腺病毒载体的构建
miR-1腺病毒载体的构建及表达分析
南 昌大 学 学报 （ 医学 版 ）２ １ ０ ０年第 ５ Ｏ卷第 ８期
Ｊｕ ｎｌ ｆ ｎｈ ｎ ｉｅｓ ｙ Ｍｅ ｉ ｌ ｃ ｎｅ ０ ０ Ｖｏ． ０Ｎｏ ８ ｏ ｒ ａ ｏ ｃ ａｇＵｎｖ ｒｉ （ ｄｃ ｉ ｃ）２ １ ， １５ ． Ｎａ ｔ ａＳ ｅ
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腺病毒与基因传递载体的构建与应用
腺病毒与基因传递载体的构建与应用腺病毒（Adenovirus）是一种以双链DNA为基础的病毒，主要感染哺乳动物，包括人类。
由于具有较高的感染率和传播速度，在临床治疗和基因治疗等领域，被用作基因载体。
这篇文章将会介绍腺病毒作为基因传递载体的构建和应用。
一、腺病毒作为基因传递载体的构建腺病毒是一个十分复杂的病毒，其基因组由约36 kb的双链DNA组成。
它的基因组被分为两个方向，一个方向编码早期基因（E1A、E1B、E2、E3和E4），另一个方向编码晚期基因（L1-L5）。
早期基因编码的转录产物参与了病毒DNA的复制和转录，晚期基因主要编码病毒颗粒结构和组装所需的蛋白质。
基于这个理论框架，可以利用腺病毒基因组进行基因传递。
首先，必须构建一个适当的腺病毒载体（Adenoviral vector），其基本构造是一个缺少大部分基因组的腺病毒。
在此基础上，将感兴趣的DNA片段插入到腺病毒基因组里。
这需要掌握两种方法：重组技术和确认策略。
以重组技术为例，首先要得到一个带有感兴趣DNA片段的载体核酸。
这个DNA完整地包含了带有专门的重组序列的保护酶切位点，使其能够在目标腺病毒基因组上的互补位点诱导重组。
在这个操作后，形成了一个新的腺病毒基因组，其中包括感兴趣的DNA片段。
然后，改造后的基因组可以转染到腺病毒感染容器中，进行繁殖和扩增。
这一步骤可以提高已经构建的腺病毒载体的数量。
其次，需要构建一种辅助病毒（Adenoviral helper）来帮助前述的重组病毒形成成熟的病毒颗粒。
在这个方法中，辅助病毒中没有任何有价值的基因，因此它不能复制自己。
相反，它确保引入的重组病毒可以在感染容器中成功地产生新的病毒颗粒。
通过这样的步骤，可以构建出一种有效的载体，并用于下一步的实验设计。
二、腺病毒作为基因传递载体的应用腺病毒作为基因传递载体可以应用于基因治疗、疫苗研究、基因注入和细胞治疗等领域。
下面分别介绍一下相关应用的基本技术。
腺病毒载体的构建和应用
腺病毒载体的构建和应用随着生物工程技术的不断发展，越来越多的生物医学研究领域开始趋向于基因治疗和基因编辑等方向。
这些技术的实现需要一种特殊的工具——腺病毒载体。
腺病毒（Adenovirus）是一种不包含RNA病毒的DNA病毒，其表面包裹着许多蛋白质，使其具有较好的基因导入能力。
这使得腺病毒成为一种常用的基因载体，被广泛应用于细胞遗传学、基因治疗等领域。
腺病毒的构成腺病毒包含一个大小为36 kb的线性双链DNA，这条DNA上编码了丰富的基因信息，其中大约包含40个基因左右。
腺病毒分为革兰氏正染色体和非冠状病毒两种类型，目前在研究中应用最多的是非冠状病毒型腺病毒。
腺病毒载体构建的两种方法目前有两种主要的构建腺病毒载体的方法，分别是端到端的法和质粒基因重组的法。
端到端的法端到端的法在构建腺病毒载体时需要把目标基因全长克隆进腺病毒的基因组中。
这种方法在基因克隆、重组和转染等方面比较复杂，对实验人员的操作技能要求较高。
同时，这种方法的构建产物相对来说比较容易受到细胞内DNA修饰和限制性酶的影响。
质粒基因重组的法对比之下，质粒基因重组的法相对来说较为容易，需要构建的重组质粒包括表示目标基因的转录单元以及与腺病毒DNA重组所需的旁路序列等。
通过将质粒DNA转染至腺病毒蛋白质、酶和基因表达产物等组分共同构成的细胞核中，将质粒DNA与腺病毒DNA进行重组，从而构建出目标腺病毒载体。
质粒基因重组法不仅可以有效克服端到端法受到限制性酶和DNA修饰的影响，而且富于设计灵活度，从而满足更多的实验需求。
腺病毒载体的应用腺病毒载体广泛应用于人类和动物细胞体内的基因传递、基因治疗和基因工程方面。
通过腺病毒载体可进行基因敲除、基因转录和基因转译等一系列基因编辑操作。
基因敲除基因敲除是研究腺病毒载体理解生命过程和信号转导途径的重要手段之一。
通过基因敲除的方法可以对特定基因进行敲除，从而寻找与该基因相关联的复杂的生物学催化剂。
目前腺病毒载体敲除方法尤其得到广泛应用，对于生命科学研究者来说具有重要的意义。
重组腺病毒载体的构建【精品推荐】
腺病毒载体的特点
n 主要以Ad5型病毒为框架构建 n 具有携带外源基因和转移外源基因的双
重功能 n 可插入长达5kb的外源基因 n 通过受体介导的细胞内吞作用进行基因
转移 n 安全性，复制缺陷（E1区缺陷）
腺病毒载体的特点
n 保留了E3区的腺病毒－－可逃逸宿主免 疫应答，可用于体内基因治疗
重组腺病毒的鉴定
n 病变293细胞于液氮、37°C反复冻融， 离心
n 取上清提取重组病毒DNA n 用目的片段引物和病毒基因组特征片段
引物作PCR
病毒滴度测定
n 24孔培养板每孔接种1×105个293细胞 n 培养24小时后，取病毒转染液0.2ml加
PBS至总量2ml，混匀后作10倍比稀释至 第8管，每孔加入不同稀释度的病毒液 0.2ml。 n 37°C 5%CO2培养1小时后，每孔补加 1.5ml培养液，继续培养36－48小时
病毒滴度测定
n 观察细胞病变情况，取100%出现CPE的 稀释度计算病毒滴度： 105细胞×稀释度×10个病毒/细胞 pfu/ml=
重组病毒的扩增
n 293细胞大规模培养：悬浮培养，单层培 养
