腺病毒载体构建

二、小的穿梭质粒，其带有 目的基因的表达盒以及表达 盒两侧的与大质粒上的目的 基因拟插入部位同源序列 （左右臂）
AdEasy腺病毒载体系统
稳定 性高 腺病毒粒子相对稳定，插入外源基因的病毒基因组在 连续传代中保持不变，易于用重组DNA技术操作。 可转入分裂后的非分裂细胞中发挥作用，可以感染处 于分裂状态的细胞。 可经不同途径进入不同组织(可以在肠道内繁殖，也可 以 在呼吸道内繁殖。
逆转录病毒
可以，但很难 中 不可以 可以
基因过表达
包装容量大，可以 满足较大基因的包 装，是过表达基因 的优选工具
1、体外基因转导 2、基因治疗
包装容量有限，过 包装容量有限，过 表达的基因过大时 表达的基因过大时 病毒滴度受到影响 病毒滴度受到影响
同上 体外基因转导，突 变筛选，功能基因 库构建
常见应用
腺病毒 是一种大分子线性双链无包膜DNA病毒。它 通过 受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病 毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整 合进入宿主细胞基因组中.
腺病毒的基因及其功能
ITR Ψ E1a/E1b E2 E3 E4 ITR
腺病毒基因组编码数十个腺病毒的结构和功能蛋白，分为早期表达和晚 期表达。 早期表达的蛋白是功能蛋白，晚期表达的有功能蛋白也有结构蛋白，并 且早期的功能蛋白能够调控晚期蛋白的表达。 早期表达的E1区蛋白（甚至包括E2区蛋白）是腺病毒基因组复制、病毒 包装和其他蛋白表达翻译所必须的，但其对细胞毒性也是很强的。 E2蛋白涉及AdDNA复制 E3蛋白对抗宿主的抗病毒防御系统 E4蛋白调节有效的晚期基因转录
慢病毒表达系统 单链RNA <8kb 有，病毒基因组整 有 合到宿主基因组， 长时间、稳定表达 外源基因 中 慢（2-4天） 中
逆转录病毒 单链DNA <6kb
表达丰度 表达时间
快（1-2天）
感染细胞类型
滴度U/ml
分裂和不分裂细胞
1012
分裂和不分裂细胞，分裂cell，但在干 适用于难转染细胞 细胞中表达效率低
宿主范 围广
感染 性 强
包装容量 改建腺病毒基因部分缺失载体的克隆容量可达10kb， 大 腺病毒基因完全缺失载体克隆容量可达ห้องสมุดไป่ตู้7kb。 安全性好 无需整合进宿主细胞基因组中，目的基因在宿主细胞 基因组外游离状态下表达，整合突变致癌可能性小。
腺病毒表达系统 病毒基因组组成 载体容量 基因整合功能 双链DNA <8kb 无，病毒基因组游 离于宿主基因组之 外，瞬时表达外源 基因 高水平表达 快（1-2天）
109
TET-ON,TET-OFF
109
四环素诱导系统
毒性作用
不可以
细胞毒性
不可以
遗传毒性
遗传毒性
腺病毒表达系统
免疫原性 动物模型 安全系数 能否用于miRNA RNAi 高免疫原性 不能得到转基因动 物 高 可以 病毒进入细胞往往 引起细胞内干扰素 反应，不适合做 RNAi实验
慢病毒表达系统
低免疫原性 可产生转基因动物 高 可以 适合，是优选工具 低
腺病毒
• 腺病毒 Adenovirus 最初由人类腺样增殖体组织培养中分 离得到的，此病毒名称也由此而来。质粒是直径约70毫微 米的正二十面体，各顶点具有突起。结构亚基总数为252 个。核酸是双链DNA，分子量20—25×106。无包膜。在被感 染的细胞核中增殖，病毒蛋白在细胞质内合成，再输送到 细胞核。 • 腺病毒可见于人、鸡、牛、狗、鼠、猪和猴中，并各自具 有严格的寄主特异性，不感染他种动物。对人类可引起感 冒症状、呼吸系统不适等。
载体。产生的免疫反应较弱，其安全性和载体容 量有所改进，但病毒包装难度和出毒滴度下降厉 害，应用局限。
第三代腺病毒载体：缺失了全部的（无病毒载体等）或大部分腺病毒
基因，仅保留ITR和包装信号序列。这一载体系 统需要一个腺病毒突变体作为辅助病毒。
腺病毒载体大多以5型（Ad5）、2型（Ad2）为基础
重组系统由2种质粒 构成：一、包含全 部（或右侧大部分） 腺病毒基因组DNA 的大质粒，即骨架 质粒
腺病毒分类
第一代腺病毒载体：一般将E1或E3基因缺失的腺病毒载体成为一代
载体。此类型载体在未纯化时可引发机体产生较 强的炎症反应和免疫反应，纯化后可安全使用， 体内表达周期可达4周。（科研、临床应用最广 泛 ，一般常用Ad5型腺病毒）
第二代腺病毒载体：一般将E2A或E4基因缺失的腺病毒载体成为二代