • 缺点： ♠引物完全重叠，线性扩增， 产物不可见，可操作性差 ♠扩增产物为线状 ♠无DMT体内消化降解模板
Invitrogen： GeneTailor Mutagenesis System
Mach1-T1
OmniMAX2-T1
TL-Blue
TOPO克隆常见问题及解决方法
• • • • 克隆数少（确认感受态细胞效率正常时） 克隆阳性率低 PCR鉴定重组子失败 菌落多为淡蓝色或FishEye（白边蓝芯）
１．克隆数少或阳性率低：
胶回收片段 产物不新鲜 DNA浓度低 反应时间
毒基因
基因特殊结构
TOPO克隆和传统T4克隆比较
TOPO克隆 无需纯化可直接用于克隆 （若无杂带和引物二聚体） 5分钟 室温范围内放置即可 T4 DNA Ligase克隆 PCR产物 反应时间 反应温度 需要纯化，否则抑制连接 过夜（12小时） 需要用仪器严格控温 载体+片段 +T4 DNA Ligase Buffer +T4 DNA Ligase （污染几率大） ～60% 费时
TOPO克隆——原理
TOPO克隆——过程
TOPO克隆——过程
TOPO克隆快速 快速、便捷、高效 高效
载 体
片 段
5 min
产 物
Sekiguchi et al. 1997 JBC
TOPO克隆——克隆策略
PCR产物 有无杂带？有无引物二聚体？ 均有或有杂带 Gel Extraction Kit 均无 基因克隆、转化 无杂带，有引物二聚体 PCR Purification Kit
所谓连接失败实为误判！ 所谓连接失败实为误判！
２．PCR鉴定重组子失败： 现象：用通用引物鉴定时，扩增产物既无 目的带又无载体自连带 How~ 预变性95℃ 10min （彻底裂解菌体、释放DNA） 最好能用通用引物鉴定
所谓连接失败实为误判！ 所谓连接失败实为误判！
３．菌落多为淡蓝色或FishEye： Why~ 插入片段没有影响LacZ基因读码框 插入片段小（小于400bp） How~ 不要丢弃平板！ 进行进一步鉴定
TOPO克隆成功的关键
• • • • 引物设计 PCR条件 选用质量好的胶回收或PCR纯化试剂盒 克隆反应设置（DNA加入量、反应的温 度和时间） • 克隆感受态细胞的选择
•
引物设计： ♣引物不能磷酸化。 PCR注意事项： ♣后延伸设置为72℃10～20分钟； 目的： 保证扩增片段完整，可以有效降低扩增背景； 使用Taq系列DNA聚合酶扩增时，该步骤相当于加A反应； ♠使用Taq系列DNA聚合酶扩增（如EasyTaq、rTaq等），请选用粘端克隆载体； ♠使用Pfu系列DNA聚合酶（如EasyPfu、Probest等）扩增，请选用平端克隆载体； ♠使用复合DNA聚合酶（如TransHiFi、LA等）扩增， 既可用粘端载体，也可用平端载体（一般推荐用粘端）。
指数扩增， 指数扩增，产物可见 产物为环状
DMT细胞体内降解 DMT细胞体内降解
指数扩增， 指数扩增，产物可见 产物Biblioteka Baidu环状
DpnI酶体外降解
DMT细胞体内降解 DMT细胞体内降解
基因定点突变技术
• 利用PCR实现点突变的传统方法 • QuickChange ，GeneTailor， Easy /Fast Mutagenesis System 三种市售点突变试剂盒的比较
传统方法：仅利用PCR
• 反向PCR定点突变 • 重叠延伸PCR定点突变 • 大引物PCR定点突变
• QuickChange ，GeneTailor，Easy/Fast Mutagenesis System也是基于PCR原理实 现点突变，但它们与传统方法的区别主 要在于可以对突变克隆进行初步的筛选 • 筛选原理：降解甲基化质粒模板 • 筛选依据： 来自大肠杆菌的质粒99%发生甲基化； PCR是去甲基化过程，PCR产物（发生 突变的产物）是去甲基化的产物。
TransGen: Easy/Fast Mutagenesis System
