人脂联素基因的原核表达、纯化及活性检测

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人脂联素基因的原核表达、纯化及活性检测。

刘德敏杨莉丽丁玉静孙颖于德民

摘要目的：在大肠杆菌中表达具有活性的重组人脂联素蛋白。方法：利用ＰＣＲ技术扩增人脂联素基因完全编

码序列，选用Ｇａｔｅｗａｙ原核表达体系，经过ＢＰ反应、ＬＲ反应两步反应，将ＰＣＲ产物克隆人ｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２质粒，构建

融合表达载体ｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２，ａｔｔＢ—ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ，转化大肠杆菌Ｂ１２１（ＤＥ３），以异丙基硫代一Ｂ—Ｄ一半乳糖苷（ＩＹｒＧ）诱

导表达脂联索融合蛋白，经镍柱亲和层析纯化，ＮＤＳＢ２０１高效复性后，使重组蛋白作用于体外培养的肝细胞，ＲＴ

ＰＣＲ法检测重组脂联素对肝细胞葡萄糖一６一磷酸酶转录水平的影响。结果：成功构建了表达载体ｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２／ａｔｔＢ—

ａｄｉｇｎｎｅｃｔｉｎ，ＤＮＡ序列测定结果与预期一致。ＩＰｒＧ诱导表达的融合蛋白经纯化后ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ鉴定具有人脂联素抗

原性，并可使培养的肝细胞中葡萄糖－６一磷酸酶转录水平下降。结论：获得具有生物学活性的重组人脂联素为进一

步研究脂联素的生理机制奠定了基础。

关键词脂联索克隆，分子基因表达肝细胞重组蛋白质类葡糖一６—磷酸酶大肠杆菌

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ｐｒｏｔｅｉｎｓｇｌｕｅｏｓｅ一６一

ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ

ｅｓｃｈｅｆｉｃｈｉａｃｏｌｉ

人脂联素（ａｄｉｐ（、ｎｅｃｔｉｎ）基因全长１７ｋｂ，位于染色体３ｑ２７，包含３个外显子和２个内含予。该基因编码的脂联素蛋白在血浆中分子质量为２８ｋｕ。脂联素在血循环中含量较高，其血浆浓度约占总血浆蛋白的Ｏ０１％ｒ”。目前，脂联素在调节血糖稳态、抗动脉粥样硬化及抗炎等方面的作用已有较为肯定的认识［２１。脂联素在治疗领域的尝试也已开始，为了能够更好地了解脂联素的结构及作用机制，本研究利用Ｇａｔｅｗａｙ表达系统快速构建了人脂联素原核表达载体，表达并纯化了重组脂联素蛋白。

１材料与方法

１．１材料大肠杆菌ＤＨＳａ及Ｂ１２１（ＤＥ３）均为本实验室保存，质粒ｐＭＤｌ８一Ｔ，ｒＴａｑＤＮＡ聚合酶，ＤＮＡ凝胶回收试剂盒为大连宝生物公司产品。质粒ｐＤＯＮＲ２０１，ｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２以及Ｇａｔｅｗａｙ表达体系均为［ｎｖｉｔｒａｇｅｎ公司产品（澳大利亚新南威尔士大学齐建成教授馈赠）。Ｍ－ＭＬＶ逆转录酶为ｐｍｍｅｇｎ产品。兔抗人脂联素多克隆抗体购自Ｂｉｏｖｅｎｄｏｒ公司；辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记的羊抗兔ｌｇＧ为北京中杉公司产品。蛋白纯化试剂盒以及１６４０培养基为Ｎｏｖｏｇｅｎ公司产品。蛋白复性用ＮＤＳＢ２０１由美国Ｓａｎｔａｃ［ｕｚ公司ＴｏｍｍｉｅＬｅｅＳｔａｄｉｎｇ先生馈赠。异丙基硫代一８一Ｄ一半乳糖苷（Ｉ丌Ｇ），二硫苏糖醇（ＤＷｒ）等均为进口或国产分析纯试剂。

１，２方法

１．２．１人脂肪组织总ＲＮＡ的提取和脂联素基因的克隆新鲜皮下脂肪组织标本取自一行子宫痛切除术且无代谢性疾病者。提取总ＩＬＮＡ。将１ｔｒｇ总ＲＮＡ．７２℃变性２ｍｉｎ后迅速冰浴降温，加入１５此逆转录酶混合液（２ＵＲｎａｓｅ抑制剂，

・天津市教委基金资助项目（项目编号：２００３０２５）；天津市自然科学基金资助项目（项目编号：０４３６０９２１１）

作者单位：３（ｍ０７０天津医科大学代谢病医虢

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