生物工程与下游技术知识点整理

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第十三章β内酰胺类抗生素

1、（掌握青霉素的性质并分析流程，会设计提取分离纯化的流程）

青霉素的理化性质

（1）酸碱性：有一个酸性基团；解离常数pK值为 2.7；

（2）溶解度：青霉素是有机酸，易溶于醇，酸，醚，酯；氯仿是多种青霉素游离酸的很好溶剂；在水中溶解度很小，迅速丧失抗菌能力；

青霉素的金属盐易溶于水；易溶于低级醇；略溶于乙醇，丁醇，酮类，醋酸乙酯；

含有少量水分时，溶解度大大增加；不溶于乙醚，氯仿，醋酸戊酯；

青霉素的分离纯化工艺（工业钾盐生产工艺流程）课本277页

发酵液，冷到10℃下，

1/3体积中性过滤，板框压滤或鼓式过滤，

10％硫酸调pH5，加PPB溶液（十五烷基溴化吡啶，絮凝剂），板框过滤或鼓式过滤，冲水量20－30％；滤洗液；

加1/3BA（醋酸丁酯），加PPB，10％硫酸调pH2－2.5，逆流萃取；得一次丁酯萃取液；

加0.3％活性炭搅拌10min，压滤，

－10℃冷冻脱水，水分在0.9%以下，过滤得BA清液；

加温到15℃，加醋酸钾－乙醇溶液适当搅拌，结晶后静置1h以下，甩滤，得湿晶体；

湿晶体放洗涤罐，丁醇（4－6L/10亿）洗涤，乙酸乙酯（2L/10亿）顶洗，挖出粉子真空干燥；得青霉素G钾盐成品；

2、头孢菌素C

（1）头孢菌素C性质：为两性化合物，C为氨基酸，水溶性很大，稳定性差；

大孔网状吸附剂从发酵液中初步分离头C，离子交换法纯化，络盐沉淀法结晶；

（2）分离纯化工艺流程

头C发酵液，硫酸酸化，板框过滤，得头C滤液；

大孔网状吸附剂吸附，得饱和树脂；丙酮水溶液解吸，得一次头C解吸液；

阴离子树脂吸附，醋酸钠解吸；

加醋酸锌，得头C锌络盐结晶；板框过滤，得头C锌盐湿品；

气流干燥，得头C锌盐成品；

（3）头C分离纯化工艺要点

A、发酵液预处理

发酵液冷到15℃以下，硫酸酸化到pH2.5－3，放置一段时间；板框或真空鼓式过滤机过滤，并用水顶洗滤渣；收集，合并滤液，洗液，低温10℃保存；

B、大孔网状吸附剂的吸附和解吸

头C最适吸附pH2.5－3，XAD4的吸附容量为15－20g/L；

2－4倍体积去离子水洗涤，除去硫酸根等阴离子，以免干扰离子交换树脂的纯化；

15－25％乙醇，丙酮，或异丙醇水溶液来解吸。

C、离子交换树脂的纯化

采用弱碱性阴离子交换树脂，树脂用醋酸溶液处理成醋酸型，开始吸附；

去离子水洗涤树脂，1.5－2.5％醋酸钠（钾）水溶液解吸；

D、沉淀结晶

头C可与二价重金属离子铜锌钴铁铅Ni形成难溶性络盐微晶沉淀；锌盐最普遍；

头C锌盐，淡黄色微晶粉末，不溶于水及氯仿，甲醇，乙醇；

离子交换解吸液，放结晶罐中，5℃，加醋酸锌，搅拌溶解，加结晶液体积30％的乙醇或丙酮，析出头C锌盐微晶沉淀；

选择性较差，需在一定浓度下才能析出络盐结晶；只适用于纯化后的头C溶液；

E、膜分离

发酵液通过微孔滤膜MF，除去菌丝，固形物；

超滤UF（除大分子物质），除去分子量10000以上的蛋白质，多糖，深棕色色素，获得色浅的头C滤液；

反渗透膜RO浓缩（除水）

3、克拉维酸的分离纯化

（1）萃取：溶剂萃取法

发酵滤液，盐酸调pH2，3/4体积正丁醇，多级逆流萃取，5℃萃取；

1/20体积水，用20％氢氧化钠水溶液调pH7；液液离心机，水相反抽提液；

浓缩洗脱液，5℃Zerolit FFIP氯型阴离子交换树脂，0－0.35M氯化钠梯度吸脱，合并活性部分，减压浓缩；

Amberlite XAD4树脂脱盐，能吸附克拉维酸，不吸附无机盐；1％正丁醇或无盐水洗脱，混合活性部分，真空浓缩和冷冻干燥；

（2）离子交换：吸附于强碱性阴离子交换树脂上，用含盐水溶液洗脱；

发酵滤液，pH6.2，通过Zerolit FFIP氯型强碱性阴离子交换树脂，冷的1mol/L氯化钠洗脱；浓缩液，pH6，25℃的滤液，通过Amberlite XAD4树脂，用0.1mol/L氯化钠洗涤，5℃无盐水洗脱；

