水稻愈伤组织培养

水稻愈伤组织的诱导

李希

北京科技大学化学与生物工程学院生物科学与技术系，北京，100083

摘要：以水稻种子为外植体，研究了外植体的消毒方法和接种技术，了解了水稻愈伤组织诱导的过程。结果表明水稻种子接种在诱导培养基上两天已产生愈伤组织发芽2mm，四天愈伤组织呈现浅黄色发芽5-10mm，6天愈伤组织颜色加深发芽1-2cm，8天愈伤组织为橙黄色发芽2-3cm，无杂菌污染。关键词：水稻种子外植体诱导愈伤组织

引言

自Niizeki和Oono1968年首次获得水稻花粉植株以来，水稻组织培养取得了很大的进展，如各种水稻品种愈伤组织的诱导、继代、植株再生培养基的筛选，遗传特性，基因工程转化体系的建立等等。水稻种子愈伤组织的诱导是这些研究的基础，因此掌握外植体的消毒方法和接种技术，了解了水稻愈伤组织诱导的过程至关重要。以植物器官、组织、细胞等作外植体进行离体培养时，在一定的诱导培养条件下都能诱导形成愈伤组织。外植体源自自然环境均为带菌状态，在接种前都必须进行消毒。对于难消毒的材料，有时要几种消毒剂配合使用。本次试验使用的诱导剂为2,4-D，诱导率为100%。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验材料

水稻成熟种子（用于诱导愈伤组织）；

1.1.2仪器设备及用具

超净工作台培养室、培养皿：￠9cm×2枪形镊量筒：100mL×2三角瓶：50mL×2(无菌)；废液缸；保鲜膜；标签纸

1.1.3试剂及培养基

试剂：75%酒精，2%NaCLO，无菌水(每组1瓶400mL)

培养基：诱导培养基：MS+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L（pH5.8）

1.2 实验方法

1.2.1 MS固体培养基配制：

由于实验室中的MS培养基已含有蔗糖和琼脂，所以直接按照41.5g/L的浓度配置。实验中配置50ml培养基，需依次加入2.075gMS，0.1mg2,4-D；

用NaOH或HCl调节PH=5.8；

高压蒸汽锅121℃灭菌20min。

1.2.2接种室、培养基及用具表面消毒

用75%酒精棉球试擦超净工作、镊子，将培养基及用具放工作台，打开紫外灯，20分钟以表面消毒。之后关紫外灯，打开工作台风机，通风30分钟后可进行无菌操作。

1.2.3种子去壳

选取饱满、无霉变成熟水稻种子，用手工脱去谷壳（注意保持胚完整），准备20粒去壳种子，并按照分组放到三角瓶中。

1.2.4操作者双手的清洗与消毒

坐在超净台前位子上后，用含75%酒精的酒精喷壶喷洒双手对双手进行消毒，在超净台风口待

双手酒精风干后进入超净工作台。超净台面的75%酒精棉球表面消毒。

1.2.5 外植体消毒

将脱谷壳米粒转到一50mL 无菌三角瓶→加适量无菌水洗一次（以没过种子为准，下同）→弃水，倒入75%酒精适量，摇动搅拌，放置30秒（过程中适当轻摇动混匀）→弃酒精→加适量无菌水洗一次→弃水→倒入适量2% NaCLO ，不时摇动搅拌，共处理30分钟→弃NaCLO →用无菌水洗3次，每次停留1分钟→倒去无菌水，将种子从三角瓶转到带无菌滤纸的无菌培养皿中吸干。

1.2.6 接种与观察

将吸干的消毒种子用无菌的镊子接入培养基并均匀放置，每皿接10粒。接种完成后，将培养皿盖上并用保鲜膜封口，然后将接种有材料的培养皿移出超净台，贴上标签写明日期、接种人，放入培养室进行30℃暗培养。注意每隔2-3天前来观察一次实验现象，1周后调查计算污染率，14天后调查计算愈伤组织诱导率。

2 结果

由上图可以看出水稻种子接种在诱导培养基上两天已产生愈伤组织发芽2mm ，四天愈伤组织呈现浅黄色发芽5-10mm ，6天愈伤组织颜色加深发芽1-2cm ，8天愈伤组织为橙黄色发芽2-3cm ，所有种子无杂菌污染，诱导率100%。

3 讨论

本次试验成功诱导出水稻愈伤组织，且无杂菌污染，诱导率为100%,源于我们严格的无菌操作和对2,4-D 浓度的准确把握。

2,4-D 是具有代表性的合成植物生长素，适当的浓度可以促进植物生长和诱导愈伤组织的行成，2,4-D 有毒，使用时应小心谨慎，做好防护措施。 污染率(%)= ×100% 污染的种子数 ×100%

形成愈伤组织的种子数

污染率(%)=

×100% 0 ×100%

10 10 诱导率 (%)=

10 接种的总种子数 诱导率 (%)=

接种的总种子数 = 0

=100