n 用收集的病变细胞培养上清或冻融上清 感染293细胞
n 反复培养、感染 收集大量的病变细胞 及病毒上清
n 不整合到宿主基因组 n 增殖和非增殖细胞均可感染
构建腺病毒载体的要素
n 腺病毒基因组质粒 n 穿梭质粒 n 目的基因片段 n 包装细胞
AdMax™ system
穿梭质粒
pDC315
腺病毒载体的包装胞细
n HEK293细胞－－E1区缺陷互补的细胞系 悬浮HEK293细胞，易大规模培养，可用 于腺病毒大规模制备。但不易长期保持 稳定。 单层培养HEK293细胞，稳定，用于 重组腺病毒载体构建、蚀斑挑选。也可 用于腺病毒扩增。
MGMT基因重组腺病毒载体的构建
［ ］ ＷａｇＢ Ｊｃｎ Ｍ， ｉ ， ｔ １ Ｍ ａｉｇ ｆ ｍ ｒ ｎｃ ｔ ２ ｎ ， ａｏ ｉ Ｌ Ｊ ｅ ａ． Ｒ ｉ ｇ ｂ ｏｉ ｓ ｍ ｍ ｎ ｏｅ ｙ ｅ ｃｌ ｂ ｌ ｙｓｐ ｒ ｒ ａｎｔ ｏ ｘ ｅ［ ］ Ｚ ｏ ｇｕ ｉ ｅｓｌ ｅ ｄｂ ｕ ｅ ａ ｍ ｇ ｅ ｃｉ ｎｏ ｉ Ｊ ． ｈ ｎｈ ａ ｌ ａ ｅ ｐａ ｉ ｒ ｄ Ｙ
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４ 参 考 文 献
腺病毒疫苗制作流程
腺病毒疫苗制作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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MAGE-A3重组腺病毒载体的构建及表达的开题报告
CRT/MAGE-A3重组腺病毒载体的构建及表达的开
题报告
一、研究背景和意义：
癌症是世界公认的重大疾病之一，在其中恶性黑色素瘤的死亡率也非常高。
通过疫苗调节免疫系统来预防或治疗癌症的方法已经成为重要的研究方向，包括恶性黑色素瘤。
而MAGE-A3和CRT是在恶性黑色素瘤中表达的抗原，且它们的表达在癌细胞和正常细胞中有明显的差异。
因而它们被认为是恶性黑色素瘤的潜在免疫治疗靶点。
二、研究内容和方案
本研究通过将MAGE-A3和CRT基因插入到腺病毒载体中，构建CRT/MAGE-A3重组腺病毒载体，并在细胞水平表达融合蛋白。
具体步骤如下：
1. 通过RT-PCR方法从恶性黑色素瘤组织中提取MAGE-A3和CRT 基因。
2. 将MAGE-A3和CRT基因克隆到腺病毒载体中，形成CRT/MAGE-A3重组载体。
3. 利用PCR进行扩增，通过酶切和测序进行CRT/MAGE-A3重组载体的鉴定。
4. 将CRT/MAGE-A3重组载体转染到恶性黑色素瘤细胞株中，通过Western Blotting方法检测融合蛋白CRT/MAGE-A3的表达和纯度。
三、研究预期结果
1. 成功构建CRT/MAGE-A3重组腺病毒载体。
2. 观察到CRT/MAGE-A3的表达并在细胞中得到验证。
3. 为下一步开展体内实验打下坚实基础，为疫苗调节免疫系统来预防或治疗癌症奠定理论基础。
四、研究意义
本研究有望为恶性黑色素瘤的免疫治疗提供新的方法和思路，也有望开展潜在的抗癌疫苗研究。
同时还有望在癌症免疫治疗的新技术方面提供一定的探索，为癌症的预防和治疗提供新的思路和方法。
腺病毒载体构建的基本原理与应用
腺病毒载体构建的基本原理与应用1. 简介腺病毒（Adenovirus）是一类非常常见的病毒，它可引起呼吸道、眼部和肠道感染等问题。
在基因工程领域，腺病毒被广泛应用作为基因传递载体。
通过对腺病毒进行适当的改造，可以将外源基因有效地传递到目标细胞中，并实现基因的高表达。
本文将介绍腺病毒载体构建的基本原理以及其在实际应用中的主要用途。
2. 腺病毒载体构建的基本原理腺病毒载体构建的基本原理主要包括以下几个步骤：2.1 选择适当的腺病毒亚型腺病毒有多个亚型，其中最常用的是腺病毒2（Ad2）和腺病毒5（Ad5）。
选择适当的腺病毒亚型取决于目标细胞的特点以及需要传递的基因。
2.2 构建质粒载体构建质粒载体是腺病毒载体构建的第一步。
质粒载体通常由多个部分组成，包括腺病毒的核心序列、外源基因表达的启动子和终止子等。
通过合成或PCR扩增等方法，可以将这些部分组装到一起构建质粒载体。
2.3 建立包装细胞系在构建过程中，需要建立一个能够产生包装腺病毒的细胞系。
这些细胞系通常包括两种类型的细胞：一种是质粒携带者，将质粒转染进细胞内；另一种是包装细胞，它们能够提供所需的腺病毒包装蛋白和其他辅助蛋白。
2.4 转染质粒载体将质粒载体转染到包装细胞系中，使其进入细胞内。
转染的方法可以采用常规的化学方法，如钙磷共沉淀法或使用商业化学试剂。
2.5 腺病毒产生与包装质粒载体进入到包装细胞中后，通过转染和转座等过程，腺病毒基因组会产生复制和转录。
最终，腺病毒包装蛋白和基因组会组装成腺病毒颗粒，从而完成腺病毒载体的构建。
3. 腺病毒载体的应用腺病毒载体在基因治疗、疫苗开发、基因功能研究等方面具有广泛的应用。
以下是腺病毒载体的主要应用领域的列点介绍：•基因治疗：腺病毒载体可以用于治疗多种遗传性疾病，如囊性纤维化、遗传性视网膜疾病等。
通过将治疗基因成功地传递到患者细胞中，可以恢复或增强正常基因的功能，从而治疗相关疾病。
•疫苗开发：腺病毒载体在疫苗开发中具有重要的作用。
腺病毒质粒载体的构建及表达调控机制研究
腺病毒质粒载体的构建及表达调控机制研究第一章引言腺病毒是一种广泛应用于基因治疗和基因表达的载体，由于其病毒自身不具有致病性，可以更安全地应用于临床治疗和药物研发。
腺病毒载体的构建和表达调控机制的研究是基因治疗和药物研发领域的热点问题。
本文将从腺病毒质粒载体的构建方法、载体的表达调控机制、及应用前景等方面进行探讨。
