核酸杂交

3. pH值
pH值在5-9范围内，Tm值变化不明显。当溶液pH值小于4 时或大于11时，均不利于氢键的形成，DNA容易变性
4. 变性剂
• 干扰碱基堆积力和氢键的形成，因此可以降低Tm值 • 常用的变性剂有甲酰胺、尿素、甲醛等
《分子生物学检验技术》模块4 · 核酸分子杂交技术
核酸变性与复性
复性（renaturation）：指变性 DNA 在适当 条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双 螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程 退火（annealing）：热变性DNA一般经缓慢冷 却后即可复性，此过程称之为“退火”
的组成
2．溶液的离子强度 3． pH值 4．变性剂
DNA复杂度对Tm的影响 9
《分子生物学检验技术》模块4 · 核酸分子杂交技术
• 融解温度的影响因素： 1. DNA分子大小和碱基的组成 不同来源 DNA 间的 Tm 存在差别，在溶剂相同 的前提下，这种差别主要是由DNA本身下列两 方面的性质所造成的
18
《分子生物学检验技术》模块4 · 核酸分子杂交技术
核酸探针的种类
– 基因组DNA探针 – cDNA探针 – RNA探针 – 寡核苷酸探针
19
《分子生物学检验技术》模块4 · 核酸分子杂交技术
基因组DNA探针 • 来源：这类探针来源于某种生物的基因组，多为某 一基因的全部或部分序列
• 制备方法:
29
《分子生物学检验技术》模块4 · 核酸分子杂交技术
4、Klenow大片段的末端标记法
Klenow大片段来 源于E.coli DNA聚 合酶I全酶，具有 5’→3’聚合酶活性， 可对DNA探针分子 的3’端进行标记
30
《分子生物学检验技术》模块4 · 核酸分子杂交技术
5、T4噬菌体多核苷酸激酶标记（5’端标记法） （polynucleotide kinase，PNK) 多用于寡核苷酸探针的标记
《分子生物学检验技术》模块4 · 核酸分子杂交技术
核酸分子杂交技术
温州医科大学
检验医学院、生命科学学院
1
《分子生物学检验技术》模块4 · 核酸分子杂交技术
主要内容
1. 核酸杂交的基本原理 2. 核酸探针
3. 核酸分子杂交的类型
4. 核酸分子杂交的影响因素
2
《分子生物学检验技术》模块4 · 核酸分子杂交技术
5
《分子生物学检验技术》模块 4 · 核酸分子杂交技术 第一节 核酸杂交的基本原理
二、核酸变性与复性
解链曲线
通常利用DNA变性后在波
长260nm处吸光度（A260）
的增加来监测DNA变性的
过程。如果以温度对A260 的关系作图，所得的曲线 称为解链曲线。典型DNA 变性曲线呈S型
《分子生物学检验技术》模块 4 · 核酸分子杂交技术 第一节 核酸杂交的基本原理
二、核酸变性与复性
融解温度（ melting temperature，Tm）： 在热变性过程中，紫外吸收值达到最大值的50% 时的温度称为DNA的解链温度或融解温度
• 增色效应与温度有十分密切的关系，这主要 是变性温度取决于DNA自身的性质。
7
《分子生物学检验技术》模块 4 · 核酸分子杂交技术 第一节 核酸杂交的基本原理
常用核酸探针的标记和检测
标记物性质 放射性分子 标记分子 [α32P ]dNTP [γ32P ]dNTP
35S
标记方法 NT、PCR、RP TL NT NT、PCR、RP 600W可见光照
检测方法 放射自显影或计数 放射自显影或计数 放射自显影或计数 酶标亲和素或酶标 抗生物素抗体显色
非放射性分子 生物素 Bio-11-dUTP 光敏生物素
• 杂交双链（hybrid duplex）
– DNA-DNA – DNA-RNA
– RNA-RNA
12
《分子生物学检验技术》模块4 · 核酸分子杂交技术
复性影响因素： DNA的复性不仅受温度影响，还受DNA自身特 性等其它因素的影响
• 温度和时间：一般认为比 Tm低25℃左右的温度是复性 的最佳条件， • DNA浓度：溶液中DNA分子越多，相互碰撞结合“成核” 的机会越大 • DNA分子大小和复杂度：简单顺序的DNA分子，如多聚 （A）和多聚（T）这二种单链序列复性时，互补碱基 的配对较易实现 • 离子强度：增加盐浓度可怎见互补链合成双链的速度
