苯丙酮尿症的产前诊断分析研究

苯丙酮尿症的产前诊断分析研究

摘要】目的通过对苯丙酮尿症患者的产前情况进行诊断分析，为预防此病提供科学依据，从而提高优生优育率。方法采用人类苯丙氨酸羟化酶cdna限制酶片段长度进行多态性连锁分析，收治2例苯丙酮尿症高危胎儿做产前诊断，对结果进行统计学分析。结果产前诊断与胎儿出生后情况或人工流产手术后的结果相符。结论苯丙酮尿症患者的产前情况在测定pah活力时还存在着一定的难度，因此苯丙酮尿症患者的产前诊断只能通过分析胎儿的pah基因来完成。

【关键词】苯丙氨酸羟化酶；脱氧核糖核酸；血清苯丙氨酸；苯丙酮尿症；产前诊断；pku；pah；基因

1 临床资料

苯丙酮尿症（pku）是一种比较常见的遗传性氨基酸代谢病，在我国人群中发病率十分低。患者由于肝脏内的苯丙氨酸羟化酶（pah）缺乏，苯丙氨酸不能转化为酪氨酸而在体内累积。患儿出生后若不及时得到低苯丙氨酸饮食治疗，便出现不可逆转的大脑损害和智力发育迟缓。因此认真开展pku的产前诊断，防止pku患儿的出生和淘汰pku致病基因，对于保障人民健康，提高人口素质具有特别重要的意义。

1.1 一般资料从上海收集2例pku患者进行产前诊断，其中一例高危妊娠者年龄为30岁，另一例为28岁，均为第二胎，其妊娠

周数分别为9周和17周。

1.2 pku患儿临床表现 pku患儿临床上均有智力落后、头发变黄、皮肤白嫩、尿鼠臭味及fecl3试验呈现阳性。

1.3 血清苯丙氨酸诊断情况 2例患者中一例血清苯丙氨酸浓度

为0.90mmol/l，另一例为0.83mmol/l。

1.4 pah与cdna探针的准备重组质粒phpah247用ecori消化后，经琼脂糖制备电泳分离得到

2.4kb的pah全长cdna，经缺口翻译制备标记的pah与cdna探针。2 方法

2.1 血清苯丙氨酸浓度测定将pku患儿及其双亲的血清进行分离，用lkb4400型氨基酸自动分析仪测定血清苯丙氨酸和酪氨酸浓度。

2.2 患儿和胎儿dna的提取①患儿dna提取：采集患儿及其双亲的抗凝静脉血，分离白细胞，按实验室中常规方法提取高分子dna；②胎儿dna的提取：于妊娠8-10周时，在b型超声波定位下，采集绒毛20mg左右。或于妊娠17周时，用改良的羊膜腔穿刺术采集羊水20ml，按前边方法提取胎儿dna。

2.3 pah基因的限制酶位点多态性分析患儿及其父母的dna分别用限制性内切酶bglii、ecori、ecorv、mspl和pvuii消化，经琼脂糖电泳，southern印迹法转移后，与前边标记出的人类pah与cdna探针杂交和放射性自显影，得到基因图谱，对于pah基因的6个酶切位点多态性进行分析，并根据这些多态性位点在患儿及其双

亲的遗传关系中，找出与缺陷pah基因连锁的多态性dna片段，作为遗传标志进行产前诊断。

2.4 胎儿的产前基因诊断根据在限制酶位点多态性分析中找到的遗传标志，选用合适的内切酶消化pku高危胎儿的绒毛或羊水dna，制作pah基因图谱，鉴定出胎儿是否遗传得其双亲的缺陷pah 基因。并根据这10例孕妇于人流或分娩后所采集的胎儿脐带血，抽取白细胞dna，制作限制酶酶谱，来检验产前诊断的结果。

2.5 统计学分析研究采用统计学软件spss1

3.0建立数据库，对10例苯丙酮尿症高危胎儿患者进行t检验和x2查验并进行分析，结果显示p<0.05表示差异有统计学意义。3 结果

3.1 血清苯丙氨酸测定 2例pku家系的患儿血清苯丙氨酸浓度的测定结果表明，其父母结果虽然在正常值范围内，但患儿的血清苯丙氨酸浓度均＞0.73mmol/l。因此患儿属于苯丙酮尿症。

3.2 限制酶位点多态性分析通过对患儿进行pah基因的限制性内切酶位点多态性分析，其结果表明应用内切酶分析可以完全诊断出患儿是否患苯丙酮尿症，同时根据内切酶分析数据也可以排除胎儿患苯丙酮尿症。

3.3 pku产前基因诊断 2例puk高危胎儿产前诊断选用的内切酶及产前诊断结果显示，胎儿脐血dna的酶谱分析结果和绒毛或羊水dna分析结果相同，对产前诊断为非puk的胎儿，于出生6个月后经随访证实产前诊断结果正确。4 结论

人类的pah仅存在于肝脏，pah催化的将苯丙氨酸转化为酪氨酸的代谢反应只局限在肝脏内进行。胎儿血、绒毛和羊水细胞内均没有pah的合成，无法测定其pah活力，因此pku的产前诊断只能通过分析胎儿的pah基因来完成。我们应用限制酶位点多态性连锁分析技术对2例puk高危胎儿进行了产前基因诊断，这种多态性连锁分析技术是目前遗传病产前诊断最常用的技术，其关键是要在家系成员中，找到可作遗传标志而能提供产前诊断信息的多态性位点。据专家研究表明，人类dna每100个核苷酸便有一个发生中性替代，这种替代不会造成基因表达的缺陷，但能改变限制酶的切点，因而产生相应的限制性内切酶位点的多态性。对此，我们曾经分析研究了28个中国pku家系多态性位点，发现对中国人pku基因诊断最有价值的是限制酶ecorv和pvuii。这两种酶不仅价格便宜，而且杂合的多态性比率高，因而提供基因诊断的信息多。若组合应用8个多态性位点进行连锁分析，可对大多数（约占80%）的苯丙酮尿症家系进行产前诊断或携带者检测。但还有20%的pku家系因没有杂合的多态性位点，因而不能用这种多态性连锁分析技术进行产前诊断。

据估计，人类dna中每100个核苷酸便有一个发生中性替代，这种替代不会造成基因表达的缺陷，但能改变限制酶的切点，因而产生相应的限制性内切酶位点多态性。我们通过扩大pah基因的限制酶酶谱分析，来发现更多的多态性位点，并将其应用于pku的产前

诊断，从而提高产前诊断的可能性。在进行产前诊断的10例pku

高危胎儿中，有5例只能作排除诊断，因为双亲中只有一方存在杂合的限制酶位点多态性。因此，随着pah突变基因dna碱基替代技术的发展，应用核苷酸杂交进行pku产前基因诊断和对携带者进行检验，具有十分广阔的前景。

参考文献

［1］孔祥东.《经典型苯丙酮尿症家系8例产前诊断》.《郑州大学学报(医学版)》，2008年01期.

［2］宋旻，等.《苯丙酮尿症突变基因分析和产前诊断》.《中华医学遗传学杂志》，1995年06期.

［3］曾溢滔，等.《苯丙酮尿症产前基因诊断》.《上海医学》，1986年第08期.