第二章腺病毒质粒载体的构建方法腺病毒的质粒载体构建需要遵循一定的规律和原则，以确保载体的高效性和稳定性。
现将常用的腺病毒质粒载体构建方法进行简要介绍：2.1 插入式构建法插入式构建法是最常用的构建方法之一，其基本原理是将外源基因片段插入到腺病毒质粒载体中，再通过体外转染等方法将整个质粒导入到细胞内进行转染。
插入式构建法具有构建简便、转染效能高、适用性强等优点。
但由于插入的外源基因片段较长且载体承载能力有限，仅适用于小分子基因的插入。
2.2 重组式质粒构建法重组式质粒构建法是从腺病毒DNA中特异性截取相应序列，并将其与外源基因片段重组形成新的质粒载体。
重组式质粒构建法具有高效性、稳定性等优点，能够承载大分子基因片段的插入。
但构建难度较大，需要较为专业的技术支持。
2.3 克隆式质粒构建法克隆式质粒构建法是将腺病毒基因组进行克隆，这种方法能够在保持病毒活性的前提下获得高效的转染效果和稳定性。
克隆式质粒构建法适用于需要经常进行高效转染以及灭活性病毒的构建，但需要高超的实验技能和完善的实验设备。
第三章腺病毒质粒载体的表达调控机制腺病毒质粒载体的表达调控机制是基因治疗和药物研发领域的重要问题之一。
本章将从内在调节和外部控制两个方面进行介绍。
3.1 内在调节内在调节是指在腺病毒质粒载体表达阶段，利用载体本身的启动子、基因调节元件等进行调节。
常用的内在调节方法有以下几种：3.1.1 CMV启动子调节CMV启动子是最常见的内在调节方法之一，其具有高效性、稳定性等优点。
CMV启动子能够在典型的哺乳动物细胞中发挥优异的表达效果，并能够适应细胞类型、转染条件等变化。
腺病毒载体构建原理与方法的研究进展
作者单位:100052北京,中国预防医学科学院病毒学研究所病毒形态研究室#综述#腺病毒载体构建原理与方法的研究进展何金生王健伟洪涛由于腺病毒(Adenovirus,Ad)载体在哺乳动物及其多种细胞上进行基因转移和蛋白表达的高效性,使其在基因疫苗及基因治疗的研究中受到人们的青睐,成为当今使用最多的病毒载体之一。
为了取得更满意的效果,人们在腺病毒载体构建与改进方面,做了大量工作。
本文谨就近年来腺病毒载体构建原理与方法的研究进展扼要综述如下。
1腺病毒载体的构建原理腺病毒的基因组为线形双链DNA,长度约为36kb,被包装在一个二十面体的蛋白质外壳内,可分为编码区和非编码区。
编码区又可分为早期转录区和晚期转录区两种,前者有E1、E2、E3、E4四个区,编码病毒的调节蛋白,后者有L1、L2、L3、L4、L5五个区,编码病毒的结构蛋白。
非编码区含有病毒进行复制和包装等功能所必需的顺式作用元件。
除E3区外,其余的编码区及顺式作用元件均为病毒复制所必需。
第1代腺病毒载体是由去除腺病毒基因组的E1和P或E3两个区而获得,其复制必须在由5型腺病毒转化的可组成性表达E1蛋白的293细胞中完成。
其主要优点为:在体外有很高的繁殖滴度(1011~1012PFU P ml);易感的宿主细胞范围广,既能感染增殖细胞,又能感染非增殖细胞;病毒基因组存在于细胞染色体外,避免了因整合引起的细胞突变。
但由于病毒载体与表达E1蛋白的293细胞之间存在同源序列。
在293细胞中繁殖时,通过重组,可重新获得E1区,出现复制型腺病毒(Replication-competent Ads, RCAs),这使得第1代腺病毒载体的应用受到限制112。
此外,由于发现在多种转化及原代的细胞内存在具有Ela样活性(Ela-like activity)的物质,因而E1区缺失的腺病毒载体在这些细胞内,仍能进行Ela非依赖性的腺病毒DNA复制,并从头合成病毒的早期和晚期蛋白,激发宿主针对腺病毒的细胞和体液免疫,使载体在体内的持续时间以及再次应用均受到极大影响122。
高表达hRAMP1基因腺病毒载体的构建及其在兔MSCs中表达的实验研究的开题报告
高表达hRAMP1基因腺病毒载体的构建及其在兔MSCs中表达的实验研究的开题报告一、研究背景和意义随着基因治疗的不断发展，基因载体作为基因治疗的重要工具成为研究热点。
腺病毒载体是一种常用的基因载体，具有高效、稳定和安全等优点，因此被广泛应用于基因治疗。
人重组钙调蛋白受体样蛋白1基因 (hRAMP1) 是一种重要的调节因子，它能够调节 G 蛋白耦合的受体活性，对于细胞内钙离子的调节起着重要的作用。
MSCs (Mesenchymal stem cells) 是一种具有多向分化能力的成体干细胞，具有广泛的应用前景，可用于组织再生和基因治疗。
本研究旨在构建高表达hRAMP1基因的腺病毒载体，并将其转染至兔MSCs中进行实验研究，以探究hRAMP1基因在MSCs中的表达情况及其对于细胞功能的影响，为基因治疗提供理论和实验基础。
二、研究内容和方法（1）构建高表达hRAMP1基因的腺病毒载体利用PCR技术扩增hRAMP1基因，将其克隆至pAd-Track载体的多克隆位点(多克隆位点：MCS)，并通过腺病毒系统的三次重组技术，构建高表达hRAMP1基因的Ad-hRAMP1载体。
经序列鉴定后进入到下一步的研究。
（2）将Ad-hRAMP1载体转染至兔MSCs中将兔MSCs用DMEM培养至70%左右，取出并洗涤2次，加入Ad-hRAMP1载体，培养48h至72h后观察细胞的转染率，并提取细胞总蛋白。
（3）Western blotting检测hRAMP1基因的表达情况Western blotting技术检测MSCs中hRAMP1基因的表达情况。
将经过SDS-PAGE电泳分离后的细胞总蛋白，用抗hRAMP1的单抗进行蛋白检测。
检测hRAMP1蛋白的表达情况，并分析hRAMP1对于MSCs中的细胞功能的影响。
三、研究计划和进度（1）前期准备期：查阅资料等，掌握腺病毒载体和MSCs的基本知识，建立实验方案。
