细菌鉴定程序流程图
细菌—细菌的鉴定(水产微生物课件)
任务五 细菌的鉴定
一、细菌的鉴定 （三）细菌鉴定的主要方法 2. 分子分类法 （1）氨基酸顺序和蛋白质分析 （2）DNA碱基序列 （3）核酸杂交
任务五 细菌的鉴定
一、细菌的鉴定 （三）细菌鉴定的主要方法 3. 血清学试验和噬菌体分型 （1）血清学试验：生物体外进行不同细菌之间抗原与抗体反应试验，主要适用于抗原结构同源程度 高的细菌种内以及个别属内血清型的分类鉴定。 （2）噬菌体分型：噬菌体对宿主的感染和裂解作用常具有高度的特异性。
任务五 细菌的鉴定
二、细菌的分类与命名 （二）细菌的命名 采用生物学双命名法，用属名（在前，第一个字母大写）和种名（在后，小写）进行命名。如结核 分枝杆菌的学名是Mycobacterium tuberculosis
作业
1. 名词解释：荚膜，芽孢，菌落，纯培养，培养基。 2. 细菌的基本结构和特殊结构有哪些？ 3. 按照培养基的物理状态，培养基分为哪几种类型？ 4. 试述细菌各个生长时期的特点。 5. 培养基制备的原则。
任务五 细菌的鉴定
一、细菌的鉴定 （一）鉴定的依据
1. 形态特征 2. 生理生化特征 3. 血清学反应 4. 遗传学特征
任务五 细菌的鉴定
一、细菌的鉴定 （二）细菌的鉴定步骤
1. 获得该菌种的纯培养物 2. 查找权威的鉴定手册 目前国际上公认和普遍采用的细菌分类系统是《伯杰氏细菌学鉴定手册》1923年出版，至1994 年经过几次修订，已经出版了第九版。详细列出了细菌生态学、增值、分离培养和保藏等方法。
细菌鉴定流程
细菌鉴定流程细菌鉴定细菌形态学鉴定16S rDNA 鉴定生理生化鉴定一、细菌形态学鉴定1.从-80˚Ϲ冰箱中取出菌株放4˚Ϲ复苏，轻柔混匀后用接种环接一环菌液在培养基平板上划线活化，根据菌株来源选择适宜的培养基。
2.放入培养箱倒置培养，实验室一般采用28˚Ϲ培养，特殊菌株依据该菌最适条件（时间、温度）培养24-48h。
3. 纯化：从活化培养基平板上挑取单菌落继续划板培养。
4. 观察记录菌落形态特征：大小（mm）、形状、干湿、透明度、颜色、边缘整齐还是，，，，，，，形状干湿透明度颜色边缘细菌大小（mm）注意事项：①接种划线应在酒精灯旁边操作②培养时应倒置培养，防止污染二、革兰氏染色1.涂片固定将纯化后的菌株进行革兰氏染色，滴一滴生理盐水于载玻片上，无菌条件下用接种环挑取少量菌落均匀涂布水滴中，使其自然干燥，菌面向上，经火焰固定。
注意事项：菌液涂片时不可过于浓厚，干燥、固定。
固定时通过火焰1~2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
2.染色一般包括初染、没染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：（1）加上结晶紫后，染色1分钟，水洗。
（2）加上碘液染色1分钟，水洗。
（3）加上95%酒精，摇动玻片，根据涂片厚度，脱色约20~60秒，水洗，吸去水分。
（4）加上蕃红后，染色1分钟，水洗。
（5）吸干或在空气中晾干后，油镜镜检。
3.结果观察：革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。
以均匀分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，都常呈现假阳性。
注意事项：①标本涂片不能太厚，严格按操作要求进行。
若涂片较厚，应延长脱色时间，直至不再出现紫色为止。
②玻片通过火焰温度不能太高。
③碘液变透明，则不能使用。
④水洗时动作要轻，沿载玻片对角线方向用洗瓶冲洗，以免把菌体冲掉。
三、16S rDNA 鉴定（16S rDNA只能鉴定到属，需进行生理生化、药敏实验等鉴定到种）1. 细菌复苏、活化、纯化同细菌形态学鉴定3. 挑取单菌落至少2-3个接到含有1ml灭菌纯水的1.5ml离心管中混匀。
手工法细菌鉴定简易操作程序
SOP_15-14 手工法细菌鉴定简易操作程序
细菌鉴定简易程序(手工法）
说明：