《分子生物学检验技术》模块4 · 核酸分子杂交技术
核酸分子杂交基本原理
DNA加热变性
DNA冷却复性
DNA/RNA杂交
14
《分子生物学检验技术》模块4 · 核酸分子杂交技术
分子杂交（molecular hybridization）:两条DNA链或两 条RNA链或一条DNA链和一条RNA链按碱基互补的原则缔合 成异质双链的过程称为分子杂交或核酸分子杂交
生物素化补骨脂素
酶 过氧化物酶
365紫外线照
化学合成法或直接 法
抗生物素抗体显色
直接底物显色或用 酶 抗体+底物显色
碱性磷酸酶
பைடு நூலகம்
化学合成法或直接 法
2016/5/1 合成法
直接底物显色或用 酶
抗体+底物显色
Zhejian 荧光显微镜观察或 g 37
荧光素
罗丹明和FITC
《分子生物学检验技术》模块4 · 核酸分子杂交技术
二、核酸变性与复性
• 融解温度（Tm）特点：
• 爆发式：热变性是在变性温度范围内突发的
跃变过程，很像结晶达到熔点时的融化现象，
故名融解温度 • 狭窄性：变性温度范围很小
《分子生物学检验技术》模块 4 · 核酸分子杂交技术 第一节 核酸杂交的基本原理
二、核酸变性与复性
• Tm的影响因素：
1． DNA分子大小和碱基
31
《分子生物学检验技术》模块4 · 核酸分子杂交技术
6、化学法全程标记 （用化学反应将酶连接到探针上）
（1）生物素标记核酸探针
UTP
生物素（biotin）
生物素-UTP的结构示意图
32
《分子生物学检验技术》模块4 · 核酸分子杂交技术
（2）光敏生物素标记核酸探针
光敏生物素结构图
（3）地高辛标记核酸探针 （4）酶标记核酸探针 （5）荧光素标记核酸探针
23
《分子生物学检验技术》模块4 · 核酸分子杂交技术
• 寡核苷酸探针设计原则 – 探针长度：一般要求在10～50bp
– G碱基的含量不能过高，否则探针的纯化和杂交
都会有困难；G／C含量为40％～60％ – 探针分子中应避免互补序列
– 避免同一碱基连续出现，一般不能多于4个，如
GGGG-或 -CCCC– 借助计算机相应软件与已知的各种基因序列进行
– 便宜：价格低廉
25
《分子生物学检验技术》模块4 · 核酸分子杂交技术
探针标记物的选择
放射性标记（32P标记 ）
优点：敏感、可靠、操作简单高效、易于除去旧探针
缺点：需要防护；并且有些核素半衰期较短，探针需 重复制备；费用贵
非放射性标记（生物素、地高辛或荧光素标记 ）
优点：对人体危害小；可较长时间贮存；成本低 缺点：灵敏度不如放射性探针；杂交条件受报告基因 的限制；重新杂交新探针比较难
素衰减会释放射线感光胶片上的银颗粒，产生稳定
的潜影，胶片经冲洗后产生可见的图像。 （2）液体闪烁计数法
杂交膜剪成小块，真空干燥后转入闪烁瓶，加入闪烁
液，在液闪仪上自动计数
35
《分子生物学检验技术》模块4 · 核酸分子杂交技术
2、非放射性同位 素探针的检测
36
《分子生物学检验技术》模块4 · 核酸分子杂交技术
同源性比较
24
《分子生物学检验技术》模块4 · 核酸分子杂交技术
核酸探针的标记
理想的探针标记物应具有以下特点
– 特异：靶序列特异
– 稳定：标记物与探针结合后，应不影响杂交反应， 尤其是杂 交特异性、稳定性和Tm值
– 灵敏：标记物被检测 – 无毒：标记物对环境污染小，对人体无损伤 – 简便：操作简单
26
《分子生物学检验技术》模块4 · 核酸分子杂交技术
探针标记方法
1．随机引物法 （单链）
DNA样品经过变性与随 机序列的短引物杂交， 在标记dNTP存在的条件 下，DNA聚合酶Ⅰ催化 引物延伸产生标记产物 当以RNA为模板时，必须采 用反转录酶，得到的产物 是标记的单链cDNA探针
27
《分子生物学检验技术》模块4 · 核酸分子杂交技术
核酸探针
核酸探针（nucleic acid probe)：
• 是特定核苷酸序列（单 链，被标记） • 与靶序列发生特异性互 补（可杂交） • 杂交后可用特殊方法检 测的已知被标记的核酸 分子