（2）实验操作期：设计引物、腺病毒载体构建、慢病毒载体包装、兔MSCs的培养和转染、Western blotting等实验。
腺病毒载体的构建
腺病毒载体的构建第四章SOCS2腺病毒载体的构建 1腺病毒载体的构建由第三章结果可知，基础状态下SOCS2在脂肪细胞中的表达⽔平较低，但是GH 可以诱导SOCS2稳定⾼表达。
SOCS2⾼表达的同时，GH诱导的脂肪细胞分化因⼦和脂质代谢基因表达发⽣了变化。
为了研究SOCS2对GH调控脂肪细胞分化与脂质代谢的影响，需要通过⼀种途径实现SOCS2在脂肪细胞中持续⾼表达。
细胞导⼊外源基因是⽬前常⽤的⽅法，但是保证外源基因的⾼效表达需要合适的表达系统。
⽬前常⽤的有质粒、逆转录病毒、蔓病毒、腺病毒等外源基因表达系统。
质粒载体可以导⼊外源基因，但是质粒的转染效率很低，如何把⽬标基因导⼊靶细胞转录产物是质粒系统的最主要的问题。
逆转录病毒可以把⽬标基因整合到靶细胞基因组永久表达，但是逆转录病毒只能感染增殖期的细胞。
蔓病毒本⾝对脂肪细胞的感染率⼜⽐较低。
⽽腺病毒滴度⾼，适合外源基因⼤量表达，并且可插⼊较⼤的⽬的⽚段，对细胞类型限制较⼩，可感染⾮分裂期的细胞(V orburger SA and Hunt KK 2002)。
另外腺病毒载体系统中pAdEasy系统操作⽐较简单(Luo JY et al. 2007)。
本章克隆SOCS2基因，采⽤pAdEasy系统构建pAd-SOCS2载体，为SOCS2在脂肪细胞中⾼效表达，研究SOCS2对GH调控脂肪细胞分化与脂质代谢的影响奠定基础。
4.1材料4.1.1 样品、菌株、质粒及细胞株脂肪组织取⾃6周龄昆⽩⼩⿏，⼩⿏购⾃第四军医⼤；E.coli DH5α菌株由本实验室保存；pAdTrack-CMV和pAdEasy-1质粒，E.coli BJ5183菌株由猪脂肪沉积与肌⾁发育实验室赠送；⼈胚肾细胞株HEK293购于中国科学研究院上海细胞资源中⼼。
4.1.2 主要试剂限制性内切酶BglⅡ、XhoⅠ和蛋⽩Marker购⾃Fermentas公司；内切酶PmeI和PacI购⾃NEB公司；pMD TM18-T克隆载体、碱性磷酸酶CIPA购⾃Takara公司；穿梭质粒⼩提试剂盒购⾃Omega公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购⾃Bioflux公司；λ/Hin dIII Marker购⾃天根公司；OptiMem优化培养液购⾃Gibico公司；脂质体Lipofectamine TM 2000购⾃Invitrogen公司。
医学：重组腺病毒载体的构建
02
重组腺病毒载体的构建涉及多个步骤，包括选择合适的腺 病毒血清型、设计外源基因的插入位点、构建重组质粒、 转染腺病毒生产细胞等。这些步骤需要精确的操作和严格 的质量控制，以确保重组腺病毒载体的安全性和有效性。
03
重组腺病毒载体的构建过程中，需要注意选择适当的腺病 毒血清型，以确保与宿主细胞的良好亲和力和低免疫原性 。同时，需要对外源基因进行适当的修饰和优化，以提高 其在重组腺病毒载体中的表达效率和稳定性。
医学重组腺病毒载体的构建
目录
• 重组腺病毒载体概述 • 重组腺病毒载体的构建过程 • 重组腺病毒载体的应用研究 • 重组腺病毒载体的安全性及挑战 • 参考文献
01 重组腺病毒载体概述
腺病毒的特点
01
02
03
宿主范围广
腺病毒对多种细胞类型具 有感染能力，包括人体细 胞。
基因容量大
腺病毒载体可以携带较大 的基因片段，适合用于基 因治疗和疫苗研发。
02 重组腺病毒载体的构建过 程
目的基因的获取与。
目的基因的处理
对目的基因进行限制性酶切、修饰、 纯化等处理，以便于后续的克隆和鉴 定。
载体的选择与处理
载体的选择
根据实验需求选择适合的载体，如腺病毒载体、质粒载体等。
载体的处理
重组腺病毒载体的构建过程简介
选择合适的腺病毒血清型
根据应用需求选择对特定细胞类型感染力强、 免疫原性弱的腺病毒血清型。
构建重组质粒
将目的基因插入腺病毒载体的转移质粒中， 形成重组质粒。
转染与筛选
将重组质粒转染进包装细胞，筛选出能够产 生重组腺病毒的细胞克隆。
病毒扩增与纯化
在筛选出的细胞克隆中扩增重组腺病毒，并 进行纯化和浓缩。
腺病毒构建
腺病毒的一般特性腺病毒的形态是特征性的二十面体病毒壳体（Stewart et al., 1993）。
其病毒壳体含有三种主要的蛋白：六邻体（II），五邻体基底（III）和纤突（IV），还有多种其他的辅助蛋白VI，VIII，IX，IIIa和Iva2（Fig. 1）。
腺病毒基因组是一个线性的双链DNA，其5’端与一种末端蛋白（TP）共价结合（Rekosh et al., 1977），5’端上还具有末端反向重复序列（ITRs）。
病毒DNA与核心蛋白VII和一个称为mu的小肽紧密结合（Anderson et al., 1989）。
另一种蛋白V包被在DNA-蛋白复合物上，并且通过蛋白VI为DNA-蛋白复合物和病毒壳体间提供了结构上的联系（Matthews & Russell, 1995）。
病毒含有一种病毒自身编码的蛋白酶（Weber, 1976; Webster et al., 1989），这种蛋白酶对于加工某些结构蛋白从而产生成熟的具有感染性的病毒是必需的。
腺病毒家族（Adenoviridae）的成员可感染种类相当广泛的有丝分裂后细胞，甚至包括来自高度分化的组织中的细胞，例如骨骼肌细胞，肺细胞，脑细胞和心脏细胞。
因为腺病毒可将自身的基因组递送到细胞核中，并且高效率地复制，所以腺病毒成为表达和传递治疗基因的主要候选者。
腺病毒的宿主范围很宽，目前可将之分为三个属，进一步可分为6个种（或称为亚属或亚群），编号从A到F。