1、该表为简易鉴定，仅为鉴定提供大致方向，有些细菌并未包括进来，表中《规程》为第三版《全国临床检
验操作规程》，所有鉴定该书为准。
2、葡萄球菌属可使用杭州天和公司《葡萄球菌属鉴定编码册》（TH-16S ）
3、β溶血性链球菌使用链球菌乳胶凝集进行分群
4、肠杆菌科细菌使用杭州天和公司《肠杆菌科鉴定编码册》（15e 或11e ）
5、 弧菌科、气单胞、邻单胞使用杭州天和公司《弧菌科细菌鉴定编码册》（GYZ-9V ）
6、非发酵菌杭州天和公司《非发酵菌鉴定编码册》（15n 或11n ）。
分子生物学鉴定细菌的方法具体操作步骤与注意事项
16S rDNA鉴定细菌的方法细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分：1.提取细菌基因组DNA,2.设计/选择引物进行PCR扩增，电泳检测纯度与大小。
3.琼脂糖凝胶电泳分离4.胶回收目的片段5.目的片段测序。
6.BLAST比对获取相似片段。
7.构建系统进化树试剂：1、培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基（培养基组分过于复杂会影响DNA 的提取效果，也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。
）。
2、1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)（1L）：121.1g Tris，加浓盐酸约（70ml, 60ml, 42ml），高温高盐灭菌后，室温保存。
冷却到室温后调pH，每升高1℃，pH大约下降0.03个单位。
3、0.5M EDTA（pH8.0）（1L）：186.1g Na2EDTA•2H2O，用NaOH调pH至8.0（约20g）,高温高压灭菌，室温保存。
4、10×TE Buffer(pH7.4，7.6，8.0)（1L）：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。
1M Tris-HCl （pH7.4，7.6，8.0）取100ml，0.5M EDTA（pH8.0）取20ml。
高温高压灭菌，室温保存。
1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。
5、10%SDS（W/V）：称10g，68℃加热溶解，用浓盐酸调pH至7.2。
室温保存。
用之前在65℃溶解。
配置时要戴口罩。
6、5M NaCl：称292.2gNaCl，高温高压灭菌，4℃保存。
7、CTAB/NaCl（10%CTAB，0.7M NaCl）：溶解4.1g NaCl，加10g CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），加热搅拌。
用之前在65℃溶解。
8、氯仿/异戊醇：按氯仿：异戊醇=24：1（V/V）的比例加入异戊醇。
9、酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：按苯酚与氯仿/异戊醇=1：1的比例混合Tris-HCl平衡苯酚与氯仿/异戊醇。
细菌鉴定流程
细菌鉴定流程细菌鉴定细菌形态学鉴定16S rDNA 鉴定生理生化鉴定一、细菌形态学鉴定1.从-80˚Ϲ冰箱中取出菌株放4˚Ϲ复苏，轻柔混匀后用接种环接一环菌液在培养基平板上划线活化，根据菌株来源选择适宜的培养基。
2.放入培养箱倒置培养，实验室一般采用28˚Ϲ培养，特殊菌株依据该菌最适条件（时间、温度）培养24-48h。
3. 纯化：从活化培养基平板上挑取单菌落继续划板培养。
4. 观察记录菌落形态特征：大小（mm）、形状、干湿、透明度、颜色、边缘整齐还是，，，，，，，形状干湿透明度颜色边缘细菌大小（mm）注意事项：①接种划线应在酒精灯旁边操作②培养时应倒置培养，防止污染二、革兰氏染色1.涂片固定将纯化后的菌株进行革兰氏染色，滴一滴生理盐水于载玻片上，无菌条件下用接种环挑取少量菌落均匀涂布水滴中，使其自然干燥，菌面向上，经火焰固定。
