腺病毒载体的构建

第四章SOCS2腺病毒载体的构建 1

腺病毒载体的构建

由第三章结果可知，基础状态下SOCS2在脂肪细胞中的表达水平较低，但是GH 可以诱导SOCS2稳定高表达。SOCS2高表达的同时，GH诱导的脂肪细胞分化因子和脂质代谢基因表达发生了变化。为了研究SOCS2对GH调控脂肪细胞分化与脂质代谢的影响，需要通过一种途径实现SOCS2在脂肪细胞中持续高表达。细胞导入外源基因是目前常用的方法，但是保证外源基因的高效表达需要合适的表达系统。目前常用的有质粒、逆转录病毒、蔓病毒、腺病毒等外源基因表达系统。质粒载体可以导入外源基因，但是质粒的转染效率很低，如何把目标基因导入靶细胞转录产物是质粒系统的最主要的问题。逆转录病毒可以把目标基因整合到靶细胞基因组永久表达，但是逆转录病毒只能感染增殖期的细胞。蔓病毒本身对脂肪细胞的感染率又比较低。而腺病毒滴度高，适合外源基因大量表达，并且可插入较大的目的片段，对细胞类型限制较小，可感染非分裂期的细胞(V orburger SA and Hunt KK 2002)。另外腺病毒载体系统中pAdEasy系统操作比较简单(Luo JY et al. 2007)。本章克隆SOCS2基因，采用pAdEasy系统构建pAd-SOCS2载体，为SOCS2在脂肪细胞中高效表达，研究SOCS2对GH调控脂肪细胞分化与脂质代谢的影响奠定基础。

4.1材料

4.1.1 样品、菌株、质粒及细胞株

脂肪组织取自6周龄昆白小鼠，小鼠购自第四军医大；E.coli DH5α菌株由本实验室保存；pAdTrack-CMV和pAdEasy-1质粒，E.coli BJ5183菌株由猪脂肪沉积与肌肉发育实验室赠送；人胚肾细胞株HEK293购于中国科学研究院上海细胞资源中心。

4.1.2 主要试剂

限制性内切酶BglⅡ、XhoⅠ和蛋白Marker购自Fermentas公司；内切酶PmeI和PacI购自NEB公司；pMD TM18-T克隆载体、碱性磷酸酶CIPA购自Takara公司；穿梭质粒小提试剂盒购自Omega公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购自Bioflux公司；λ/Hin dIII Marker购自天根公司；OptiMem优化培养液购自Gibico公司；脂质体Lipofectamine TM 2000购自Invitrogen公司。载体测序和引物合成均由南京金斯瑞生物公司完成，其余材料和试剂来源同3.1。

4.2 试验方法

4.2.1 SOCS2基因克隆

4.2.1.1组织中总RNA提取

根据Takara RNAiso Plus试剂说明提取组织中总RNA：

4.2.1.2 cDNA第一链合成

同3.2.6

提取的总RNA反转录为总cDNA，表3-1为反应体系和操作流程：

表3-1 cDNA第一链合成体系及操作过程

Table 3-1 RevertAid TM First Strand cDNA Sythesis system and operation protocol

反转录合成cDNA第一链

总RNA 1.5 μL

Primer：Oligo（dT）18 primer 1 μL

DEPC处理水9.5 μL

轻微震荡混匀，65℃孵育5min，冰上冷却2min；瞬时离心收集反应液，置于冰上，按顺序加入以下试剂：

5×反应缓冲液 4 μL

RiboLock TM 核糖核酸酶抑制剂（20 u/μL） 1 μL

10 Mm dNTPs混合物 2 μL

RevertAid TM M-MuLV反转录酶（200 u/μL） 1 μL

瞬时离心收集反应液，25℃孵育5min，42℃孵育60min；70℃ 5min终止反应，反应产物直接用于PCR或-20℃存放备用。

4.2.1.3 SOCS2基因编码区（CDS）的扩增

依照扩增CDS全长的引物设计原则，根据Genbank公布的SOCS2基因序列(NM_007706.3)，用Primer Premier5.0软件设计SOCS2扩增引物，表4-1中SOCS2-F和SOCS2-R为SOCS2基因的扩增引物。

表4-1 SOCS2 CDS区扩增引物

Table 4-1 Primers of SOCS2 CDS sequence

Primer names Primer sequence (5'-3')

SOCS2-F：CGTGTTGACTCATCTCCC

SOCS2-R CA TAGCTGCATTCGGAGA

SOCS2-F-BglⅡGCAGATCTATGACCCTGCGGTGCCTGG

SOCS2-R-Flag-XhoⅠGCCTCGAGTTACTTATCGTCGTCATCCT TGTAATCTACCTGGAA TTTA TATTCTT

4.2.1.4 SOCS2 CDS区的扩增体系和条件

用表4-1中的SOCS2-F和SOCS2-R引物，按照表4-2中的扩增体系和条件扩增SOCS2 CDS区。

第四章SOCS2腺病毒载体的构建 3

表4-2 SOCS2 CDS区的扩增体系和条件

Table4-2 PCR amplification system and

10×PCR 缓冲液 1.25 μL

dNTP Mixture（各2.5 mM） 2 μL

上、下游引物（10μM）各0.5 μL

cDNA 1.3 μL

ddH2O 7.45 μL

瞬时离心收集反应液，按一下条件进行反应：

预变性（95℃）5min

反应一：（20个循环）

变性（95℃）40s

退货（62℃，每个循环降0.5℃，共20循环）40s

延伸（72℃）50s

反应二：（20个循环）

变性（95℃）40s

退火（57℃）40s

延伸（72℃）50s

反应三：

延伸（72℃）8min

反应结束后，样品直接用于电泳检测，或暂时存放于4℃，-20℃可存放一周

4.2.1.6 SOCS2 CDS区的T载体克隆及鉴定

依照Takara pMD TM18-T 克隆载体操作说明，将胶回收的SOCS2CDS全长克隆至pMD TM18-T；

A. 克隆反应体系和操作步骤如下表，样品添加及试剂融解均在冰上操作；

pMD18-T（50 ng/μL） 1 μL

插入的目的片段（0.1-0.3 pmol） 3.5 μL

dH2O 0.5 μL

SolutionⅠ 5 μL

B. 瞬时离心，收集反应液。16℃孵育过夜(>12 h)；将连接产物10 μL加入到100 μL DH5α感态中，冰浴30 min；

C. 42℃热击45s，迅速冰浴1 min，此过程不可激烈晃动PCR管，否则影响转化效率；