Easy点突变与Fast点突变的区别—— • Easy Mutagenesis System： 使用EasyPfu酶 • Fast Mutagenesis System： 使用FastPfu酶—— 扩增速度比Taq更快、保真性比Pfu更高，扩增 10Kb左右的质粒只需2个小时！ （请参考《金品是怎样炼成的》）
TransGen TOPO Vector
• • • • • • • pEASY-T1 Cloning Vetor pEASY-T1 Simple Cloning Vetor pEASY-T3 Cloning Vetor pEASY-Blunt Cloning Vetor pEASY-Blunt Simple Cloning Vetor pEASY-E1 Expression Vetor pEASY-E2 Expression Vetor
引物设计
扩增特点
模板降解方 法
线性扩增， 完全重叠 线性扩增，产物不可见 DpnI酶体外降解 Stratagene QuickChange 突变位点位于 产物为线状 两条引物上
Invitrogen GeneTailor TransGen Easy/Fast Mutagenesis
部分重叠 突变位点位于 一条引物上 部分重叠 突变位点位于 两条引物上
• 目的片段浓度很低： Why~ 无法保证有效碰撞 How~ 浓缩DNA
• 毒基因： Why~其本底表达产物对宿主生长有明显抑制 How~ 选用Top10
• 基因特殊结构： Why~ 具有高AT、高GC、反向重复序列的 基因，不容易连接 How~ 调整、摸索连接体系和条件 尝试不同的载体，不同的骨架对片 段偏好性不同
操作
载体+片段 （污染几率小）
克隆效率 特点
>85% 省时（至少节约1天） 快速、高效
TOPO的局限性
• TOPO载体受原理所限，连接大于3Kbp 大于3Kbp 的外源片段时效率低于T4原理载体。 • TOPO载体受原理所限，克隆数要少于T4 原理载体。 (Control Insert≈1000)
•
反应温度： TOPO酶的工作温度为20℃～37℃
• 反应时间[优化指南]： [优化指南]
PCR产物 PCR纯化产物 PCR产物 / PCR纯化产物 25℃ 10min 25℃ 5min 25℃ 15min 【大片段、特殊结构】 25℃ 20min 【大片段、特殊结构】 胶回收产物/ 胶回收产物/加A产物 25℃10～15min
• PCR产物不新鲜： Why~ 3’端热力学不稳定，3’－“A”容易 脱落 直接导致TA克隆效率低 How~ PCR产物置于4℃保存1～2天内使用 不要冷冻PCR产物 PCR结束后立即使用效果最好
• 克隆胶回收片段： Why~ 紫外照射和EB对dsDNA造成损伤； (受到损伤的DNA不是连接的最佳底物) 3’-“A”容易在电泳过程中被核酸外切 酶降解，导致TA连接效率低； 试剂残留的抑制。 How~ 操作中通过细节注意避免
• 优点 ♠引物部分重叠，指数扩增 ♠扩增产物可见，易于操作 ♠筛选方法：DMT体内降解 • 缺点： ♠突变点在一条引物上 ♠无DpnI限制性内切酶降解模板
TransGen：
综合了上述两种试剂盒的优点！ 综合了上述两种试剂盒的优点！ ♠引物部分重叠； ♠优化~两条引物上均有突变点，突变效率高； 优化~ 优化 ♠DpnI体外降解筛选 + DMT体内降解筛选=双重筛选 双重筛选！ 双重筛选
TOPO 克隆技术 基因定点突变技术
实验技术服务部 张琛 北京全式金生物技术有限公司 www.transgen.com.cn
TOPO克隆技术
• • • • TOPO克隆原理 TOPO克隆策略 TOPO克隆成功的关键 TOPO克隆常见问题及解决方法
TOPO克隆原理
• TOPO指Vaccina Virus Topoisomerase • TOPO克隆技术应用的是来自牛痘病毒的拓扑异构酶 • 特点： ♣ 由316个氨基酸组成 ♣ 具有快速解旋作用 ♣ 识别5’-CCCTT-3’或5’-TCCTT-3’ ♣ 同时具有限制性内切酶和连接酶的功能 ♣ 不需要外界提供能量 ♣ 在反应开始的1~2分钟内即可完成80%的反应