注意事项：菌液涂片时不可过于浓厚，干燥、固定。
固定时通过火焰1~2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
2.染色一般包括初染、没染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：（1）加上结晶紫后，染色1分钟，水洗。
（2）加上碘液染色1分钟，水洗。
（3）加上95%酒精，摇动玻片，根据涂片厚度，脱色约20~60秒，水洗，吸去水分。
（4）加上蕃红后，染色1分钟，水洗。
（5）吸干或在空气中晾干后，油镜镜检。
3.结果观察：革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。
以均匀分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，都常呈现假阳性。
注意事项：①标本涂片不能太厚，严格按操作要求进行。
若涂片较厚，应延长脱色时间，直至不再出现紫色为止。
②玻片通过火焰温度不能太高。
③碘液变透明，则不能使用。
④水洗时动作要轻，沿载玻片对角线方向用洗瓶冲洗，以免把菌体冲掉。
三、16S rDNA 鉴定（16S rDNA只能鉴定到属，需进行生理生化、药敏实验等鉴定到种）1. 细菌复苏、活化、纯化同细菌形态学鉴定3. 挑取单菌落至少2-3个接到含有1ml灭菌纯水的1.5ml离心管中混匀。
细菌分离与鉴定方法ppt课件
在干净的培养皿中放一张滤纸，滴上二甲基对本二胺的1%水溶 液，仅使滤纸湿润即可，不可过湿。用白金丝接种环（不可用镍 铬丝）取18～24小时的菌苔，涂抹在湿润的滤纸上，在10s内涂 抹菌苔现红色者这为阳性，(四甲基对本二胺呈蓝色)，10～60s 现红色者为延迟反应，60s以上现红色者不计，按阴性处理。
细菌分离与鉴定方法
—嗜水气单胞菌分离鉴定
分离方法
细菌的生长状况观察
氧化酶试验
AHM鉴别培养
吲哚试验
革兰氏染色法
糖发酵试验
脱脂奶平板试验（酪蛋白胨可化编试辑课验件 ）
1
分离方法
用途:
• 在检查含两种或两种以上的待检材料（如肝、脾、肾、 心、肌肉等）中的某种细菌时，须先将待检材料进行 分离培养。常用的分离培养方法是琼脂平皿分区划线 法，是借划线将混杂的细菌在琼脂平皿表面分散开来， 使个别的细菌能固定在某一点，经培养生长繁殖后形 成单个菌落，以达到分离获得纯种细菌的目的。
可编辑课件
2
分离方法
具体操作方法如下：
• 点燃酒精灯，右手执笔式握持接种环（见图1），在酒精灯火焰上烧灼接种环， 待冷，取待测菌液一环。
• 左手抓握琼脂培养基平皿，用手掌将平皿的底固定，用手指将平皿的盖略抬
起一些，进行接种（见图2）。或者，将平皿的盖留在实验台上，尽量直立平
皿靠近酒精灯火焰，右手持接种环在琼脂表面的一端（即1区，约占整个平皿
• （1）取载玻片一张，试净。
• （2）用灭菌的接种环取生理盐水一滴，放于载玻片的中央（如被检材料是液体，可 不加生理盐水）。
• （3）左手斜持菌种管，右手将菌种管棉塞稍加转动，以便拔下。
• （4）右手持接种环，经火焰灭菌后，用右手小指拔开菌种管棉塞，管口通过火焰， 用接种环取少量菌（切不可过多）。
传统细菌鉴定程序
传统细菌鉴定标准操作程序1. 检验目的规范细菌手工鉴定程序，确保鉴定结果可靠。
2. 菌株要求2.1 分离菌为临床感染病原菌或可疑病原菌，才需要鉴定。
2.2 纯的菌落3. 鉴定方法3.1 革兰染色特征3.2 表型特征生长特征包括营养要求、生长速度，溶血表现，色素产生等。
生物化学特征包括对糖、醇、苷、无机盐类、氨基酸的利用情况，酶的产生等。
3.3 分子生物学特征种属特异基因、16sRNA3.4 三种特性的综合应用，按科、属、种的顺序鉴定。
4. 鉴定步骤4.1 革兰染色：明确革兰染色特性，观察菌体形态，可据此将培养物分为革兰阴性杆菌、革兰阴性球菌、革兰阳性杆菌、革兰阳性球菌、酵母（样）菌。
4.2 需氧革兰阴性杆菌的鉴定4.2.1 羊血平板上生长良好的G-R：可以直接上鉴定板鉴定4.2.2 羊血平板上生长不良或不生长的G-R：依据表1鉴定。