17
《分子生物学检验技术》模块4 · 核酸分子杂交技术
核酸探针则特指能与靶核酸序列发生碱基互补 杂交，并能由其标记被特异性检测的核酸分子 • 确定特定核苷酸序列（与靶序列互补） • 标记（检测方法） • 选择探针的最基本的要求 • 高度特异性 • 探针的来源是否方便 • 制备探针的难易程度
– DNA的均一性 – DNA分子中（G+C）含量 （G+C）含量越高，G-C 碱基对越多，Tm 值 越高。
《分子生物学检验技术》模块4 · 核酸分子杂交技术
2. 溶液的离子强度
• 溶液中离子与DNA分子中磷酸基团形成离子键，需要较高 温度才能使DNA变性
• 离子强度较低时，Tm值较低，而且解链的温度范围也较宽
33
《分子生物学检验技术》模块4 · 核酸分子杂交技术
标记探针的纯化
探针制备和标记时加入的dNTP是过量，除去游
离标记物及其dNTP
•凝胶过滤层析法
利用凝胶的分子筛作用
•乙醇沉淀法
沉淀探针DNA
34
《分子生物学检验技术》模块4 · 核酸分子杂交技术
探针的检测 1、放射性同位素探针的检测
（1）放射自显影 将杂交膜与X胶片在暗盒中曝光一定时间；放射性核
2.缺口平移法 （双链）
依赖于DNaseⅠ和 DNA聚合酶Ⅰ的协 同作用
只要标记一种dNTP， 就可以对DNA进行 全程标记。
28
《分子生物学检验技术》模块4 · 核酸分子杂交技术
3、RNA探针标记
School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College
– 基因克隆的方法 – 聚合酶链反应(PCR)
• 特点:
– 克隆在载体中的DNA片段，可无限繁殖，取之不尽 – PCR制备探针简便和省时 – 相对RNA而言，DNA探针不易降解，标记方法也较成熟
20
《分子生物学检验技术》模块4 · 核酸分子杂交技术
cDNA探针 • cDNA（complementary DNA）：是指与mRNA互补的 DNA 分子，是由 RNA 经过逆转录酶催化产生的逆 转录产物。 • 特点:
一级结构
二级结构
高级结构
C A
G
3
《分子生物学检验技术》模块4 · 核酸分子杂交技术
核酸变性与复性
变性（denaturation）:在某些理化因素的作用下，维 系DNA分子二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA由 双螺旋变成单链过程。
4
《分子生物学检验技术》模块4 · 核酸分子杂交技术
• 化学键变化：维持双螺旋稳定的氢键和疏 水键发生断裂，断裂可以是部分的或全部 的，可以是可逆的或是非可逆的 • 化学结构变化：DNA变性改变了其空间结 构，不涉及到其一级结构的改变
核酸杂交示意图
15
《分子生物学检验技术》模块4 · 核酸分子杂交技术
• 杂交的本质：就是在一定条件下使互补核酸链
实现复性
• 分子杂交技术：利用探针（probe）与靶DNA （RNA）杂交，特异性识别靶DNA（RNA）;是 定性或定量检测特异RNA或DNA序列片段的有 力工具 。
16
《分子生物学检验技术》模块4 · 核酸分子杂交技术
22
《分子生物学检验技术》模块4 · 核酸分子杂交技术
寡核苷酸探针
可以是寡聚脱氧核糖核酸、寡聚核糖核酸，也可 以是修饰后的肽核酸。
• 特点 :
– 探针长度较短（一般为10～50bp） – 人工合成（避免天然探针的缺点） – 尤其适合点突变的检测 – 由于探针的长度较短，特异性较低，杂交信号较弱 ， 但经过精心设计仍可设计出非常 特异的寡核苷酸探针
–不存在内含子和高度重复序列，是一种较理想的核酸 探针，尤其是用于基因表达的研究
–排除了RNA酶的影响，现已成为分子生物学实验室的常 规实验
21
《分子生物学检验技术》模块4 · 核酸分子杂交技术
RNA探针
• RNA探针与靶序列的杂交效率较高，稳定性也高
–RNA分子大多以单链形式存在，几乎不存在互补双 链的竞争结合 • RNA分子中不存在高度重复序列，非特异性杂交少， 杂交后未杂交的探针分子可用RNA酶水解去除，本底 的干扰低。 • RNA探针有易降解和标记方法复杂等缺点，限制了其 广泛应用。