主要基于免疫学标准的人血清型的划分，已经由于历史原因而成为腺病毒分类的基础（Benkö et al., 1999; Lukashok & Horwitz, 1998; Mautner, 1989）。
有些腺病毒在动物体内可致瘤，在体外能转化细胞，此处未列出相关文献。
腺病毒载体的应用腺病毒载体可高效地传递和表达基因的能力（尤其是在体外），在过去的15年里已经得到充分地证实和记载。
腺病毒载体在基因治疗中的应用
腺病毒载体在基因治疗中的应用随着生物技术和基因工程的进步，基因治疗已成为医学界的一项研究热点。
基因治疗是通过将基因载体导入到患者体内，使其表达所需的治疗基因来治疗疾病。
目前，常用的基因载体主要有病毒载体和非病毒载体两种。
而腺病毒载体作为一种常用的病毒载体之一，在基因治疗中也发挥着重要的作用。
一、腺病毒的基本特性腺病毒（adenovirus）是一个非常普遍的病毒，它具有双链DNA，嗜热、嗜酸性、不被包膜包裹的特性。
腺病毒可以感染哺乳动物、鸟类和爬行动物等广泛的生物群体，通常引起感冒和呼吸道感染等疾病。
腺病毒在基因治疗中的应用主要依赖于其良好的遗传学特性，尤其是在基因表达和基因传递方面的优越性。
二、腺病毒载体的构建方法腺病毒载体的构建是基因治疗中非常关键的过程。
腺病毒载体的核心是表达负责特定治疗效应的外源基因，因此，正确构建腺病毒载体是确保基因治疗成功的首要保障。
目前，常用的腺病毒载体构建方法主要有3种：重组病毒DNA技术、Homologous recombination（同源重组）和Cre-loxP介导的低剂量DNA用量。
这些方法都与分子生物学方法和技术密切相关，需要用到许多分子生物学技术和实验室设备。
三、腺病毒载体的应用领域腺病毒载体在基因治疗中的应用非常广泛，主要包括以下几个方面：1、遗传缺陷症的治疗。
遗传缺陷症一般是由于某个基因发生突变导致的，因此采用基因治疗是治疗遗传缺陷症最有前途的方法之一。
目前针对一些单基因病进行基因治疗的研究已经开始，例如囊性纤维化、遗传性凝血因子Ⅷ、骨髓瘤等。
研究表明，采用腺病毒载体进行治疗的效果是非常显著的。
2、癌症的治疗。
癌症是一种破坏人们健康的致命疾病。
而采用腺病毒载体进行基因治疗，则能针对肿瘤细胞特异性基因、癌症相关基因和免疫调节基因等进行治疗，其表现形式可以是基因靶向方案、病毒粒子攻击方案等，有效地减轻患者的痛苦和提高生存质量。
3、神经系统疾病的治疗。
神经系统疾病一直是临床医学难以攻克的大难题之一。
腺病毒载体构建
腺病毒的基因及其功能
ITR Ψ E1a/E1b E2 E3 E4 ITR
腺病毒基因组编码数十个腺病毒的结构和功能蛋白，分为早期表达和晚 期表达。
早期表达的蛋白是功能蛋白，晚期表达的有功能蛋白也有结构蛋白，并 且早期的功能蛋白能够调控晚期蛋白的表达。
早期表达的E1区蛋白（甚至包括E2区蛋白）是腺病毒基因组复制、病毒 包装和其他蛋白表达翻译所必须的，但其对细胞毒性也是很强的。
腺病毒粒子相对稳定，插入外源基因的病毒基因组在 连续传代中保持不变，易于用重组DNA技术操作。
宿主范 可转入分裂后的非分裂细胞中发挥作用，可以感染处
围广
于分裂状态的细胞。
感染 性
强
可经不同途径进入不同组织(可以在肠道内繁殖，也可 以 在呼吸道内繁殖。
包装容量 改建腺病毒基因部分缺失载体的克隆容量可达10kb， 大 腺病毒基因完全缺失载体克隆容量可达37kb。
E2蛋白涉及AdDNA复制 E3蛋白对抗宿主的抗病毒防御系统 E4蛋白调节有效的晚期基因转录
腺病毒分类
第一代腺病毒载体：一般将E1或E3基因缺失的腺病毒载体成为一代
载体。此类型载体在未纯化时可引发机体产生较 强的炎症反应和免疫反应，纯化后可安全使用， 体内表达周期可达4周。（科研、临床应用最广 泛 ，一般常用Ad5型腺病毒）
腺病毒
• 腺病毒 Adenovirus 最初由人类腺样增殖体组织培养中分 离得到的，此病毒名称也由此而来。质粒是直径约70毫微 米的正二十面体，各顶点具有突起。结构亚基总数为252 个。核酸是双链DNA，分子量20—25×106。无包膜。在被感 染的细胞核中增殖，病毒蛋白在细胞质内合成，再输送到 细胞核。
• 腺病毒可见于人、鸡、牛、狗、鼠、猪和猴中，并各自具 有严格的寄主特异性，不感染他种动物。对人类可引起感 冒症状、呼吸系统不适等。
人乳铁蛋白腺病毒载体的构建及细胞表达
人乳铁蛋白腺病毒载体的构建及细胞表达摘要：将人乳铁蛋白基因与腺病毒基因组骨架质粒重组，在293细胞中包装重组腺病毒颗粒，获得真核细胞表达的载体pAd－hLTF。
以pcDNA3X为模板，PCR扩增hLTF基因，腺病毒穿梭载体pshuttle－cmv与hLTF重组为pshuttle－cmv－hLTF；再与腺病毒骨架质粒pAdEasy－1同源重组为pAd－hLTF质粒；脂质体法将重组pAd－hLTF质粒转染HEK 293细胞，包装成重组腺病毒颗粒。
Western blot和ELISA法测定细胞中hLTF基因的表达。
结果表明，pAd－hLTF 质粒转染293细胞后，7～10 d后，获得细胞裂解液，将细胞裂解产物再次接种新鲜的293细胞，3～5 d后，80%以上的细胞变圆、膨胀、漂浮。
Western blot 和ELISA结果显示，上清液中有hLTF基因的表达，为重组人乳铁蛋白的体外表达及其功能分析奠定了基础。
