实验十 血糖的测定

实验十血糖得测定

血液中得葡萄糖称血糖。正常人血糖浓度较恒定,维持在3、9mｍoｌ／L～6.1mｍoｌ/L之间、血糖浓度得相对恒定就是机体进行正常生理活动得前提条件之一,有着双重实际意义:其一,维持稳定得能源供给,满足机体在各种生理状态下对能量得需求。其二,保证机体不因进食致血糖浓度过高,导致糖得丢失。

因此,血糖得测定就是临床生化检验实验室得常规检测项目。血糖测定按其发展过程及反应原理得不同,大致分三类:氧化还原法,缩合法(主要有邻甲苯胺法),酶法(主要有己糖激酶法与葡萄糖氧化酶法)。下边介绍两种方法供选择。

一、葡萄糖氧化酶法

【目得】

1。了解葡萄糖氧化酶法测定血糖得原理,能进行血糖测定得操作。

２。掌握血糖测定得临床意义。

【原理】

葡萄糖氧化酶 (ｇlucｏse oｘｉdase,GOD) 能将葡萄糖氧化为葡萄糖酸与过氧化氢。后者在过氧化物酶(perｏxｉｄaｓｅ,POD)作用下,分解为水与氧得同时将无色得４-氨基安替比林与酚氧化缩合生成红色得醌类化合物,即 Tｒiｎｄer 反应。其颜色得深浅在一定范围内与葡萄糖浓度成正比,在505ｎm波长处测定吸光度,与标准管比较可计算出血糖得浓度。反应式如下:

【器材】

试管、吸管、试管架、恒温水浴箱、分光光度计

【试剂】

1。 0。1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)

称取无水磷酸氢二钠8。６７g及无水磷酸二氢钾5。３g溶于80０ｍｌ蒸馏水中,用１mol／Ｌ氢氧化钠(或1moｌ／L盐酸)调节pH至７.0,然后用蒸馏水稀释至１L。

2. 酶试剂

称取过氧化物酶１2０0U,葡萄糖氧化酶1200U,4-氨基安替比林１0mg,叠氮钠1０0mg,溶于上述磷酸盐缓冲液80ml中,用１mol/L NaOH调pＨ至7、0,加磷酸缓冲液至１０0ml。置冰箱保存,4℃可稳定3个月。

3。酚溶液

称取重蒸馏酚100mg溶于１00mｌ蒸馏水中(酚在空气中易氧化成红色,可先配成５

00g/L得溶液,贮存于棕色瓶中,用时稀释),用棕色瓶贮存。

4、酶酚混合试剂

取上述酶试剂与酚溶液等量混合,4℃可以存放一个月。

5、 12ｍmol/L苯甲酸溶液

溶解苯甲酸1.４g于蒸馏水约８00ｍl中,加温助溶,冷却后加蒸馏水至1Ｌ。

6.葡萄糖标准贮存液(10０mmｏｌ/L)

称取已干燥恒重得无水葡萄糖１.80２ｇ,溶于12mmol／L苯甲酸溶液约70ml中,并移入100ｍｌ容量瓶内,再以12mｍol/Ｌ苯甲酸溶液加至100ml。

７。葡萄糖标准应用液(5mmol/L)

吸取葡萄糖标准贮存液5.0ml 于100ｍl 容量瓶中,加１2ｍｍol／L 苯甲酸溶液至刻度。

【操作】

取3 支试管,编号,按下表操作。

表3—12 血糖测定操作步骤

加入物 (ml) 空白管标准管测定管

血清－—0、０２

葡萄糖标准液－0、02 -

蒸馏水0、02 －－

酶酚混合液3、0 ３、0 3、0 混匀,置37 ℃水浴中保温１5分钟,在波长 505nm 处比色,以空白管调零,读取标准管及测定管吸光度、

【计算】

测定管吸光度

血糖(ｍmｏl/L)＝×5

标准管吸光度

【注意事项】

１.测定结果如超过２0mｍｏl／L,应将标本用生理盐水稀释后再测定,结果乘以稀释倍数。

2.若酶酚混合试剂呈红色,应弃之重配、因标本与标准用量少,其加量就是否准确对测定结果影响较大,故其加量必须准确。

3.GＯＤ—POD法得第一步反应特异性高,而由POD催化得第二步指示反应就是非特异性得,易受标本中尿酸、维生素C、谷胱甘肽、胆红素等还原物得干扰,这些物质与色素原

