培养基的制备技术.

培养基的制备技术

1、制备培养基的准备工作

(1)仪器用具的准备

烧杯、玻棒、台称、吸管、玻璃漏斗、试管、三角瓶、电炉、高压蒸汽灭菌锅、培养皿、铝锅、恒温箱、干燥箱、无菌室等都是制作培养基不可缺少的仪器用具，事先必须准备齐全。

(2)玻璃器皿的清洗

玻璃器皿的清洁度，直接影响到实验结果是否准确。因此，要求所用的玻璃器皿必须洗涤后才能使用。洗涤的方法及所用洗涤剂因目的不同而异。

一般新玻璃器皿可用2%盐酸浸泡1～2小时，再用水冲洗干净；一般玻璃器皿（如试管、三角瓶、培养皿等）先用毛刷及洗衣粉去污垢、无机盐等物质，然后再用水冲洗干净；少数实验室要求清洁度较高的器皿，可先放在洗液中浸泡数十分钟，在用自来水冲洗，最后用蒸馏水洗2～3次，以水在器壁上均匀分布成一薄层而不出现水珠时，为油垢除尽的标志；玻璃器皿用过之后，在未干之前应立即洗涤；带菌的玻璃器皿，应先经高压蒸汽灭菌后再洗涤。培养皿经洗刷晾干后，配成套，5～10套为一包，用旧报纸包扎，干热灭菌后备用。

2、培养基制备的过程

配料→溶解→校正PH值→加琼脂融化→过滤→分装→加棉塞，包扎→灭菌

(1)用具的选择

制备培养基首先要选择合适的用具，不能用铜铁器皿，以免铜锈、铁锈混进培养基中。一般可用搪瓷缸或铝锅等。

(2)配料溶解

容器中先盛所需量的水（按需要可为蒸馏水或自来水），然后按照培养基的配方，准确称取各种原料，依次加入，使之溶解。一些不易称量的成分，如牛肉膏比较粘稠，可先称好一根玻棒和烧杯，再用玻棒取牛肉膏放在烧杯中一起称。有些需要量甚微的药品，可先配成定量比的稀释液，再从中定量取出需要的量。

(3)调节pH值

除培养基配方为自然pH值，配制时不用调节pH值外，其它皆需按要求调节pH 值。调节pH值必须待加入水中的物质全部溶解并冷却至室温时才可进行。调节前先用

精密pH试纸测定所配得溶液的pH值，然后根据配方所要求的pH值确定加碱还是加酸来调节pH值。所用酸一般为1mol/LHCl溶液，碱为1mol/LNaOH溶液。调节时要小心，逐滴加碱或酸，且要边加边搅，防止局部过酸或过碱而破坏培养基的营养价值，尽量不要调过头。

(4)固体培养基制备

如需配成固体培养基，应将适量琼脂投入所配的溶液中，加热使其全部融化。琼脂完全融化后，要加热水补足所蒸发的水分。

(5)过滤

可用二层纱布中间加脱脂棉趁热过滤，如气温低容易凝固可用保温漏斗。

(6)分装

趁热用玻璃漏斗或保温漏斗将培养基按需要分装于试管或三角瓶内。管口或瓶口不能粘附培养基，以免引起污染。

装入试管的培养基的量一般为试管高度的1/5～1/4，装入三角瓶内的培养基的量一般为瓶容量的1/3。

(7)加棉塞，包扎，灭菌

为了避免试管和三角瓶中的培养基被污染，又能使培养的微生物获得必要的氧气，因此管口和瓶口要用棉花塞加封。棉花塞的大小要合适，既能塞牢，又能拔出。

棉花塞塞好后，外包一层油纸（以防止灭菌时冷凝水湿润棉花塞），用棉绳扎牢，即可进行灭菌。灭菌后，斜面培养基趁热摆成斜面。冷凝后无菌存放，备用。

(8)无菌检查

将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24～48小时，或放入28℃的温室中培养5～7天，以检查灭菌是否彻底。

3、常用培养基配方

1)牛肉膏蛋白胨培养基(MPA)

牛肉膏5克蛋白胨10克NaCl 5克琼脂20克蒸馏水1000mL pH 7.4～7.6

2)马铃薯葡萄糖培养基(PDA)

马铃薯200克葡萄糖20克琼脂20克蒸馏水1000mL pH4.0～6.0

3)麦芽汁培养基(MDA)

麦芽汁(10°Bx)1000mL 葡萄糖20克琼脂20克4)察氏培养基

NaNO

3 3克 KCl 0.5克 K

2

HPO

4

1克 FeSO

4

0.01克MgSO

4

5克蔗糖 30

克蒸馏水1000mL pH 6.7

5)豆芽汁培养基(BSA)

黄豆芽100克蔗糖50克琼脂20克蒸馏水1000mL pH4.0～6.0

（二）消毒、灭菌技术

1、加热灭菌

(1)干热灭菌法

1)火焰灭菌法直接利用火焰把微生物灼烧死。此法灭菌可靠，简便迅速，适用于接种环、接种针、玻璃棒、镊子、解剖刀等用具的灭菌。在接种过程中，试管口、三角瓶口也都用火焰作短暂灼烧而达到灭菌的目的。

2)干热空气灭菌法在干燥箱内，通过加热使箱内空气温度上升，而达到灭菌的目的。具体操作方法是：首先将包扎好的器皿放入干燥箱内，使其勿与箱壁接触，并保持箱内空气流通；然后接通电源加热，使温度升至160～170℃，恒温维持2～3小时；再切断电源停止加热，当箱内温度降至60℃以下时，方可打开箱门，取出被灭菌的物品。此法只适用于玻璃仪器及金属用具。

(2)湿热灭菌法

湿热灭菌法是用煮沸或饱和水蒸气等湿热进行灭菌，此法适用于一切含水物品。实验室常用高压蒸汽灭菌法灭菌。

高压蒸汽灭菌锅的使用方法：首先，在灭菌锅内加入适量的水，然后把欲灭菌的物品放入，盖上内盖，再对称拧紧外盖上的螺栓；打开锅盖上的放气阀，开始加热；锅内产生蒸汽后，放气阀即有蒸汽排出，约3～5分钟后，待冷湿空气排尽，再关闭放气阀；待压力升到0.1兆帕（121℃）时，维持此压20～30分钟；停止加热，自然冷却，待压力降为零后，打开放气阀，排出残留蒸汽；打开锅盖，取出灭菌的物品，无菌放好。

2、过滤除菌

不适于加热灭菌的物质，可以采用过滤法除菌。过滤除菌就是利用特别的细菌过滤器，以及活性炭、超细纤维等，将液体或空气中的细菌滤掉。一般以细菌过滤器为常用。

3、化学药剂消毒与灭菌