4.3 氧革兰阴性球菌的鉴定：革兰阴性球菌主要是奈瑟球菌和卡他莫拉菌，依据生长特性、氧化酶、糖的利用和DNA酶，按表2鉴定。
菌属细菌形态氧化酶触酶葡萄糖产酸奈瑟球菌双球菌/杆菌＋＋V布兰汉氏球菌双球菌＋＋－金氏菌球杆菌＋－＋莫拉氏菌杆菌＋＋－4.4 需氧革兰阳性杆菌的鉴定：鉴定可依据生长特性、菌体大小、是否规则、有无芽孢、触酶等按表3鉴定4.5 需氧革兰阳性球菌的鉴定：可以直接上鉴定板鉴定表1羊血平板上生长不良或不生长的G-R鉴定表表2革兰阴性球菌的鉴定表3需氧革兰阳性杆菌鉴定表4.6 酵母样真菌的鉴定4.6.1 墨汁染色：任何圆形或卵圆形的出芽酵母都应该进一步检测其有无荚膜。
滴一小滴印度墨汁在盖玻片的边缘，使其在盖玻片下扩散，在黑色的背景下可清楚的看到酵母细胞的周围环绕着一圈明亮的区域，这就是粘多糖荚膜。
荚膜的存在不能确定这个酵母是不是新型隐球菌，其它的隐球酵母、红酵母和稀有的假丝酵母也产生荚膜。
事实上，任何从脑脊液中分离的，不含色素的圆形的，被荚膜包裹的酵母都应被认为是新型隐球菌。
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革兰氏阳性球菌、革兰氏阴性杆菌、革兰氏阳性杆菌鉴定程序流程图
一、临床常见革兰氏阳性球菌的鉴定
6.5%NaCL
触
葡萄糖
分群
②－ ②+/－ 草 绿
色
链
球 菌
D 群 链 球 菌
血浆凝固酶
DNA 酶肠球菌属 气球菌属 精氨酸
＋
－
革兰氏阳性球菌 需氧培养 溶血溶血溶血 ①OP ①杆菌肽 ①胆汁七叶苷 ②胆汁七叶苷 ②CAMP ②6.5NaCI ③6.5%NaCI ③胆汁七叶苷
②－ ②－ ②＋ ③－ ③－ ③＋/－ ①＋②＋③＋均－A 群 B 群 D 群 其他 链球菌
肺炎链 草绿色链 D 群链球 球菌
气球菌属
山梨醇
坚忍肠球菌
①阿拉伯糖②甘露醇③山梨醇
粪肠球菌 屎肠球菌 坚韧肠球菌 表皮葡萄球菌 （新生霉素S ） 腐生葡萄球菌 （新生霉素R ）
+
非肠球菌属
乳糖 甘露醇
马肠链球菌
二、临床常见革兰氏阴性杆菌鉴定见图
观察平板上菌落特征（特殊形态、漫延生长、拉丝、溶血、荧光、色素等）
②— 革兰氏阴性杆菌 氧化酶（—） KIA 葡萄糖O/F
O/-） 肠杆菌科 动力①苯丙氨酸②VP 试验②－ ②－
②麦芽糖迅速分解 ③甘露醇
④DNA 酶 （G-球杆菌） （25%
氧化酶+）②＋ ②－ ③－ ③+
④＋ ④－ 嗜麦芽窄 食单胞菌 洋葱伯克 霍尔德氏菌
（93%氧化酶阳性）
埃希菌属 变形杆属菌 克雷伯氏菌属
志贺氏菌属 （漫延生长） （动力-）
沙门氏菌属 普罗威登氏菌属 沙雷氏菌属
枸橼酸杆菌属 摩根摩根氏菌 （DNA 酶+） 迟缓爱德华菌 (吲哚+，尿素+， 哈夫尼亚菌属
耶尔森氏菌属 糖醇反应差） （蜂房哈夫尼亚）
（G-短小杆菌 肠杆菌属
37℃动力（—）
25℃动力（+）
尿素（+）4℃生长 糖醇分解/黄色素
阴沟肠杆菌聚团多源菌 产气肠杆菌 板畸肠杆菌
革兰氏阴性杆菌
氧化酶（+） KIA 葡萄糖O/F
O/-） 弧菌科
动力①嗜盐试验 ②肌醇 ③O/129敏感试验
④TCBS 生长 （端鞭毛）
（菌落产生 亮黄色色素）
莫拉氏菌 （G-球杆菌，
SS 不生长， 菌落细小， 不分解任何
糖类）
①－ ①－ ①＋/－ ②－ ②＋ ②－ ④－ ④－ ④＋
③R ③S/R ③S 气单胞菌属 邻单胞菌属 弧菌属 （76%有β溶血） （无β溶血）
（周鞭毛， 蛋白胨肉汤 中PH8.6以上
不分解任何糖 类）
三、临床常见革兰氏阳性杆菌鉴定
革兰氏阳性杆菌 抗酸染色
（18℃--20℃有动力，倒
伞形，狭窄溶血环,H 2
02+）
李斯特氏菌
＋ － ＋/－
＋
＋ － 普通血平板生长
芽胞杆菌
梭状 奴卡氏菌 （血平板呈粉末状 生长，菌落不易挑 起，有菌丝）
（G+着色不匀，有异染 颗粒，毒力试验阳性， 结合临床症状考虑 是否为白喉棒状杆菌）
红斑丹毒丝菌 （G 染色易脱色，
H 2S+ 感染特征）
丙酸杆菌
棒状杆菌
红斑丹毒丝菌
糖分解/触酶。