EBVLMP2A和BZLF1融合基因重组腺病毒表达载体的构建

EBV LMP2A和BZLF1融合基因重组腺病毒表

达载体的构建

【摘要】目的构建EB病毒（EBV）潜伏膜蛋白2A(LMP2A)编码基因和即刻早期基因(BZLF1)融合基因的重组腺病毒表达载体。方法逆转录聚合酶链反应分别获得LMP2A和BZLF1编码序列的cDNA，采用剪接式重叠延伸（SOE）技术将两段基因通过多肽接头(Gly4Ser)3 的DNA 序列进行连接，构建融合基因Z2A。将融合基因Z2A定向亚克隆到pAdTrack CMV 质粒上，在原核细胞E.coli BJ5183中完成穿梭质粒与骨架质粒pAdEasy1的同源重组，构建融合基因Z2A真核表达载体pAd Z2A。经抗生素培养板筛选重组体，然后转染293细胞，获得复制缺陷型重组腺病毒vAd Z2A。结果重组腺病毒载体经限制性核酸内切酶酶切，电泳后可观察到长31 kb和4.5 kb 两条DNA条带，测序鉴定结果表明序列正确；从感染重组腺病毒vAd

Z2A的293细胞中检测到融合基因Z2A的表达。结论本研究成功地构建了EBV LMP2A和BZLF1融合基因Z2A重组腺病毒表达载体，为进一步研究Z2A的功能提供了实验基础。

【关键词】疱疹病毒4型人潜伏膜蛋白2A 基因BZLF1 基因融合表达载体

［ABSTRACT］ObjectiveTo construct Z2A recombinant adenovirus vector and study the effect of Z2A expression on EBV associated tumor. MethodsBoth LMP2A and BZLF1 cDNA were cloned from B958 cell line by RT PCR, and the fusion gene (LMP2A linker BZLF1) was

constructed by using a polypeptide linker (Gly4Ser)3. Z2A vector pAd

Z2A was constructed by inserting the Z2A fusion gene into pAd easy1 eukaryotic expressing plasmid, 293 cells were transfected with pAd Z2A. ResultsThe electrophoresis of EcoRV and BglⅡdigested products showed two DNA fragments which were 31 kb and 4.5 kb, respectively. The result of DNA sequencing demonstrated that Z2A had inserted in the expected site and the insertion sequence was exactly correct. The results showed that Z2A positive recombinant adenovirus could express Z2A. ConclusionZ2A recombinant adenovirus vector has been constructed and can be used for further research.

［KEY WORDS］herpesvirus 4, human; LMP2A; gene, BZLF1; gene fusion; expression vector

EB病毒（EBV）是具有B淋巴细胞嗜性的疱疹病毒，为重要的DNA致瘤病毒，与多种人类恶性肿瘤,如Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌（NPC）、何杰金病、免疫缺陷病人的B淋巴细胞瘤、胃癌及肝癌等的发生有关。EBV对宿主细胞的感染有潜伏感染和裂解期感染两种类型。研究表明，EBV阳性癌组织中主要以潜伏感染的形式存在，EBV 基因组存在于几乎所有的癌细胞，因此可以EBV基因组或编码产物为靶点对EBV相关肿瘤进行特异性治疗[1～3]。本研究拟将EBV潜伏膜蛋白2A(LMP2A)编码基因和即刻早期基因(BZLF1)进行融合，进而构建融合基因的重组腺病毒表达载体，为进一步探讨融合基因表达对EBV阳性肿瘤细胞增殖的影响提供实验基础。现将结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 主要试剂、质粒和细胞株

本文T4 DNA连接酶、λDNA/HindⅢ、DL2000 Marker、限制性内切酶EcoRⅤ、BglⅡ均购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA转染试剂盒lipofectamine 2000 购自Invitrogen公司；质粒提取试剂盒为Promega公司产品。携带GFP报告基因的腺病毒穿梭质粒pAdTrack CMV，E1 区和E3 区缺失的复制缺陷5型腺病毒骨架质粒pAdeasy 1，大肠杆菌BJ5183和DH10B以及人胚肾293细胞由中国疾病控制中心性病艾滋病中心病毒免疫室邵一鸣教授惠赠。EBV阳性B95

8细胞系日本鸟取大学医学部生体情报学教室西连寺刚教授惠赠。

1.2 引物设计

根据LMP2A和BZLF1开放读码框序列[4，5]，DNAStar软件设计扩增EBV LMP2A和BZLF1基因的特异性引物，并在LMP2A上游引物的5′端引入BglⅡ酶切位点和保护性碱基GGC，下游引物3′端删除终止密码TAA，引入linker；BZLF1下游引物5′端引入EcoRⅤ酶切位点和保护性碱基GC，上游引物3′端引入linker。linker(Gly4Ser)3为编码15个氨基酸组成的疏水性多肽的DNA序列，序列为5′GGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGA AGCGGCGGTGGCGGCAGC3′。LMP2A上游引物P1序列为：5′GGCAGATCTATGGGGTCCCTAG AAATGGTG3′，下游重叠引物P2序列为：5′GCT GCCGCCACCGCCGCTTCCGCCACCGCCGCTTC