关键词：重组人乳铁蛋白；腺病毒载体；重组蛋白质Construction of Human Lactoferrin Gene Recombinant Adenoviruses and Expression in Eukaryotic CellsAbstract：To construct the recombinant adenoviral vectors containing human lactoferrin gene，the recombinant adenoviruseswas obtained and expressed the recombinant protein in eukaryotic cells．The human lactoferrin gene was amplified from plasmid pcDNA3X；the gene of interest which contained hLTF gene was cloned into the pshuttle－cmv vector．The resulted vector was named pshuttle－cmv －hltf that was linearized by digesting with restriction endonuclease PmeI，and subsequently cotransformed into Escherichia coli BJ5183 cells with an adenoviral backbone vector pAdEasy－1；Homologous recombinants were performed in bacterial cells．Finally，the linearized backbone adenoviral vector was transfected into the packaging cells lines HEK 293 cells by lipofectamine 2000 transfection reagents．The expression of human lactoferrin in cells was investigated by Western blot and ELISA methods．After the transfection，seven to ten days later，the cells lyses were collected and added into the separate 293 cells．The cells become roundness，swell and floats．Western blot and ELISA results showed the high expressed human lactoferrin in the cells．These results shown that human lactoferrin gene recombinant adenoviral backbone vector had been constructed successfully．The recombinant adenoviruses pAd－hLTF had been produced by packaging in 293 cells．This study could provide the possibility of further researches on the high－level expression of recombinant proteins．Key words：recombinant human lactoferrin；adenoviral vectors；recombinant protein人乳铁蛋白(human lactoferrin，hLTF)是主要存在于初乳中的一种结合性糖蛋白，由于乳铁蛋白具有许多独特的生物学功能，如广谱的抗菌性及免疫作用、抗氧化作用、抗炎症、抗病毒、抗癌症作用等[1]生物学功能，近年来成为国内外研究的热点。
重组腺病毒载体pAd-CD的构建和鉴定的开题报告
重组腺病毒载体pAd-CD的构建和鉴定的开题报告一、研究背景和意义腺病毒是一种广泛存在于哺乳动物中的DNA病毒，能够感染多种类型的细胞，具有高效的基因转导能力和良好的安全性。
因此，腺病毒已经成为了重要的基因转导载体，被广泛应用于基因治疗、基因工程和生物学研究等领域。
其中，重组腺病毒作为基因转导载体具有如下的优点：（1）能够稳定地表达外源基因：腺病毒具有较高的基因转导率，可以长时间稳定地表达外源基因，从而实现目标蛋白的大量表达。
（2）病毒颗粒结构复杂：腺病毒颗粒结构复杂，能够有效地包装外源基因，从而保证表达的效率和精度。
（3）有良好的生物安全性：腺病毒基因组不会整合到宿主细胞基因组中，从而减少对宿主基因组的影响，有良好的生物安全性。
本研究主要针对重组腺病毒载体pAd-CD的构建和鉴定展开，主要研究内容包括以下几个方面：1. 进一步优化pAd-CD载体的构建，提高其基因转导效率。
2. 针对pAd-CD载体的具体应用领域，开展针对性的效果评价和分析。
3. 探索pAd-CD载体在基因治疗、基因工程和生物学研究等方面的应用潜力。
本研究的开展能够拓展腺病毒在基因转导载体方面的应用范围，对基因治疗、生物学研究等领域具有一定的应用前景。
二、主要研究内容和研究方案1. 重组腺病毒载体pAd-CD的构建（1）提取并纯化腺病毒：采用经典的离心法等分离技术，从已知类型的腺病毒细胞株中提取并纯化腺病毒。
（2）选择并设计适合的pAd-CD载体：根据研究方向选择并设计适合的重组腺病毒载体。
（3）克隆外源基因：将目标基因与pAd-CD载体进行克隆，形成包含外源基因的载体。
（4）包装重组腺病毒：使用适当的技术和装置，将载体转化为重组腺病毒并包装成病毒颗粒。
2. 重组腺病毒载体pAd-CD的鉴定（1）DNA测序鉴定：使用合适的方法对构建出的pAd-CD载体进行测序鉴定。