脱盐浓缩液，离子交换色层分离；Zerolit FFIP树脂氯型阴离子交换树脂，0－0.35M氯化钠梯度洗脱，5℃；

浓缩洗脱液，5℃Amberlite XAD4树脂脱盐，混合活性部分，浓缩和冷冻干燥。

第十四章氨基糖苷类抗生素

1、离子交换法分离纯化链霉素（强碱）的工艺

发酵液，1－2倍量水稀释，（高价离子在稀溶液中优先吸附）

草酸酸化，pH2.8-3.2，

加热70－75℃，

板框过滤或固体排出式离心分离，冷到15℃以下；

10%氢氧化钠中和pH6.7－7.2，110－Na型树脂吸附，得饱和树脂，水洗到澄清，5－6％硫酸洗脱；洗脱液；

401树脂吸附，得饱和树脂，先用无盐水挤压，再以8％硫酸单罐循环洗脱3－4次；

得二次洗脱液，1X14H型精制，330－OH型中和；

调pH4.3－5，0.2-3％炭，透光度90％以上；

小于35℃薄膜浓缩，硫酸调pH4.5，加2－3％活性炭，得酸性脱色液；

氢氧化钙调pH5.5-6，加1.5％－2％活性炭到透光度90％以上；

无菌过滤，喷雾干燥进风120－135℃，出风84－85℃；

2、卡那霉素的分离纯化工艺

（1）硫酸卡那霉素：易溶于水，不溶于乙醇(水中加乙醇沉淀)，丙酮，苯，醋酸乙酯；

（2）分离纯化工艺流程

发酵液，盐酸调pH5－5.5，加水稀释，

1X12H型强酸阳离子树脂吸附，搅拌4h，

用稀盐酸，氯化铵洗涤，无盐水洗到无氯离子；

强碱型树脂201X4脱色，2－2.8％氨水洗脱，

硫酸调pH3.2－3.4，乙醇中结晶2h，离心得粗晶；95％及50％乙醇分次洗涤，

无盐水溶解到20万u/ml，调pH7，加1－5％活性炭脱色达滤；精制液，无菌过滤，喷雾干燥，进风116℃出风88℃，得粉针剂原药；

精制液，制成水针剂；

3、庆大霉素的分离纯化工艺

（1）庆大霉素：易溶于水，不溶于乙醇，丙酮，氯仿，乙醚，苯；

（2）分离纯化工艺流程

发酵液，盐酸调pH1.5－2.5，氢氧化钠中和到pH6.8－7.2；

加水稀释；

1x2H型吸附6h；得饱和树脂；

用稀盐酸，氯化铵洗涤，无盐水洗到无氯离子，

4－5％氨水洗脱；

强碱性201x4脱色；浓缩去氨，10％硫酸调pH5，加4％活性炭，40℃脱色；成品浓缩液；无菌过滤进风115℃，出风85℃，得硫酸庆大霉素成品；

第十五章四环类抗生素

（两性物质，沉淀法）

四环类抗生素的分离纯化

沉淀法：四环类抗生素在碱性下能和钙，镁，钡，某些季铵碱形成复合物而沉淀；

一）钙镁

1 四环素：

发酵液调pH9，加氯化钙形成钙盐沉淀；将沉淀以草酸溶解，析出草酸钙；过滤，滤液调pH4.6－4.8；析出四环素粗碱；

粗碱溶于草酸水，活性炭脱色；调pH4，得四环素碱成品；

2金霉素：

发酵液加碳酸钙，氯化镁，调pH7.8形成沉淀；

沉淀用草酸－盐酸调pH1.6－1.7溶解；

加黄血盐（除铁离子），硫酸锌去蛋白；过滤，加4－6％盐酸，升温40℃，金霉素盐酸盐析出；

3土霉素

加0.5-1％溴代十六烷吡啶（季铵碱），调pH9.6-10；沉淀析出；

沉淀用水洗涤，溶于4份体积5％草酸和1份体积浓盐酸；得到的溶液pH1－1.2；活性炭脱色；调pH4－4.5；析出土霉素碱粗品；