黄曲霉素M1试剂盒说明书1

Bioxl Diagnostic Systems,Inc

2814,Brigadoon Dr.#21 1、 概述 黄曲霉素是霉菌的产物，高毒性并致癌。黄曲霉素M 1不是微生物而是在动物体中由黄曲霉素B 1转化形成的。当奶牛食用有黄曲霉素B 1污染的饲料后，通过消化和分泌，黄曲霉素就会转化为羟基化的黄曲霉素M 1，绝大部分分泌到乳汁中。因此，黄曲霉素M 1浓度反映了饲料中黄曲霉素B 1的含量。欧盟对奶中的黄曲霉素M 1限量是0.05ppb （50ppt ）。 用竞争酶联免疫分析法检测生物样本中的黄曲霉素M 1。所有酶联免疫分析的试剂包括标准品都由试剂盒提供。 检测数量：96孔（含标准品孔） 检测时间：20分钟 2、 原理 分析在包被有黄曲霉素M 1抗体的聚苯乙烯微孔中进行。黄曲霉素M 1标准溶液和样品加入微孔，在温浴过程中，游离的黄曲霉素M 1分子与抗体结合，没有结合的物质在清洗步骤中被清洗，第二次温浴时已经加入HRP-黄曲霉素M 1酶标物，它将没有结合的抗体位点全部覆盖。通过加入基底物质可以确定酶活性，第三次温浴时酶将无色的显色剂转变成一种蓝色，加入终止液使蓝色变成黄色，用酶标仪在450nm 测定吸光度，通过颜色深浅不同换算成黄曲霉素M 1的浓度值。 3、 应用范围 黄曲霉素M 1ELISA 试剂盒用于定量检测牛奶和奶酪中的黄曲霉素M 1。 4、 提供的试剂 1、微孔板：96孔（12×8，可拆卸） 2、酶标物：冻干粉一瓶 3、酶标物稀释液：13ml 一瓶 4、样品稀释液：一瓶（使用时加入40mL 双蒸水充分溶解后使用） 5、清洗液（10×）：50ml 一瓶 6、显色剂：13ml 一瓶 7、终止液：13ml 一瓶 8、黄曲霉素M 1标准品溶液：6×1ml/瓶（0ng/mL ，0.005ng/mL ，0.03ng/mL ，0.15ng/mL ，0.5ng/mL ， 2ng/mL ）

5、 试剂盒未提供的材料 1、10-1000 ul 不同规格的微量移液器 2、50-300ul 多道移液器 3、酶标仪（有450nm 滤光片） 4、离心机（如果离心速度低最好使用低温离心机） 5、带盖试管

6、涡旋振荡器

7、正己烷

8、二氯甲烷

9、离心管 10、去离子蒸馏水 6、 试剂贮存 1、试剂盒贮存在2～8℃，切勿冰冻 2、未用完的微孔板反应该密封干燥2～8℃保存 7、 注意事项

1、终止液具有刺激性，显色剂具有毒性，切勿接触皮肤

2、试剂盒过期后不得使用

3、请勿混用不同批号的试剂 8、 工作溶液准备 1、酶标物工作液：使用时精确加入12mL 酶标物溶解液充分溶解，使用前恢复至室温，并且摇匀，切勿涡旋振荡。 2、样品稀释液工作液：使用时加入40ml 双蒸水充分溶解后使用。 3、清洗液：用蒸馏水1:10稀释（1＋9）。注意：如有结晶请在室温下摇动彻底溶解

4、显色剂：已备用，请避免光线直照

5、终止液：已备用

6、黄曲霉毒素M1标准品：已备用 9、 样品处理 一、牛奶

1、样品冷藏，2～8℃下3000g 离心10分钟

2、分离奶脂和奶清

3、奶清直接检测（稀释倍数：1倍） 二、奶粉 1、称取奶粉1g 加10ml 蒸馏水

2、振荡使奶粉彻底溶化后取50ul 用于检测

3、稀释倍数：10

黄曲霉素M 1 ELISA 检测试剂盒

Bioxl Diagnostic Systems,Inc 2814,Brigadoon Dr.#21 三、奶酪

1、不要另加液体捣碎样本

2、称取2g 碎奶酪放入带盖试管

3、加入15ml 二氯甲烷振摇抽提30分钟

4、过滤上清液

5、转移3.75ml 抽提液到另一试管，60℃下氮气吹干

6、用750ul 样品稀释液重新溶解并涡旋混匀1分钟

7、加入750ul 正己烷，涡旋抽提1分钟

8、2000g 离心15分钟

9、移去上层正己烷

10、取50ul 甲醇/ acqueous 相，用200ul 样品稀释液

在小试管中稀释后混匀取50ul 用于检测 稀释倍数：2 10、 检测步骤 一、实验须知

1、使用前用2小时左右时间让试剂恢复到室温

2、用后立即将试剂放回2～8℃

3、不要改变分析步骤，尤其：

- 微孔板在20～25℃下恢复到室温 - 务必使用精确的微量进样器和枪头 - 一旦开始就不要中断所有步骤

- ELISA 结果的可重复性极大程度的取决于洗板操作，请严格按照要求操作

4、为避免交叉污染，每个标准品和样品均应使用不同的枪头加样

5、加样时请勿让枪头接触微孔中的溶液或内表面 二、分析步骤

1、做好记录，标记B 0，标准和样本的位置，请确保重复双孔检测

2、从反应板上取出所需要的数量微孔，将多余的重新放回2～8℃保存

3、将酶标物（冻干粉）、清洗液（10X ）配制成工作液 - 在B 0孔中加入50μL 已稀释的样品稀释液 - 在各标准孔中加入50μL 的标准品溶液 - 在各样品孔中加入50μL 样品溶液

4、所有微孔加100ul 酶标物工作液（强烈要求使用多道移液器）

5、轻轻晃动反应板几秒钟

6、室温（20－25℃）温浴10分钟，温浴期间振荡混匀3－4次 三、清洗步骤

- 倾倒微孔中的液体

- 在所有微孔中加满洗涤液（250～300μL ） - 重复上述两步骤3遍以上

-

在吸水纸上拍打，彻底清除微孔中的残留液和气泡（拍打后未被清除的气泡可用吸耳球吹去） 拍干后立即进行下一步骤，切勿让微孔干燥 四、显色步骤

1、用多通道微量移液器在所有微孔中加入100ul 显色剂（强烈推荐使用多道移液器），振摇混匀几秒钟，使之彻底混匀。

2、室温显色10分钟

3、加入100ul 终止液（强烈推荐使用多道移液器），混匀。

4、450nm 测定吸光度。10分钟内读取结果最佳，30分钟内有效 11、结果计算

根据下列公式进行结合率的计算

12、 特异性

物质 交叉反应

黄曲霉素M 1

100 % 黄曲霉素 M 2

3 % 黄曲霉素 B 1

2.8 % 黄曲霉素 B 2

<0.1 % 黄曲霉素 G 1

<0.1 % 黄曲霉素 G 2 <0.1 % 13、 试剂盒参数

本试剂盒灵敏度IC50值：0.03~0.06ng/ml 。 B 0吸光度最佳值应大于0.8。

试剂盒吸光度板内误差小于7％，板间误差小于10％。 不同奶样最低检测限：0.08ug/kg 奶羊回收率大于80% 14、 标准曲线模式

试剂盒提供的标准线范围为0.005-2ppb