（2）病毒包装率检测：测定包装率，评估重组腺病毒的制备质量。
（2）病毒的基因转导效率检测：采用不同的检测方法检测病毒的基因转导效率，分析重组腺病毒的基因转导效率及其影响因素。
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第四章SOCS2腺病毒载体的构建 1腺病毒载体的构建由第三章结果可知，基础状态下SOCS2在脂肪细胞中的表达水平较低，但是GH 可以诱导SOCS2稳定高表达。
SOCS2高表达的同时，GH诱导的脂肪细胞分化因子和脂质代谢基因表达发生了变化。
为了研究SOCS2对GH调控脂肪细胞分化与脂质代谢的影响，需要通过一种途径实现SOCS2在脂肪细胞中持续高表达。
细胞导入外源基因是目前常用的方法，但是保证外源基因的高效表达需要合适的表达系统。
目前常用的有质粒、逆转录病毒、蔓病毒、腺病毒等外源基因表达系统。
质粒载体可以导入外源基因，但是质粒的转染效率很低，如何把目标基因导入靶细胞转录产物是质粒系统的最主要的问题。
逆转录病毒可以把目标基因整合到靶细胞基因组永久表达，但是逆转录病毒只能感染增殖期的细胞。
蔓病毒本身对脂肪细胞的感染率又比较低。
而腺病毒滴度高，适合外源基因大量表达，并且可插入较大的目的片段，对细胞类型限制较小，可感染非分裂期的细胞(V orburger SA and Hunt KK 2002)。
另外腺病毒载体系统中pAdEasy系统操作比较简单(Luo JY et al. 2007)。
本章克隆SOCS2基因，采用pAdEasy系统构建pAd-SOCS2载体，为SOCS2在脂肪细胞中高效表达，研究SOCS2对GH调控脂肪细胞分化与脂质代谢的影响奠定基础。
4.1材料4.1.1 样品、菌株、质粒及细胞株脂肪组织取自6周龄昆白小鼠，小鼠购自第四军医大；E.coli DH5α菌株由本实验室保存；pAdTrack-CMV和pAdEasy-1质粒，E.coli BJ5183菌株由猪脂肪沉积与肌肉发育实验室赠送；人胚肾细胞株HEK293购于中国科学研究院上海细胞资源中心。
4.1.2 主要试剂限制性内切酶BglⅡ、XhoⅠ和蛋白Marker购自Fermentas公司；内切酶PmeI和PacI购自NEB公司；pMD TM18-T克隆载体、碱性磷酸酶CIPA购自Takara公司；穿梭质粒小提试剂盒购自Omega公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购自Bioflux公司；λ/Hin dIII Marker购自天根公司；OptiMem优化培养液购自Gibico公司；脂质体Lipofectamine TM 2000购自Invitrogen公司。
载体测序和引物合成均由南京金斯瑞生物公司完成，其余材料和试剂来源同3.1。
4.2 试验方法4.2.1 SOCS2基因克隆4.2.1.1组织中总RNA提取根据Takara RNAiso Plus试剂说明提取组织中总RNA：4.2.1.2 cDNA第一链合成同3.2.6提取的总RNA反转录为总cDNA，表3-1为反应体系和操作流程：表3-1 cDNA第一链合成体系及操作过程Table 3-1 RevertAid TM First Strand cDNA Sythesis system and operation protocol反转录合成cDNA第一链总RNA 1.5 μLPrimer：Oligo（dT）18 primer 1 μLDEPC处理水9.5 μL轻微震荡混匀，65℃孵育5min，冰上冷却2min；瞬时离心收集反应液，置于冰上，按顺序加入以下试剂：5×反应缓冲液 4 μLRiboLock TM 核糖核酸酶抑制剂（20 u/μL） 1 μL10 Mm dNTPs混合物 2 μLRevertAid TM M-MuLV反转录酶（200 u/μL） 1 μL瞬时离心收集反应液，25℃孵育5min，42℃孵育60min；70℃ 5min终止反应，反应产物直接用于PCR或-20℃存放备用。
4.2.1.3 SOCS2基因编码区（CDS）的扩增依照扩增CDS全长的引物设计原则，根据Genbank公布的SOCS2基因序列(NM_007706.3)，用Primer Premier5.0软件设计SOCS2扩增引物，表4-1中SOCS2-F和SOCS2-R为SOCS2基因的扩增引物。
表4-1 SOCS2 CDS区扩增引物Table 4-1 Primers of SOCS2 CDS sequencePrimer names Primer sequence (5'-3')SOCS2-F：CGTGTTGACTCATCTCCCSOCS2-R CA TAGCTGCATTCGGAGASOCS2-F-BglⅡGCAGATCTATGACCCTGCGGTGCCTGGSOCS2-R-Flag-XhoⅠGCCTCGAGTTACTTATCGTCGTCATCCT TGTAATCTACCTGGAA TTTA TATTCTT4.2.1.4 SOCS2 CDS区的扩增体系和条件用表4-1中的SOCS2-F和SOCS2-R引物，按照表4-2中的扩增体系和条件扩增SOCS2 CDS区。