竞争H20２,使测定结果偏低、

4。Triｎdｅr反应由Trindeｒ于19６９年提出。后经许多学者改进,采用2,４—二氯酚、2—羟—３,５—二氯苯磺酸等代替苯酚,由于这些化合物氧化生成得色素得摩尔吸光系数均高于苯酚,使反应灵敏度得以提高、

【正常参考范围】

3。9～6、1mmol/Ｌ

【临床意义】

1. 生理性高血糖可见于摄入高糖饮食或注射葡萄糖后,或精神紧张、交感神经兴奋,肾上腺分泌增加时。

2. 病理性高血糖

⑴糖尿病:病理性高血糖常见于胰岛素绝对或相对不足得糖尿病患者。

⑵对抗胰岛素得激素分泌过多:如甲状腺功能亢进、肾上腺皮质功能及髓质功能亢进、腺垂体功能亢进、胰岛α—细胞瘤等。

⑶颅内压增高:颅内压增高(如颅外伤、颅内出血、脑膜炎等)刺激血糖中枢,出现高血糖。

⑷脱水引起得高血糖:如呕吐、腹泻与高热等也可使血糖轻度增高。

3。生理性低血糖饥饿或剧烈运动、注射胰岛素或口服降血糖药过量。

４。病理性低血糖

⑴胰岛素分泌过多:由胰岛β细胞增生或胰岛β细胞瘤等引起。

⑵对抗胰岛素得激素分泌不足:如腺垂体功能减退、肾上腺皮质功能减退与甲状腺功能减退等。

⑶严重肝病患者:肝贮存糖原及糖异生功能低下,不能有效调节血糖。

【结果及分析】

【思考题】

1、血糖有哪些来源与去路,机体就是如何调节血糖浓度恒定得?

２。酶试剂为什么要用磷酸缓冲液配制,用蒸馏水就是否可以,为什么?

二、邻甲苯胺法

【目得】

了解测定血糖得原理与方法,要求在实验中培养学生严谨得作风与准确地进行实际操作得能力。

【原理】

葡萄糖在热得醋酸溶液中与邻甲苯胺缩合生成葡萄糖邻甲苯胺,后者脱水生成雪夫

(Ｓcｈｉｆf)碱,再经结构重排,生成有色化合物、颜色得深浅与葡萄糖含量成正比。其反应式如下:

葡萄糖+ 邻甲苯胺葡萄糖邻甲苯胺

-H2O

葡萄糖邻甲苯胺雪夫碱

【器材】

试管、吸管、试管架、恒温水浴箱、分光光度计

【试剂】

1、邻甲苯胺试剂

于9４0mｌ冰醋酸中加入硫脲1。5g, 邻甲苯胺6０mｌ,混合,直至硫脲完全溶解,置棕色试剂瓶中,室温保存。新配试剂应放置２４小时后(待老化)使用。此试剂腐蚀性强,避免接触皮肤,应用自动吸管加液。

2.12ｍｍol/L苯甲酸溶液

于9０0ml 蒸馏水中加入苯甲酸1。４g,加热助溶,冷却后置于1L容量瓶中,加蒸馏水至刻度、

3.葡萄糖标准储存液(100mmol/L)

称取无水葡萄糖(预先置80℃烤箱干燥至恒重,移置干燥器内保存)１．802g,溶解于8０ml苯甲酸溶液中,移置1０0ml容量瓶中,再加苯甲酸溶液至刻度。

4、葡萄糖标准应用液(5mmoｌ／L)

取葡萄糖标准储备液5ml,置于1００ｍl容量瓶中,加苯甲酸溶液至刻度。

【操作】

1。取１6×150mｍ试管３支按下表进行操作:

表3-１3 血糖测定操作步骤

试剂(ml) 测定管标准管空白管

血清或血浆0.1 ——

葡萄糖标准应用液—0、1 —

蒸馏水——０、１

邻甲苯胺试剂3、0 3。0 3.0

2、将上述各管混匀放入沸水浴中加热12分钟,取出用自来水冷却5分钟、注意在煮沸时水浴中得水面必须高于试管内得液面。否则则温度不均而影响比色。

3.用波长６30nm分光光度计进行比色,空白管调零点,读取测定管与标准管吸光度。