分子生物学实验技术.

pUC18载体的双酶切及阳性克隆检测

（崔嘉20162140284河北农业大学动物科技学院071000）

摘要：为了探究Xbc基因的分子结构特征，本实验选择大肠杆菌质粒做为载体，通过PCR 技术获得目的基因，再将其与质粒进行双酶切后体外连接，再将连接重组后的重组体转入大肠杆菌感受体细胞中进行扩增，最后，通过对重组克隆基因双酶切结果进行筛选，成功获得目的基因。

关键字：Xbc基因大肠杆菌质粒PCR目的基因

The recombination and selection of the Cystatin gene in e.coli

Abstract：To explore the molecular structure of the Xbc gene characteristics,This study choose escherichia coli plasmid as carrier.Getting the purpose gene by PCR technique.With the plasmid in vitro after double enzyme connection,we will connect restructuring of recombinant into amplification of competent escherichia coli cells.By the result of the recombinant gene cloning double enzyme screening,we will get successful gene.

Keyword：Xbc gene,escherichia coli,plasmid,PCR,target genePCR,

引言：聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。由1983年美国Mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。到如今2013年，PCR已发展到第三代技术。1973年，台籍科学家钱嘉韵，发现了稳定的Taq DNA聚合酶，为PCR技术发展也做出了基础性贡献。

PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。

1950年以来在纸上和在聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶上区带电泳的应用，1960年以后，圆盘和顶替电泳（等速电泳）以及等电点聚焦又提供了许多提高分辨率的方法[1]。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷在电场中向正极移动。由于糖－磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA 几乎具有等量的净电荷，因此他们能以相同的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。如质粒有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalently closed circμLar DNA，简称CCCDNA)；开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA1条链断裂，（open circμLar DNA，简称OCDNA）；线状质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA2条链发生断裂，（linear DNA，简称L DNA）。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，

其次为线状DNA和开环质粒DNA。根据在电泳室中使用的电解质系统，可以把电泳作如下分类：①自由界面电泳②自由溶液中的区带电泳③在不同支持物上的区带电泳④在有机溶剂中的凝胶电泳⑤亲和电泳⑥等速电泳⑦等点聚焦⑧免疫电泳。也可按照不用支持体和用支持体来区别电泳技术，分为自由电泳（无支持体）及区带电泳（有支持体）两大类。毛细管电泳是上世纪80年代后期分析化学，特别是生物分析化学的重大研究进展，也是90年代最有影响的分离手段之一[2]。

载体是携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的媒介,没有载体,目的基因无法进入受体,即使进入受体细胞也无法表达[3]。从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞：分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠(SDS)和Triton X-100可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS 或Triton X-100处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。

碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互缠绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那木迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

质粒DNA小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA十分有用。这些方法共同特点是简便、快速，能同时处理大量试样，所得DNA有一定纯度，可满足限制酶切割、电泳分析的需要。

限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。绝大多数限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列。限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同，各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为37℃)。对质粒DNA酶切反应而言，限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA加1单位酶，消化1-2小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反应时间也要适当延长。

酶活力通常用酶单位（U）表示，酶单位的定义是：在最适反应条件下，1小时完全降解1mg λDNA的酶量为一个单位，但是许多实验制备的DNA不象λDNA那样易于降解，需适当增加酶的使用量。反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。

DNA重组技术是用内切酶分别将载体和外源DNA切开，经分离纯化后，用连接酶将其连接，构成新的DNA分子。

转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。