第四章SOCS2腺病毒载体的构建 3表4-2 SOCS2 CDS区的扩增体系和条件Table4-2 PCR amplification system and10×PCR 缓冲液 1.25 μLdNTP Mixture（各2.5 mM） 2 μL上、下游引物（10μM）各0.5 μLcDNA 1.3 μLddH2O 7.45 μL瞬时离心收集反应液，按一下条件进行反应：预变性（95℃）5min反应一：（20个循环）变性（95℃）40s退货（62℃，每个循环降0.5℃，共20循环）40s延伸（72℃）50s反应二：（20个循环）变性（95℃）40s退火（57℃）40s延伸（72℃）50s反应三：延伸（72℃）8min反应结束后，样品直接用于电泳检测，或暂时存放于4℃，-20℃可存放一周4.2.1.6 SOCS2 CDS区的T载体克隆及鉴定依照Takara pMD TM18-T 克隆载体操作说明，将胶回收的SOCS2CDS全长克隆至pMD TM18-T；A. 克隆反应体系和操作步骤如下表，样品添加及试剂融解均在冰上操作；pMD18-T（50 ng/μL） 1 μL插入的目的片段（0.1-0.3 pmol） 3.5 μLdH2O 0.5 μLSolutionⅠ 5 μLB. 瞬时离心，收集反应液。
16℃孵育过夜(>12 h)；将连接产物10 μL加入到100 μL DH5α感态中，冰浴30 min；C. 42℃热击45s，迅速冰浴1 min，此过程不可激烈晃动PCR管，否则影响转化效率；D. 加入1 mL LB无抗性培养液，37℃、200 rpm震荡培养1 h；E. 室温、4000 rpm离心5 min，收集菌体；吸弃900 μL培养液上清，用枪头吹打100 μL 余液，重悬菌体；F. 无菌条件下，将100 μL菌液均匀的涂于含Amp的LB固体平板，37℃倒置培养；E. 培养约12 h，无菌条件下，挑取单菌落于含Amp的LB液体培养液中，37℃、250 rpm 震荡培养过夜，提取穿梭质粒进行PCR检测；阳性克隆送至金斯瑞公司测序。
4.2.2 DH5α感受态的制备(CaCl2)无菌条件下，将冻存的DH5α划线接种于无抗性的LB固体平板上，37℃倒置、过夜培养，选取生长良好的单克隆接种于100 mL无抗性的LB液体培养液中，于37℃、250 rpm，震荡培养过夜(约16 h)；A.从中吸取1 mL菌液接种于100 mL无抗性的新鲜培养液，37℃、250～300 rpm培养2～3 h，从2 h开始不断对菌液测ODλ=600值，直至0.4≤ODλ=600≤0.6(0.45为最适OD值)；B.以下步骤必须均需无菌冰上操作，0.1M CaCl2和含15～20%甘油的0.1M CaCl2需要预冷处理；C.取30 mL菌液于50 mL离心管，冰上冷却10 min；D.4℃ 4500 rpm离心5 min收集菌体；加3 mL 0.1M CaCl2溶液，枪头轻轻吹打，使菌体悬浮，冰上放置20 min；E. 4℃ 4500 rpm离心5 min，收集菌体；加3 mL含15～20%甘油的0.1M CaCl2，枪头吹打混匀菌体；每100 μL分装一管，-80 ℃冻存。
4.2.3 质粒转化A. -80℃冻存的感受态，冰上融化或室温融化后立即置于冰上；B. 向100 μL感受态中加入连接产物(含量≤50 ng，体积≤10 μL)，摇匀，冰上静止30 min；C. 42 ℃水浴热激90 s，或37℃水浴5 min，热击后迅速置于冰上，静止5 min；操作过程不要有激烈摇动；C.向离心管中加1 mL 无抗性LB培养基，混匀后，37℃ 250 rpm振荡培养1 h，细菌恢复正常生长，抗性基因开始表达；D.将上述菌液4000 rpm离心5 min，弃去1 mL上清，重悬菌体，菌液均匀涂于含相应抗性的LB固体平板，放置30 min后，37℃倒置培养过夜。
4.2.4 质粒的小量提取挑取最新筛选的含有穿梭质粒的单克隆于含有相应抗性的LB培养基中，37℃300 rpm激烈振荡培养12~16 h，获得的新鲜菌液依照Omega E.Z.N.A.质粒小量提取试剂盒的操作说明提取穿梭质粒，所有步骤均在室温下操作。
第四章SOCS2腺病毒载体的构建 54.2.5 重组穿梭穿梭质粒的构建4.2.5.1 SOCS2 CDS区的PCR扩增和回收以pMDTM18-SOCS2穿梭质粒为模板，表4-1中SOCS2-F-BglⅡ和SOCS2-R-Flag-XhoⅠ分别为上游和下游引物，按表4-2中的反应体系和操作步骤扩增SOCS2，所用引物带有所需要的酶切位点(下划线部分)和Flag标签(斜体部分)。
PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行检测，切取含目的片段的胶块，按4.2.5步骤回收PCR产物，微量定量仪测定浓度待用。
4.2.5.2 SOCS2基因和pAdTrack-CMV穿梭质粒的的双酶切及回收以微量定量仪测定的浓度为参照，按下列体系对目的DNA进行BglⅡ和XhoⅠ的双酶切，穿梭质粒酶切体系：10×Buffer 2 μLpAdTrack-CMV(0.5～1 μg/μL) 6 μLBglⅡ0.6 μLXhoⅠ0.6 μLdH2O 10.8 μLSOCS2 PCR产物酶切体系：10×Buffer 2 μLSOCS211 μLBglⅡ 1 μLXhoⅠ 1 μLdH2O 15 μL瞬时离心收集反应液，37℃孵育5 h，产物进行1%琼脂糖电泳，将酶切的获得的目的条带切下，按4.2.5步骤回收双酶切的DNA，测定浓度备用。
4.2.5.3 SOCS2基因与pAdTrack-CMV穿梭质粒片段的连接将双酶切后回收产物的质量浓度计算转化为摩尔浓度，目的DNA和穿梭穿梭质粒DNA以10:1的摩尔比混合，T4连接酶连接，连接体系如下：10×Buffer 2.5 μLSOCS2 CDS(约0.3 pmol) 5.5 μLCMV(约0.03 pmol) 0.7 μLT4连接酶(350U/μL) 1 μLdH2O 15.3 μL瞬时离心收集反应液，16℃孵育过夜，取10 μL连接产物按4.2.3步骤将重组穿梭穿梭质粒转化DH5α感受态，于含Kan(100 μg/mL)的固体LB平板，37℃倒置培养过夜。