苦丁茶有效成分的分离纯化、结构鉴定及生物活性评价

苦丁茶有效成分的分离纯化、结构鉴定及生物活性评价

苦丁茶是冬青科植物大叶冬青的叶,主要分布在华南地区和西南地区等地,

是中国一种传统的纯天然保健饮料佳品。苦丁茶中含有苦丁皂甙、多酚类、黄酮类、咖啡碱、三萜类等多种成分。

其成品茶清香有苦味、而后甘凉,具有清热消暑、降压减肥、抑癌防癌、抗衰老、活血脉等多种功效。近年来,国内外对苦丁茶化学成分研究日益增多,主要集中在加工成品茶和茶饮料等营养保健方面,但对苦丁茶的功能性成分的研究还有待进一步深入探讨,以促进苦丁茶资源的开发和利用。

本论文通过现代色谱及波谱技术分离和鉴定了苦丁茶中的小分子化合物；阐明了一种三萜类化合物对人乳腺癌细胞抑制增殖作用、诱导凋亡作用的作用机制；探讨了大孔吸附树脂对苦丁茶多酚类物质的吸附动力学与热力学；研究了苦丁茶多酚的抗炎作用机制；探索了苦丁茶多糖的提取纯化、理化性质、结构分析以及免疫活性评价。(1)采用优选的提取和色谱方法,运用高效液相色谱(HPLC)对10

批苦丁茶原材料建立指纹图谱,利用“中药指纹图谱相似度评价系统”软件对10批样品的相似度进行评价,建立苦丁茶指纹图谱的共有模式,测得各批次样品与

共有模式的相似度,结果表明各批次中共有峰的相对保留时间基本一致,RSD均

小于1%,相似度均大于0.9,符合中药指纹图谱的技术要求,所建立的共有模式能较好的反映出苦丁茶化学成分质与量的分布情况。

(2)采用乙醇加热回流提取的方法提取苦丁茶中的有效成分,有机溶剂分级

萃取后得到石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相四个极性部位。活性评价结果表明,苦丁茶乙酸乙酯部位不仅具有卓越的抗氧化活性和良好的抗补体活性,

还具有显著的抑制人乳腺癌细胞增殖活性,说明苦丁茶乙醇粗提物经过分级萃取

后,活性物质相对较多地集中在乙酸乙酯相。

利用柱色谱等分离纯化手段对乙酸乙酯相进行系统全面的分离纯化,得到

13个单体化合物。借助核磁共振和质谱等波谱学手段鉴定了化合物的结构,分别为：咖啡酸乙酯、β-谷甾醇、熊果酸、绿原酸、β-胡萝卜苷、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、杨梅苷、19-羟基熊果酸(Pomdid acid)、EGCG、3,4-0-二咖啡酰基奎宁酸甲酯、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸甲酯。

其中,3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸甲酯和3,4-O-二咖啡酰基奎宁酸甲酯为首

次从苦丁茶中分离得到。(3)通过MTT实验,研究了从苦丁茶乙酸乙酯极性部位中分离纯化得到的单体化合物对2种肿瘤细胞和2种正常细胞增殖能力的影响,结果表明Pomdid acid对MCF-7细胞的抑制作用尤为明显,表现出较强的细胞选择性。

经流式细胞术检测分析,Pomdid acid抑制MCF-7细胞增殖是通过诱导细胞凋亡和G2/M期细胞周期阻滞实现的。通过对细胞内ROS水平检测、JC-1染色检测、实时荧光定量PCR和western印迹技术,研究了Pomdid acid对MCF-7细胞的抑制增殖、诱导凋亡作用的作用机制。

结果表明：Pomdid acid通过提高细胞内ROS的含量,打破了细胞内氧的代谢平衡,降低MCF-7细胞内线粒体跨膜电位并造成线粒体功能紊乱,上调Bc1-2、CDK4、Cyclin D1基因和下调p53基因的mRNA表达,下调促细胞增殖蛋白p-ERK、p-p65的表达和上调促凋亡蛋白p-JNK、p-p38、p-p53的表达等途径来诱导MCF-7细胞的凋亡(4)研究并优化了苦丁茶多酚提取的最佳工艺。全面评价了苦丁茶多酚的抗氧化能力(清除DPPH自由基、清除ABTS+自由基、总抗氧化能力、总还原力),实验结果表明苦丁茶多酚具有卓越的抗氧化活性。

通过对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶两种与消化相关的酶的抑制作用来评价苦丁茶多酚的酶活性抑制,初步研究发现苦丁茶多酚的酶活性抑制良好。研究了AB-8和HP-20大孔吸附树脂对苦丁茶多酚类物质的静态吸附动力学及热力学；通过研究两种树脂对苦丁茶多酚的吸附量与温度的关系,发现AB-8和HP-20吸附苦丁茶多酚的最佳温度分别是35℃和30℃(5)研究了苦丁茶多酚的抗炎作用及作用机制,实验结果表明苦丁茶多酚可能是通过抑制LPS诱导的巨噬细胞

RAW264.7分泌NO、TNF-α、IL-6、IL-2β,抑制细胞内TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS、COX-2 mRNA的表达,抑制MAPKs信号通路和NF-κB信号通路,调控炎症因子产生,从而起到抗炎作用。

(6)研究并优化了苦丁茶多糖的最佳提取工艺条件。利用DEAE-52纤维素离子交换柱层析对苦丁茶粗多糖进行分级纯化和富集,得到三种纯化多糖,研究了纯化多糖的理化性质并对其结构进行初步表征。

免疫活性研究结果表明,苦丁茶多糖可能是通过上调巨噬细胞内TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS mRNA的表达,抑制NF-κB信号通路中p-p65蛋白的正常表达、上调MAPKs信号通路中p-ERK、p-JNK、p-p38蛋白的表达,进而促进NO、TNF-α、 IL-6等免疫活性因子的分泌,以活化巨噬细胞参与进行复杂的机体免疫活动,从而起到免疫的作用。